生物質(zhì)降解酶生產(chǎn)菌株的育種和應(yīng)用

王方忠，張睿欽，金建玲，夏蕊蕊，肖林，易勇，張繼祥，侯少莉，方詡，5

1.山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100

2.天津大學(xué)生物安全與戰(zhàn)略研究中心，天津 300000

3.山東龍力生物科技股份有限公司，山東省秸稈生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，禹城 251200

4.山東圣琪生物有限公司，濟(jì)寧 273517

5.國家糖工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250100

生物質(zhì)降解酶生產(chǎn)菌株的育種和應(yīng)用

王方忠1，2，張睿欽1，金建玲1，夏蕊蕊3，肖林3，易勇4，張繼祥4，侯少莉1，方詡1，5

1.山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100

2.天津大學(xué)生物安全與戰(zhàn)略研究中心，天津 300000

3.山東龍力生物科技股份有限公司，山東省秸稈生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，禹城 251200

4.山東圣琪生物有限公司，濟(jì)寧 273517

5.國家糖工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250100

方詡，博士，教授，博士生導(dǎo)師。先后入選“985工程”資源生物技術(shù)科技創(chuàng)新平臺(tái)學(xué)術(shù)骨干，教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才，山東省引進(jìn)海外創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才“萬人計(jì)劃”第一層次人選，泰山學(xué)者海外特聘專家。先后獲得國家發(fā)明技術(shù)二等獎(jiǎng)、山東省五四青年獎(jiǎng)?wù)?、生物工程學(xué)報(bào)優(yōu)秀論文獎(jiǎng)、山東省留學(xué)人員回國創(chuàng)業(yè)獎(jiǎng)、中國輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)?，F(xiàn)擔(dān)任中國可再生能源學(xué)會(huì)生物質(zhì)能專業(yè)委員會(huì)第九屆常委，中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)微生物育種分會(huì)理事，《Frontiers in Microbiology》和《Scientific Reports》編委等職。

主要研究領(lǐng)域有微生物生理生化、代謝工程、生物催化等。主持參加國家“973”、“863”、“科技支撐計(jì)劃”等多項(xiàng)課題，發(fā)表相關(guān)領(lǐng)域的SCI論文30篇以上，獲得中國發(fā)明專利授權(quán)13項(xiàng)，美國、歐洲發(fā)明專利授權(quán)各1項(xiàng)，日本發(fā)明專利授權(quán)2項(xiàng)，國際發(fā)明專利1項(xiàng)。被特邀參與編著了2部中文著作以及國際著名SPRINGER出版社出版的1部英文著作，多次被特邀在國際會(huì)議上做大會(huì)報(bào)告。E-mail：fangxu@sdu.edu.cn

雖然中國已經(jīng)成為世界第二大經(jīng)濟(jì)體，但是依然面臨著能源、資源和環(huán)境的挑戰(zhàn)。石油資源面臨枯竭，而且生物乙醇是可再生且碳中性的生物液體燃料，所以從生物質(zhì)提取乙醇一直是中國政府支持的重點(diǎn)。在該工藝中，酶水解獲得可發(fā)酵性糖是關(guān)鍵技術(shù)，而高產(chǎn)纖維素酶的微生物育種是核心，并且直接影響了整個(gè)工藝的生產(chǎn)成本。介紹了產(chǎn)纖維素酶的工業(yè)菌種，工業(yè)菌株的物理誘變、化學(xué)誘變以及基因工程改造，并且介紹了用生物質(zhì)降解酶進(jìn)行生物精煉的兩個(gè)成功案例。

生物乙醇；纖維素酶；微生物育種；酶水解

目前，我國在能源、資源、環(huán)境等方面面臨著越來越嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。一方面，中國的石油對外依存度已經(jīng)突破60%，嚴(yán)重依賴進(jìn)口，直接威脅國家的能源安全和經(jīng)濟(jì)安全；同時(shí)，我國溫室氣體的排放主要是來源于大量礦石燃料的使用。作為世界上最大的碳排放國家之一，2009年11月26日，中國政府承諾“到2020年，中國單位國內(nèi)生產(chǎn)總值CO2排放，比2005年下降40%～45%”。2014年11月26日，中國再次重申減排目標(biāo)。我國調(diào)整能源結(jié)構(gòu)，提高非化石能源的比重是勢在必行的。 由于乙醇、丁醇等生物液體燃料來自于豐富的可再生資源，其利用過程中產(chǎn)生的CO2又會(huì)被植物吸收，形成碳封閉循環(huán)，被國際公認(rèn)為“碳中性燃料”。更有大量的研究表明，燃料乙醇不僅有效地提升發(fā)動(dòng)機(jī)燃料效率，還可以很大程度地改善汽車尾氣的清潔程度。所以，生物液體燃料被公認(rèn)是傳統(tǒng)化石燃料的理想替代物。

同時(shí)，我國作為農(nóng)業(yè)大國，在收獲季節(jié)產(chǎn)生大量的玉米秸稈、麥稈、稻稈等高纖維素含量的生物質(zhì)，但并未得到有效利用，常常就地焚燒，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，成為一大社會(huì)公害。

因此，采用環(huán)境友好的生物法（酶法）將秸稈等生物質(zhì)降解成可發(fā)酵性糖，再通過發(fā)酵制備乙醇、丁醇等生物液體燃料[1-2]，既減少了秸稈焚燒帶來的空氣污染，又減少了汽油造成的尾氣污染，起到了“雙清潔作用”。

1 纖維素酶的主要成分及來源

能降解秸稈的酶通常被稱為“纖維素酶”。早在一百多年前，人類就從蝸牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了纖維素酶。隨后，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)纖維素酶在細(xì)菌、放線菌、真菌、昆蟲、某些無脊椎動(dòng)物等自然界生物體中廣泛存在。但是用于纖維素酶制劑工業(yè)化生產(chǎn)的微生物均屬于絲狀真菌（霉菌）。比較典型的有木霉屬（Trichoderma sp.）、青霉屬（Penicillium sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、根霉屬（Rhizopus sp.）及漆斑霉屬（Myrothecium sp.）等。來源于絲狀真菌制備的纖維素酶具有產(chǎn)生的胞外酶易分離和提取，比活性高且產(chǎn)酶效率好以及產(chǎn)生纖維素酶酶系結(jié)構(gòu)合理等諸多優(yōu)點(diǎn)。絲狀真菌合成的纖維素酶不僅包含了內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶，外切-β-1,4-葡聚糖酶，β-葡萄糖苷酶等纖維素酶主要成分，還包含了木聚糖酶、甘露聚糖酶、木糖苷酶、甘露糖苷酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶等半纖維素酶系以及具有輔助活性的AA9等相關(guān)的酶。在自然界中木質(zhì)纖維素降解過程，常見的酶解機(jī)制是：纖維素的非結(jié)晶區(qū)被內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶作用，纖維素長鏈的糖苷鏈被隨機(jī)切斷，成為不同聚合度的纖維素短鏈，使得纖維素分子的聚合度降低，增加了外切-β-1,4-葡聚糖酶作用的纖維素鏈末端數(shù)；外切-β-1,4-葡聚糖酶水解纖維素結(jié)晶區(qū)，CBH（cellobiohydrolase）Ⅰ或CBHⅡ從纖維素鏈的還原端或非還原端開始持續(xù)水解，生成纖維二糖；纖維二糖和可溶性纖維寡糖被β-葡萄糖苷酶水解，最終將纖維素轉(zhuǎn)化為可利用的單糖——葡萄糖[3]。同時(shí)，由于半纖維素、木質(zhì)素和果膠等物質(zhì)阻遏了內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶和外切-β-1,4-葡聚糖酶的移動(dòng)，因此，降解半纖維素、木質(zhì)素和果膠等物質(zhì)的酶組分也是必要的。

2 高產(chǎn)纖維素酶菌種選育的傳統(tǒng)育種方法

高產(chǎn)纖維素酶工業(yè)菌株的育種對于纖維素酶的生產(chǎn)成本至關(guān)重要，不同的菌株之間的產(chǎn)酶能力往往相差百倍。絲狀真菌中，木霉、青霉屬產(chǎn)生的纖維素酶酶組分最全且活力較高。其中， 里氏木霉（Trichoderma reesei）從最初的研究至今已經(jīng)有65年，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界纖維素乙醇的生產(chǎn)有80%是以里氏木霉為宿主生產(chǎn)的纖維素酶制備而成的，有報(bào)道里氏木霉的最高胞外蛋白產(chǎn)量可達(dá)100g/L以上[4]。里氏木霉已經(jīng)成為了世界上研究和應(yīng)用最廣泛的生產(chǎn)纖維素酶的模式微生物，國內(nèi)外的科學(xué)家和技術(shù)人員采用物理化學(xué)誘變法和基因遺傳改造等手段進(jìn)行了菌種改良，開發(fā)出多種工業(yè)高產(chǎn)菌株，被用于各種用途的纖維素酶商業(yè)酶制劑生產(chǎn)，其中T1菌株是山東大學(xué)方詡課題組經(jīng)過多次誘變獲得的高產(chǎn)菌株，TX是采用基因過程改造提高β-葡萄糖苷酶活力的突變高產(chǎn)菌株（圖1）。1979年，山東大學(xué)曲音波等從山東濟(jì)寧市土壤中篩選出來的野生型菌株114-2，最初被鑒定為斜臥青霉，2013年重新鑒定為草酸青霉（Penicillium oxalicum）[5]。該菌株在國內(nèi)被廣泛研究和應(yīng)用了30年以上，并經(jīng)過多次傳統(tǒng)的物理誘變（紫外）、烷化劑化學(xué)誘變（甲基磺酸乙酯）和亞銨廢液的馴化以及基因的重排等手段，選育出多個(gè)高產(chǎn)工業(yè)菌株（圖2）。

在菌種的選育過程中，常用的物理誘變方法有紫外線誘變、X射線誘變、γ-射線誘變、快中子誘變、激光誘變、微波誘變、離子束誘變等。近年來，清華大學(xué)邢新會(huì)教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)的ARTP常溫誘變育種系統(tǒng)，由于其使用的便捷性，也已被廣泛應(yīng)用[6]?；瘜W(xué)誘變中常用的試劑有烷化劑、天然堿基類似物、氯化鋰、亞硝基化合物、疊氮化物、堿基類似物、抗生素、溴化乙錠（EB）等。甲基磺酸乙酯（EMS）和亞硝基胍（NTG）被證明是最有效的化學(xué)誘變劑。物理和化學(xué)誘變組合的方法可以大大提高菌種的活性[7]。

圖1 世界各國的里氏木霉菌株的選育情況舉例

圖2 草酸青霉菌株的選育

在誘變獲得大量變異菌株的同時(shí)，篩選技術(shù)是獲得高活力菌株的關(guān)鍵。從以往成功的經(jīng)驗(yàn)可以找到一些規(guī)律，在平板上生長菌落直徑小的突變株，往往活力高；在顯微鏡下觀察，菌絲的分叉越多，往往該菌株的纖維素酶酶活強(qiáng)。在纖維素酶突變株篩選過程中，抗降解物阻遏突變株篩選技術(shù)往往被采用。纖維素酶的生產(chǎn)中，纖維素降解后生成的葡萄糖等易代謝利用的降解產(chǎn)物會(huì)引起降解物阻遏效應(yīng)（carbon catabolite repression，CCR），抑制纖維素酶等水解酶的生物合成，是限制纖維素酶產(chǎn)量進(jìn)一步提高的主要因素之一。在纖維素篩選平板中加入易代謝碳源（葡萄糖或甘油等），在此平板上生長的微生物的纖維素酶生產(chǎn)能力被抑制，原本在纖維素篩選平板上能產(chǎn)生透明圈的菌株就喪失了產(chǎn)圈的能力。利用這種平板篩選誘變后的微生物，很容易篩選到能在葡萄糖存在情況下抗CCR阻遏且纖維素酶高產(chǎn)的突變株。例如，里氏木霉NG14突變株就是利用磷酸膨脹纖維素-甘油平板獲得的抗阻遏突變株。山東大學(xué)曲音波等改進(jìn)了該篩選方法，用葡萄糖和脫木素的木粉代替甘油和磷酸膨脹纖維素，制成綜纖維素（holocellulose）雙層平板，直接根據(jù)突變株產(chǎn)生透明圈直徑的大小，在經(jīng)過紫外和NTG復(fù)合誘變后的變異株中，篩選出了兩株具有明顯抗阻遏特性的纖維素酶高產(chǎn)菌株，草酸青霉JN15和JU1[8]。

然而，傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變提高纖維素酶酶活的水平是有限的，基因遺傳改造工程被應(yīng)用到纖維素酶菌種改良領(lǐng)域中。纖維素酶系是多種酶的復(fù)合物，所以優(yōu)化各種酶系組成比例，解除中間產(chǎn)物的反饋抑制作用，是提高纖維素酶酶活的有效措施。最初發(fā)現(xiàn)里氏木霉纖維素酶系缺少β-葡萄糖苷酶，其作用是將纖維二糖水解為葡萄糖，從而解除二糖對內(nèi)切酶和外切酶的反饋抑制作用，提高纖維素酶酶活。馬良等[9]采用里氏木霉cbh1基因的啟動(dòng)子異源表達(dá)來源于草酸青霉的bgl1基因，轉(zhuǎn)化子的濾紙酶活與出發(fā)株相比增加了6～8倍，利用預(yù)處理的玉米秸稈進(jìn)行糖化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)葡萄糖得率提高80%。王方忠等[10]發(fā)現(xiàn)采用木聚糖酶的啟動(dòng)子，能更有效地表達(dá)外源β-葡萄糖苷酶基因，并且不影響胞外蛋白的表達(dá)量。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，木聚糖和甘露聚糖的降解產(chǎn)物木聚寡糖和甘露寡糖對cbh1酶活有很強(qiáng)的抑制作用[11]。作用機(jī)制可能是結(jié)合到cbh1的活性位點(diǎn)，從而抑制纖維素酶活力。然而里氏木霉中半纖維素酶的數(shù)量和活力都相對較低（例如缺少α-木糖苷酶和內(nèi)切阿拉伯糖酶），所以提高半纖維素酶酶活也是很重要的遺傳改造靶點(diǎn)。除了優(yōu)化酶系組成比例外，很多與纖維素酶具有協(xié)同作用的輔助蛋白同樣能提高纖維素酶酶活，例如CIP、SWO1和Expansin等[4]。具有里程碑式的研究結(jié)果就是多糖單加氧酶AA9家族（以前稱為GH61）的發(fā)現(xiàn)和功能的解析，與傳統(tǒng)的纖維素酶水解纖維素不同，AA9通過蛋白活性中心二價(jià)金屬離子氧化斷裂纖維素鏈。AA9與纖維素酶的協(xié)同作用只對I型纖維素有作用，并且需要有其他物質(zhì)如CDH提供還原力。但是對于酸處理的玉米秸稈，不用添加任何還原物質(zhì)，AA9與纖維素酶就能發(fā)揮很好的協(xié)同作用[12]。山東大學(xué)方詡課題組在里氏木霉中表達(dá)不同微生物來源的AA9，以脫木素木糖渣（delignif ed corncob residue，DCCR）和微晶纖維素為底物進(jìn)行糖化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)氨基酸序列不同的AA9和里氏木霉纖維素酶酶系協(xié)同效應(yīng)有所差異，糖化效率的差別很大，有的AA9不僅可以提高葡萄糖得率20%～30%以上，而且和β-葡萄糖苷酶也有很好的協(xié)同作用（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。

3 纖維素酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的遺傳改造

提高絲狀真菌生產(chǎn)纖維素酶的另一個(gè)途徑就是纖維素酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的遺傳改造。大量的實(shí)驗(yàn)證明Xyr1是里氏木霉中促進(jìn)纖維素酶表達(dá)的主要激活因子。缺失Xyr1碳末端140個(gè)氨基酸就會(huì)使得菌體完全喪失生產(chǎn)纖維素酶能力[13]，而在Xyr1中引入一個(gè)點(diǎn)突變，會(huì)極大提高纖維素酶和半纖維素酶酶活，并且不受誘導(dǎo)物限制[14]。Clr2是在粗糙脈孢菌中發(fā)現(xiàn)的纖維素酶主要轉(zhuǎn)錄激活因子。在不含有誘導(dǎo)物存在的條件下，過表達(dá)Clr2的菌體分泌纖維素酶量達(dá)到野生型在誘導(dǎo)條件下的水平[15]。同時(shí)，國內(nèi)外的研究報(bào)道在有葡萄糖存在的條件下，Cre1就會(huì)介導(dǎo)碳代謝阻遏抑制纖維素酶基因的表達(dá)，所以敲除Cre1或者用截短的Cre1替代原有蛋白是提高纖維素酶表達(dá)的重要措施。但是這會(huì)大大抑制菌體生長，使得發(fā)酵過程菌體生物量減少，不利于后續(xù)發(fā)酵放大及最終纖維素酶酶活。山東大學(xué)方詡課題組采用構(gòu)建人工激活元件的方法來解除Cre1介導(dǎo)的碳代謝阻遏，人工激活元件的組成如下：兩個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子（Cre1和Ace1）的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與各種轉(zhuǎn)錄激活因子的效應(yīng)區(qū)（Xyr1、Ace2、Ace3、Clr2）[17]。利用高濃度乳糖進(jìn)行培養(yǎng)，人工激活元件就會(huì)阻斷Cre1介導(dǎo)的碳代謝阻遏，提高纖維素酶酶活并且菌體生長沒有減弱（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。

除此之外，還有很多遺傳改造靶點(diǎn)可以挖掘。例如G蛋白、cAMP和MAPK等信號傳導(dǎo)路徑和感知傳遞誘導(dǎo)物信號的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等[16]。這些尚處于較為基礎(chǔ)的研究階段，如何整合這些信息對整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重組是下一步遺傳改造的重點(diǎn)。

在我國，纖維素酶被應(yīng)用到玉米芯的生物精煉工藝中。玉米穗脫粒后剩余的玉米芯含有半纖維素和纖維素各約40%，是總糖含量最高的非木材木質(zhì)纖維素材料原料之一。其中半纖維素主要組分是木糖，可用于生產(chǎn)木糖、木糖醇、低聚木糖、糠醛、糠醇等高附加值產(chǎn)品，加工過程產(chǎn)生的纖維素殘?jiān)欣w維素含量高達(dá)60%左右，而且這些纖維素殘?jiān)呀?jīng)在上一道加工工序中經(jīng)過了酸和高溫處理等，相當(dāng)于經(jīng)過了纖維素乙醇的預(yù)處理工序，容易被纖維素酶水解成葡萄糖，進(jìn)而發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇[18]（圖3）。劉凱等[19]采用批次補(bǔ)料的工藝路線，利用纖維素酶水解玉米芯發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。通過優(yōu)化批次補(bǔ)料的底物濃度、補(bǔ)料時(shí)機(jī)和次數(shù)，纖維素酶的用量從15U/g底物降低到9.3U/g底物，并且發(fā)酵液中乙醇濃度提高2倍多。

纖維素酶不僅可以處理木質(zhì)纖維素原料，而且還可以應(yīng)用到纖維素含量較高的薯類工業(yè)廢棄物處理。王方忠等[10]研究發(fā)現(xiàn)甘薯渣的主要成分為纖維素和果膠，在高濃度甘薯渣降解過程中，纖維素的吸水膨脹是造成其難被水解的主要原因。纖維素酶在降黏和葡萄糖產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要作用，果膠酶對降黏發(fā)揮著較小的作用，只是在較低纖維素酶濃度條件下，作為輔助蛋白協(xié)助纖維素酶釋放葡萄糖。通過酶的復(fù)配及各個(gè)工藝條件的優(yōu)化，發(fā)酵液中可以產(chǎn)生高達(dá)79g/L濃度的乙醇，同時(shí)每千克甘薯渣（干重）可產(chǎn)約200g乙醇。該工藝（圖4）環(huán)境友好，生產(chǎn)效率高，同時(shí)易于產(chǎn)業(yè)化。

圖3 玉米芯的生物精煉工藝

圖4 甘薯的生物精煉工藝

生物質(zhì)的開發(fā)利用是解決我國能源、資源、環(huán)境等難題的一把鑰匙，纖維素酶作為生物催化劑，是技術(shù)中的核心和關(guān)鍵。纖維素酶不僅能降解秸稈等木質(zhì)纖維素，還可以被應(yīng)用到含有纖維素的生物質(zhì)降解中，所以把它稱之為“生物質(zhì)降解酶”更為貼切?？梢灶A(yù)見，生物質(zhì)降解酶的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用會(huì)越來越廣泛。

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Screening of cellulase hyper-producing strains and their application

WANG Fangzhong1，2，ZHANG Ruiqin1，JIN Jianling1，XIA Ruirui3，XIAO Lin3，YI Yong4，ZHANG Jixiang4，HOU Shaoli1，F(xiàn)ANG Xu1，5

1. State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan 250100, China
2. Center for Biosafety Research and Strategy, Tianjin University, Tianjin 300000, China
3. Longlive Bio-Technology Co., Ltd., Shandong Key Labotory of Straw and Stover Bioref nement Technologies, Yucheng 251200, China
4. Shandong Bio Sunkeen Co., Ltd., Jining 273517, China
5. National Glycoengineering Research Center, Shangdong University, Jinan 250100, China

Although China becomes the world’s second largest economy by nominal GDP, there are many problems, such as energy crisis, resource exhaustion and environmental pollution. Because the depletion of fossil fuels in the future and bioethanol is a renewable and carbon neutral alternative liquid fuel, bioethanol production from biomass was being supported by the Chinese government.Enzymatic hydrolysis for obtaining the fermentable sugar is a key method in bioethanol production process from biomass. Furthermore, screening strains with cellulase hypersecreting ability is a core technology that has a signif cant effect on production cost of biomass bioref nery. In this paper, we introduce the industrial microorganisms producing the cellulolytic enzyme, the physical and chemical mutagens, and genetic reconstruction of the industrial strains. Two successful cases of biomass bioref nery with cellulolytic enzyme are also stated.

bioethanol; cellulase; microbial screening; enzymatic hydrolysis

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.012

山東省自主創(chuàng)新及專項(xiàng)成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（2014CGZH1312），國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863計(jì)劃”（2014AA021903），國家自然科學(xué)基金（31570040），山東大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目-自然科學(xué)專項(xiàng)（交叉學(xué)科培育項(xiàng)目）（2016JC031），中國博士后面上基金（2016M592178）