中國傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味食品微生物功能分析與菌種選育技術(shù)

鄭宇，謝三款，于松峰，張祥龍，吳艷芳，王敏

工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457

中國傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味食品微生物功能分析與菌種選育技術(shù)

鄭宇，謝三款，于松峰，張祥龍，吳艷芳，王敏

工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457

王敏，博士，教授，博士生導(dǎo)師，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院院長。國家萬人計劃領(lǐng)軍人才，科技部中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才，教育部新世紀優(yōu)秀人才，天津市傳統(tǒng)發(fā)酵食品“131”創(chuàng)新型人才團隊負責(zé)人。目前擔(dān)任教育部生物技術(shù)與生物工程類專業(yè)指導(dǎo)委員，全國發(fā)酵工程技術(shù)委員會委員，中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會育種分會副理事長，天津食品學(xué)會常務(wù)理事，天津市微生物學(xué)會理事，《中國糧油學(xué)報》、《食品與發(fā)酵工業(yè)》、《飲料工業(yè)》等學(xué)術(shù)期刊編委。

主要從事發(fā)酵食品生產(chǎn)菌種的功能分析、性能改良與發(fā)酵技術(shù)，微生物細胞催化反應(yīng)與過程調(diào)控等方面研究工作。先后主持科技部、國家自然科學(xué)基金委、教育部、天津市科委等20余項研究課題。已發(fā)表學(xué)術(shù)論文100余篇，授權(quán)或申請發(fā)明專利20余項。傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)工藝現(xiàn)代化技術(shù)提升、生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質(zhì)量控制、果醋發(fā)酵等多項研究成果得到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，榮獲天津市科技進步獎一等獎1項、二等獎3項、三等獎2項。E-mail：minw@tust.edu.cn

我國醬油、食醋、腐乳、豆瓣醬、泡菜等傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味食品具有悠久的釀造歷史和獨特的釀造工藝，多采用開放式的發(fā)酵方式，以谷物、豆類等為原料，在多種微生物的作用下完成原料中淀粉、蛋白、纖維素等大分子物質(zhì)的降解、轉(zhuǎn)化等過程，產(chǎn)生了豐富的有機酸、氨基酸、多糖、醇、酯等代謝產(chǎn)物，賦予傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味食品獨特的風(fēng)味品質(zhì)。主要對傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味食品中主要微生物的種類和功能進行分析，并列舉了優(yōu)良菌種選育的技術(shù)和方向。

傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味食品；微生物功能；微生物代謝；菌種選育

“民以食為天”。在中華民族幾千年的飲食文化中，醬油、食醋、腐乳、面醬、豆醬、豆豉、泡菜等調(diào)味食品扮演著不可或缺的角色，具有廣泛的社會基礎(chǔ)和濃厚的文化情結(jié)，并且他國餐飲文化難以模仿，從而賦予了傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品不可或缺的市場地位和長久的生命周期。我國傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品歷史悠久，文化深厚，具有獨特的釀造工藝，曾影響許多亞洲國家，為中華傳統(tǒng)食品之瑰寶[1]。

醬油、醋是我國生產(chǎn)和消費量最大的釀造調(diào)味食品，其中，釀造醬油主要是以大豆、面粉、麩皮為原料，經(jīng)過制曲、醬醪發(fā)酵和淋油三個主要階段，具有柔和的醬香或酯香，味道鮮美適口[2]。傳統(tǒng)食醋使用各種谷物，如高粱、糯米、大米、大麥、豌豆等為原料，經(jīng)制曲、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、淋醋和陳釀等階段釀制而成，含有豐富的有機酸、氨基酸等物質(zhì)，酸味柔和，口感獨特，并且具有一定的保健功能[3]。腐乳是以大豆為原料，經(jīng)磨漿、制坯、發(fā)酵制成，根據(jù)后期湯料不同，又分為紅腐乳、白腐乳、青腐乳、醬腐乳等[4]。泡菜是以新鮮蔬菜為原料，經(jīng)以乳酸菌為主的微生物發(fā)酵制得的產(chǎn)品[5]。根據(jù)原料，我國傳統(tǒng)發(fā)酵醬制品主要有豆醬、面醬、辣椒醬、蝦醬等，在微生物的作用下，發(fā)酵產(chǎn)生了豐富的風(fēng)味物質(zhì)，是常用的佐餐食品。

1 中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物組成與功能分析

1.1 微生物群落組成

幾千年前，先民用曲釀醋、用鹽水制作泡菜，雖然當(dāng)時并不明白其具體的制作原理，但這些產(chǎn)品的釀造都有一個共同點，即加工過程中都有微生物及其酶參與，本質(zhì)屬于微生物發(fā)酵過程，發(fā)酵過程微生物代謝產(chǎn)生許多風(fēng)味和功能物質(zhì)及其前體物，使食物更具可食性、風(fēng)味性，并賦予食物更多的營養(yǎng)和功能。目前，我國傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品普遍采用多菌種參與的開放式固態(tài)發(fā)酵或半固態(tài)發(fā)酵工藝，發(fā)酵周期較長，發(fā)酵體系是由多種微生物構(gòu)成的獨特微生態(tài)環(huán)境，參與的微生物種類繁多，發(fā)酵過程中微生物群落不斷演替變化，呈現(xiàn)一定的規(guī)律和特點，從而完成大分子原料的降解、轉(zhuǎn)化、代謝等過程[6]。復(fù)雜的微生物群落產(chǎn)生了豐富的有機酸、氨基酸、多糖、醇、酯、酚等代謝產(chǎn)物，因此復(fù)雜但有規(guī)律的微生物群落組成是賦予傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品獨特風(fēng)味品質(zhì)的根本[7]，傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品中常見的微生物如表1所示[7-13]。

1.2 發(fā)酵過程微生物功能

1.2.1 霉菌

曲霉菌屬在發(fā)酵食品工業(yè)的應(yīng)用非常廣泛，在醬油、醋、醬類等釀造調(diào)味食品發(fā)酵過程制曲階段以及發(fā)酵初期，霉菌是主要的真菌，主要為根霉、曲霉（米曲霉、黑曲霉、黃曲霉、紅曲霉等）、青霉、毛霉等[14]。霉菌能分泌復(fù)雜的酶系，主要包括蛋白酶（酸性、中性、堿性）、淀粉酶、谷氨酰胺酶、果膠酶、半纖維素酶、纖維素酶等[15]，能利用淀粉、低聚糖、單糖等作為碳源，利用蛋白質(zhì)、氨基酸、尿素等作為氮源（圖1）。麥芽糖能夠高效地誘導(dǎo)曲霉菌分泌各種水解酶，如誘導(dǎo)米曲霉分泌α-淀粉酶，黑曲霉和構(gòu)巢曲霉生產(chǎn)葡萄糖淀粉酶等[16]。淀粉類原料在淀粉酶、糖化酶的作用下降解為糊精、麥芽糖、葡萄糖等小分子糖類，一方面，促進了細菌、酵母等其他微生物的生長，進一步代謝產(chǎn)生醇類、有機酸等風(fēng)味物質(zhì)；另一方面，一些難以被微生物利用的單糖、低聚糖、多糖又增加了產(chǎn)品的營養(yǎng)和滋味。蛋白質(zhì)原料經(jīng)蛋白酶的分解，降解成多肽、氨基酸等功能和風(fēng)味物質(zhì)，如谷氨酸和天冬氨酸具有鮮味，甘氨酸、丙氨酸、色氨酸具有甜味，酪氨酸具有苦味[17]。

表1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品主要微生物組成

圖1 曲霉菌在大分子原料降解方面的作用

紅曲霉是我國最早應(yīng)用于食品加工的有益真菌之一，紅曲色素是紅曲霉的次級代謝產(chǎn)物，主要有紅、黃兩大色系，均屬于聚酮類化合物，具有著色力強、色調(diào)柔和、對pH穩(wěn)定等優(yōu)點[18]。毛霉分泌兒茶酚氧化酶，催化乳坯中無色的黃酮和異黃酮成為黃色的羥基化合物，使產(chǎn)品呈現(xiàn)誘人的金黃色，進而增進食欲[19]。

1.2.2 酵母

除霉菌外，酵母是傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品中另一類非常重要的真菌，與釀造過程酒精發(fā)酵、高級醇及酯類化合物的生成、有機酸的生成等有直接或間接的關(guān)系，對產(chǎn)品的風(fēng)味有很大影響[20]。酒精發(fā)酵主要是酵母菌將葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳的過程，葡萄糖經(jīng)EMP途徑生成丙酮酸，后者在丙酮酸脫氫酶催化下生成乙醛，乙醛再經(jīng)乙醇脫氫酶還原為酒精，過程中除了生成酒精與二氧化碳外，還會產(chǎn)生其他副產(chǎn)物，如甘油以及戊醇、異戊醇、丁醇、異丁醇等高級醇類（統(tǒng)稱為雜醇油）和多種酯類化合物等（圖2）[21]。酒精具有清爽香氣，高級醇具有一定呈味性，丙三醇具有爽口甜味，這些醇類化合物也是酯類化合物形成的前體。

傳統(tǒng)食醋發(fā)酵過程主要分為酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵階段，酒精發(fā)酵階段主要的酵母有釀酒酵母、畢赤酵母、叢梗孢酵母、漢遜酵母、球擬酵母、假絲酵母等[22]，它們將糖類物質(zhì)發(fā)酵為酒精及其他醇類化合物，酒精作為醋酸發(fā)酵階段的主要原料，進一步被醋酸菌等微生物氧化為醋酸和乳酸等有機酸，并且乙醇能夠與有機酸生成多種酯類化合物，使產(chǎn)品的香氣更加豐富。球擬酵母是產(chǎn)酯型酵母，在醬油、醋、豆瓣醬等釀造調(diào)味品中均有發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中能夠?qū)⒛举|(zhì)素、香豆酸和阿魏酸等中間代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化生成風(fēng)味物質(zhì)4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙基苯酚和2-苯乙醇等[23]。與醬油、豆瓣醬等釀造過程及風(fēng)味形成直接相關(guān)的酵母主要有魯氏酵母和球擬酵母等[24]。其中，魯氏酵母是醬油釀造中的主要酵母菌，具有耐高滲透壓、耐鹽等特性，在醬油發(fā)酵前期發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖等生成酒精、甘油、琥珀酸及其他微量成分，并能夠合成4-羥基-呋喃酮類香味物質(zhì)，4-羥基-2（或5）-乙基-5（或2）-甲基-3（2H）-呋喃酮（HEMF）和4-羥基-2，5-二甲基-3（2H）-呋喃酮（HDMF），提高醬油的鮮味和焦糖型的風(fēng)味，還能與嗜鹽片球菌聯(lián)合作用生成糠醇，使醬油具有特殊的香氣[25-26]。

1.2.3 乳酸菌

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類能夠利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的、無芽孢、革蘭陽性細菌的總稱。乳酸菌具有豐富的物種多樣性，其約分為23個屬，200多個種，很多乳酸菌被公認為是對人體有益的益生菌[5]。乳酸菌在自然界分布極為廣泛，泡菜、腐乳、食醋、豆豉等傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品生產(chǎn)過程中幾乎都有乳酸菌存在。乳酸菌代謝產(chǎn)物中與風(fēng)味有關(guān)的物質(zhì)主要有乳酸、乙醛、丁二酮、多種氨基酸（特別是自然的芳香物質(zhì)——丙氨酸）等，并且可以將苯丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等進行異型脫羧基作用生成多種化合物，對產(chǎn)品風(fēng)味有重要的貢獻。此外，許多乳酸菌還能夠產(chǎn)生γ-氨基丁酸、共軛亞油酸、葉酸、透明質(zhì)酸等多種對人體有益的營養(yǎng)物質(zhì)[27]。乳酸菌產(chǎn)生的乳酸不僅本身具有特殊香氣，而且與乙醇生成的乳酸乙酯也是一種重要的香氣成分。按照乳酸發(fā)酵類型，乳酸菌又可分為同型發(fā)酵、異型發(fā)酵和雙歧發(fā)酵（圖3）[28]。

乳酸菌生長速度較快，發(fā)酵體系中的低聚糖能夠促進乳酸菌的生長，發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸使pH降低，在醬油、豆瓣醬、泡菜等釀造過程中可以抑制其他雜菌的生長繁殖，而乳酸菌、醋酸菌、魯氏酵母等耐酸微生物繼續(xù)生長和代謝，有利于提高產(chǎn)品的風(fēng)味，但在發(fā)酵初期如果乳酸菌過早進入大量生長階段，致使pH過早下降會降低曲霉中蛋白酶的活力，影響醬油、醬類等產(chǎn)品成熟時間。泡菜發(fā)酵過程中的乳酸菌群落組成及乳酸發(fā)酵可以分為三個階段，發(fā)酵初期，以腸膜明串珠菌異型發(fā)酵為主，該菌株生長速度快但對酸耐受性差，隨著發(fā)酵的進行很快死亡[29]；中期以植物乳桿菌和短乳桿菌的同型發(fā)酵為主，該階段積累大量乳酸，不僅積累了大量的風(fēng)味物質(zhì)，還起到了防腐抑菌的效果[30]；后期風(fēng)味物質(zhì)基本穩(wěn)定，且由于乳酸濃度的升高進而對乳酸菌的生長產(chǎn)生抑制作用從而結(jié)束發(fā)酵[31]。

圖3 乳酸菌代謝生成乳酸的主要途徑

與醬油風(fēng)味有密切關(guān)系的乳酸菌有嗜鹽片球菌（Pediococcus halaphilus）、醬油片球菌（Pediococcus soyae）、醬油四聯(lián)球菌（Tetracoccus soyae）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantanum）等。在山西老陳醋、獨流老醋、鎮(zhèn)江香醋等傳統(tǒng)食醋釀造過程中乳酸菌占有最高的豐度，是傳統(tǒng)食醋風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的主要微生物之一[32]，并且隨著發(fā)酵進程，乳酸菌多樣性也發(fā)生動態(tài)變化（表2）[22]。

表2 山西老陳醋釀造過程主要乳酸菌演替

1.2.4 醋酸菌

醋酸菌（acetic acid bacteria，AAB）是一類能夠?qū)⒁掖佳趸癁榇姿岬暮醚跣愿锾m陰性菌，不形成芽孢，目前共有12個屬[33]，其主要功能是不完全氧化糖類、糖醇類和醇類生成相應(yīng)的糖醇、酮和有機酸。其中Acetobacter spp.和Gluconacetobacter spp. 的醋酸菌具有較高的醋酸耐受性，常用于食醋的純種液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)[34]。醋酸菌氧化乙醇生成醋酸包括兩個酶催化步驟，首先通過乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）將乙醇氧化為乙醛，乙醛與水反應(yīng)形成乙醛水化物，再通過乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）將其氧化成醋酸（圖4）。這兩種酶都位于細胞膜上并朝向周質(zhì)空間，以吡咯喹啉醌蛋白（pyrroloquinolinequinone，PQQ）為輔酶[35]。

1.2.5 芽孢桿菌

圖4 醋酸菌氧化乙醇生成醋酸的反應(yīng)方程式

芽孢桿菌在自然界中分布廣泛，在食醋發(fā)酵過程中也大量存在，芽孢桿菌屬大多是一類產(chǎn)芽孢、好氧細菌，在生長過程中能夠代謝產(chǎn)生多種有機酸，如乳酸、酒石酸、丙酮酸等，使產(chǎn)品的口感變得柔和[36]。許多芽孢桿菌都具有分泌表達淀粉酶和蛋白酶的功能，如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等，可以將蛋白質(zhì)水解成氨基酸，將淀粉水解為小分子糖類，它們對釀造調(diào)味食品的風(fēng)味和顏色起著重要的作用。一些芽孢桿菌還含有編碼α-乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脫羧酶的基因，能夠發(fā)酵葡萄糖或其他可發(fā)酵碳源生成風(fēng)味物質(zhì)——乙偶姻，乙偶姻與胺基類化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)又可以進一步生成具有保健功能的四甲基吡嗪[37]。

1.2.6 其他

除了上面介紹的幾類微生物外，在傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品中還發(fā)現(xiàn)有鏈霉菌、腸桿菌、葡萄球菌等多種微生物，它們在釀造過程中也會產(chǎn)生醇類、有機酸等物質(zhì)，但濃度普遍偏低。隨著高通量測序等分子微生態(tài)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的微生物從傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品中鑒定出來，但由于許多微生物仍然難以進行純化培養(yǎng)，它們在釀造過程中的功能仍有待進一步研究。

2 中國傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品菌種選育技術(shù)

在傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品釀造過程中，發(fā)酵所用各種微生物的生長受到各種因素的影響，如菌種組成及比例、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、鹽度等，它們直接影響發(fā)酵食品的風(fēng)味物質(zhì)、色澤、品質(zhì)等。針對傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品生產(chǎn)的需求，針對不同產(chǎn)品發(fā)酵特點進行優(yōu)良菌種的選育并建立相適應(yīng)的發(fā)酵技術(shù)規(guī)范，對于促進我國傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品現(xiàn)代化，提高產(chǎn)品市場競爭力具有重要的意義。

目前我國的醬油以及豆醬等醬類的釀造多使用純培養(yǎng)的米曲霉制曲[10]，米曲霉酶系的強弱對原材料利用率、醬醪成熟時間以及醬油產(chǎn)品風(fēng)味和色澤等品質(zhì)都起著決定性作用[38]。常用的米曲霉菌株有AS3.863、滬釀3.042（AS3.951）、UE336、UE328、961、渝3.811、10B1等[39-40]。其中滬釀3.042適宜固態(tài)制曲，蛋白酶活力高，具有生長快、易管理、較粗放、原料全氮利用率穩(wěn)定等特點，是目前國內(nèi)醬油、豆瓣醬、面醬等生產(chǎn)廠家普遍使用的優(yōu)良菌株，但單菌種制曲有酶系不全、酸性蛋白酶活力弱、原料總氮利用率低等缺點，另外，在釀造過程中較低的pH和較高的鹽濃度都會抑制蛋白酶的活力[39]。

酵母、芽孢菌等微生物能夠產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，但隨著發(fā)酵的進行，體系中的酸度會逐漸增加，并且溫度升高。如醬油釀造過程pH降到5以下，鹽度增加至10%～13%（低鹽固態(tài)醬油發(fā)酵）或者17%～18%（高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵）；食醋釀造過程酸度達到5g/100g醋醅，溫度最高能夠達到50℃；泡菜發(fā)酵鹽度和酸度分別達到4%和1.0%以上；豆豉后發(fā)酵的鹽度在10%以上等。在這些條件下，許多有益微生物的生長和代謝受到了抑制，容易導(dǎo)致發(fā)酵時間延長、產(chǎn)品香氣少、風(fēng)味差等。酵母最適生長溫度一般為28～35℃,超過45℃酵母菌就會死亡分解[41]。因此選育具有耐溫、耐酸、耐鹽等特性，并且具有較高酶活的優(yōu)良菌株并應(yīng)用于生產(chǎn)，是提高發(fā)酵效率，改善產(chǎn)品品質(zhì)的一個有效手段。

2.1 自然選育

醬油、食醋、腐乳、泡菜和豆瓣醬等我國傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品普遍采用開放式發(fā)酵工藝，發(fā)酵過程中自然網(wǎng)羅了許多有益微生物，并且適應(yīng)了釀造體系，是傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品優(yōu)良菌種選育的天然寶庫。

醬油、豆瓣醬等制曲過程對曲霉的要求主要有：不產(chǎn)生黃曲霉毒素，具有安全性；蛋白酶及淀粉酶活力高、適應(yīng)性強；穩(wěn)定性好；生長速度快，適應(yīng)性強，對雜菌抵抗力強；發(fā)酵后期醬香濃郁，無異味等。醬油曲霉就是從醬油中分離出來，并應(yīng)用于醬類生產(chǎn)，此菌多聚半乳糖醛酸酶活較高[42]。Chen等[43]選育得到具有高肽酶活力的紅曲霉菌株，其羧肽酶和氨肽酶活力分別比米曲霉提高了49%和52%；將其與米曲霉混合制曲進行醬油發(fā)酵，可溶性固體、總氮、氨基態(tài)氮分別提高約21.50%、5.98%和41.43%。Zheng等[44]利用連續(xù)乙醇壓力適應(yīng)性進化的方法對醋酸發(fā)酵常用菌種巴氏醋酸桿菌進行了馴化，菌株的乙醇耐受濃度從9%提高到11%，乙醇脫氫酶活比原始菌種提高約29%，發(fā)酵效率提高約18%。篩選來源于泡菜的腸膜明串珠菌和乳酸乳球菌制作發(fā)酵劑能延長異型發(fā)酵階段，不僅能夠改善生產(chǎn)工藝，縮短發(fā)酵時間，還可以改善泡菜的風(fēng)味品質(zhì)[45]。從泡菜中篩選具有較高亞 硝酸鹽降解能力的乳酸菌，如鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、植物乳桿菌、腸膜明串珠菌等菌株，并應(yīng)用于泡菜發(fā)酵，能顯著降低發(fā)酵泡菜中亞硝酸的含量，提高產(chǎn)品品質(zhì)[46]。

2.2 誘變育種

誘變育種是發(fā)酵食品行業(yè)最常用的菌種選育技術(shù)，指用物理、化學(xué)因素誘導(dǎo)微生物遺傳特性發(fā)生變異，再從變異群體中選擇符合人們某種要求的個體的育種方法。根據(jù)誘變劑的不同主要可以分為物理誘變、化學(xué)誘變、生物誘變（轉(zhuǎn)座因子）、復(fù)合誘變等。

鄭玲艷等[47]利用紫外誘變選育出一株低產(chǎn)異戊醇酵母菌突變株，與出發(fā)菌株相比，異戊醇含量降低了31.11%，乙酸異戊酯含量增加了132.24%，高級醇總量降低了32.68%。Qi等[48]利用紫外誘變經(jīng)過醋酸應(yīng)激處理過的巴氏醋桿菌，篩選得到一株醋酸高產(chǎn)菌，能耐受60g/L的初始醋酸，最大產(chǎn)酸量達到103g/L。通過60Co和紫外復(fù)合誘變的方法對毛霉進行處理，獲得了一株高產(chǎn)端肽酶菌株，其產(chǎn)氨基酸能力較之前提高了22%，且發(fā)酵腐乳品質(zhì)良好，鮮味提高，苦味降低[49]。

離子注入對生物體的誘變作用就是荷能離子束將本身所具有的質(zhì)量、能量和電荷對生物體產(chǎn)生直接作用，產(chǎn)生的自由基或特殊的化學(xué)物質(zhì)再對生物體產(chǎn)生間接的作用，以引起細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生變異。Zhao等[50]采用N離子注入的方法對米曲霉進行誘變選育，獲得突變株A100-8，蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶活力均提高30%以上，醬油發(fā)酵效率顯著提高。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術(shù)也已經(jīng)廣泛應(yīng)用于發(fā)酵微生物的選育。該 技術(shù)利用射頻輝光放電原理，在常溫常壓狀態(tài)下產(chǎn)生高能量的等離子體，其富含的高能化學(xué)活性粒子能夠?qū)毎a(chǎn)生高強度遺傳物質(zhì)損傷，進而利用細胞啟動的SOS高容錯率修復(fù)機制，產(chǎn)生種類多樣的錯配位點，并最終經(jīng)穩(wěn)定遺傳進而形成突變多樣庫。利用A RTP方法對山西老陳醋醋醅中篩選獲得的一株耐溫巴氏醋桿菌進行誘變處理，發(fā)酵效率提高了約10%[51]。

2.3 基因組重排

基因組重排技術(shù)是基于DNA Shuff ing原理，將傳統(tǒng)誘變技術(shù)和細胞融合技術(shù)相結(jié)合，以整個基因組作為重組對象的多親本原生質(zhì)體遞推融合技術(shù)。Cao等[52]對球擬酵母進行3輪基因組重排，獲得一株具有高鹽耐受性的突變菌株，其乙酸乙酯的產(chǎn)量是出發(fā)菌株的13倍，醬油典型風(fēng)味物質(zhì)呋喃酮的產(chǎn)量提高80%，醬油風(fēng)味得到明顯改善。Zhao等[53]利用基因組重排對輪梗霉和黑曲霉進行3輪重排，篩選到一株能利用8種碳源和6種氮源的融合菌株，并且能夠產(chǎn)生更多的風(fēng)味物質(zhì)。

2.4 基因工程

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因工程育種技術(shù)越來越成熟，已經(jīng)可以實現(xiàn)大部分微生物的基因工程操作，包括內(nèi)源基因的過表達、外源基因的插入、基因的敲除、基因的定點突變、基因的替換等。當(dāng) 然，利用基因工程方法選育的菌種還應(yīng)符合相關(guān)的食品安全標準，不能含有抗性基因等潛在危害。在傳統(tǒng)食醋的菌種選育過程中，也可選用傳統(tǒng)育種和基因工程育種相結(jié)合的方法以獲得更高產(chǎn)或其他更符合需要的目標菌株。如篩選到具有生物合成風(fēng)味物質(zhì)乙偶姻能力的枯草芽孢桿菌，進一步利用同源重組的方法敲除其2,3-丁二醇脫氫酶基因，增加了乙偶姻的產(chǎn)量[36]。

總之，微生物育種技術(shù)多種多樣，由自然選育到誘變育種， 由單一誘變至復(fù)合誘變，由非理性誘變到定向改造，優(yōu)良菌種的選育已經(jīng)越來越趨于簡便、高效和環(huán)保。

3 展 望

目前，我國食醋、豆瓣醬等傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品仍采用較粗放的生產(chǎn)方式，現(xiàn)代化程度較低，發(fā)酵周期長，易受季節(jié)性影響，生產(chǎn)過程及產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定性控制方面仍有待提高，亟需運用生物技術(shù)提升和改造傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品行業(yè)生產(chǎn)方式，加強其共性關(guān)鍵性技術(shù)的集成創(chuàng)新與研發(fā)，促進行業(yè)健康發(fā)展。微生物菌種是傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品行業(yè)健康發(fā)展的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，因此，綜合利用宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)，分析傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物組成，研究微生物代謝特性與代謝網(wǎng)絡(luò)，分析關(guān)鍵微生物在原料利用、營養(yǎng)與功能成分以及風(fēng)味物質(zhì)代謝、發(fā)酵過程調(diào)控等方面的作用機制，進一步定向選育具有增香、抗逆、高效等特性的優(yōu)良菌株，并應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)及產(chǎn)品改良，是傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品行業(yè)未來一段時間主要的研究方向。

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Functional analysis and breeding methods of microorganisms for Chinese traditional fermented condiments

ZHENG Yu，XIE Sankuan，YU Songfeng，ZHANG Xianglong，WU Yanfang，WANG Min
Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China

Chinese traditional fermented condiments, including soy sauce, vinegar, pickled tofu, bean sauce, pickled cabbage, have a long history and are always produced with special techniques. The fermentations of them are usually performed in an opening environment using cereals and beans as raw materials. Many microorganisms are contained in the system to accomplish the degradation of polymolecules, such as starch, protein and cellulose and the conversion of organic acids, amino acids, polysaccharides, alcohols, esters and so on, giving the special characterizations of traditional fermented condiments. This paper illustrated the composition and functions of microorganisms in traditional fermented condiments, and some methods for strains breeding are also reviewed.

traditional fermented condiments; microorganism functions; microorganism metabolism; strains breeding

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.013

國家自然科學(xué)基金（31471722，31671851），國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0400505），國家“863”計劃項目（2013AA102106），天津市科技支撐計劃（16YFZCNC00650）