刺葡萄紫秋遠緣雜交胚挽救技術(shù)研究

周俊，羅智勇*，廖曉珊，文斌，譚竟，黃濤，周雷

（株洲市農(nóng)業(yè)科學研究所，湖南株洲 412007）

刺葡萄紫秋遠緣雜交胚挽救技術(shù)研究

周俊，羅智勇*，廖曉珊，文斌，譚竟，黃濤，周雷

（株洲市農(nóng)業(yè)科學研究所，湖南株洲 412007）

采用胚挽救技術(shù)對湖南野生刺葡萄品種進行遠緣雜交育種，以期得到刺葡萄三倍體新種質(zhì)。通過不同培養(yǎng)基以及不同取樣時間的試驗，得出最適基本培養(yǎng)基為改良B5；取樣時間以授粉50～55 d為宜。以四倍體為母本的組合胚培養(yǎng)成苗率較高，其中巨峰×紫秋雜交的成苗率最高，達22.8%。

刺葡萄；紫秋；遠緣雜交；胚挽救

胚挽救是在胚敗育前將胚珠取出進行離體胚珠內(nèi)胚培養(yǎng)，阻止胚的敗育，從而使不成熟合子胚繼續(xù)發(fā)育并在離體條件下萌發(fā)成苗[1]。二倍體與四倍體葡萄雜交是獲得三倍體無核葡萄最有效的方法，但是二倍體和四倍體雜交的最大障礙是親和力差，坐果率低，雜種胚早期敗育或胚乳解體，獲得的三倍體雜交種子生活力低，很難得到雜交后代，運用胚挽救技術(shù)能獲得較多的雜交后代，并在其中篩選三倍體雜種[2]。

刺葡萄屬東亞種群，是我國主要野生葡萄種群之一，為二倍體[3]，其抗逆性強、豐產(chǎn)性好，但籽多，籽與肉囊較難分離，鮮食品質(zhì)較低。本試驗以二倍體刺葡萄與四倍體歐美雜種葡萄進行遠緣雜交，利用胚挽救技術(shù)可獲得三倍體新種質(zhì)，為無核葡萄育種提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗于2011-2015年在株洲市農(nóng)業(yè)科學研究所進行。利用二倍體刺葡萄品種紫秋與不同四倍體葡萄雜交，雜交組合見表1。

表1 雜交組合

父本花粉采集于初花期進行，取出花藥于干燥處晾干，待花藥開裂、花粉散出后收集于玻璃瓶中儲存。

母本花前3～4 d去雄。去雄時選擇生長正常的結(jié)果枝，每枝留1個花序，根據(jù)母本品種不同每花序留30～50朵花。為防止去雄時花粉落到柱頭上造成自交，每次去雄后立即套袋。去雄后兩天左右，待柱頭上出現(xiàn)粘液時，分1～2次授粉（用毛筆沾取花粉刷在帶粘液的柱頭上），每組合授粉20～25穗。

1.2 培養(yǎng)基的篩選

胚珠培養(yǎng)基：Nitsch+GA30.3 mg/L+60 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，調(diào)pH5.8，培養(yǎng)室溫度25 ℃±2 ℃，培養(yǎng)30 d左右以后，將胚從胚珠中剝出，放入胚培養(yǎng)基中使其萌發(fā)成苗。胚培養(yǎng)基分別使用MS、1/2MS和改良B5，每種培養(yǎng)基均添加IAA 0.5 mg/L+GA30.3 mg/L+60 g/L蔗糖，調(diào)pH5.8，培養(yǎng)室溫度25 ℃±2 ℃，2500Lx照度每天照光14 h。

統(tǒng)計萌發(fā)率，胚萌發(fā)率/%=萌發(fā)胚數(shù)/接種胚珠數(shù)×100。

成苗率：正常苗數(shù)占接種胚珠數(shù)的百分率。

1.3 取樣時間的選擇及接種

從授粉后45 d開始，每隔5 d取樣一次，取樣3次。每個組合取雜交果實30～35個，葡萄樣品先用75%酒精溶液浸泡20 s，然后用0.1%升汞消毒15 min，再用無菌水清洗3～4次。在無菌條件下采用Nitsch培養(yǎng)基進行胚珠離體培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d以后，將胚從胚珠中剝出。胚接種在改良B5培養(yǎng)基中，胚萌發(fā)后分批統(tǒng)計萌發(fā)率，分析不同取樣時間對胚萌發(fā)率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對胚發(fā)育率的影響

以紫秋×巨峰的雜交胚為試材對MS、1/2MS、改良B5基礎(chǔ)胚培養(yǎng)基進行篩選，發(fā)現(xiàn)基本培養(yǎng)基成分對植株形成率影響顯著。在添加相同濃度的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的條件下（IAA 0.5 mg/L），1/2MS培養(yǎng)基效果最差，成株率僅為5%；MS略高，為6.4%；改良B5效果最好，成株率達到29%（表2）。與趙艷華等[4]的研究結(jié)果一致。

2.2 不同取樣時間對胚萌發(fā)率的影響

在胚挽救過程中，取樣時期的確定是影響胚挽救成功率的關(guān)鍵因素之一。由于胚挽救的雜交親本材料不同，胚敗育的時期和方式也可能不同[6]，所以胚挽救的取樣時期也應該存在差異。因此確定刺葡萄雜交后代胚挽救最佳取樣時間非常重要。

刺葡萄紫秋是晚熟品種，醉金香、巨峰、香悅為中熟品種，雜交后代胚敗育較晚，本試驗從授粉后45 d開始，每隔5 d取樣一次，以確定胚挽救最佳的取樣培養(yǎng)時期。

如表3所示，以紫秋為母本的雜交組合，授粉后50～55 d，胚萌發(fā)率較高，其中紫秋×巨峰組合的取樣時間在55 d的胚萌發(fā)率最高，達42.62%；而以紫秋為父本的3個組合中，醉金香×紫秋雜交組合的取樣時間在45 d為最高，胚萌發(fā)率達到32.56%?？偟膩砜矗谑诜酆?0 d，隨著接種時間的推遲，胚珠的發(fā)育率不斷提高。

表2 基本培養(yǎng)基對紫秋×巨峰雜交組合胚發(fā)育率的影響

表3 不同取樣時間對胚萌發(fā)率的影響

表4 不同雜交組合的雜交胚培養(yǎng)

2.3 不同組合的胚培養(yǎng)

將不同雜交組合在不同培養(yǎng)基、不同取樣時間試驗中的胚珠接種總數(shù)、胚萌發(fā)總數(shù)、胚萌發(fā)率和成苗率進行統(tǒng)計。如表4所示，以四倍體為母本的組合胚培養(yǎng)成苗率較高，分別為22.8%、19.01%和22.02%；以二倍體為母本的組合成苗率相對較低，分別為5.46%、6.84%和8.33%。相同的兩個品種雜交，以四倍體為母本胚培養(yǎng)的成苗率高于以二倍體為母本的雜交組合。

3 討論

胚在正常情況下能發(fā)育成熟，播種后能發(fā)育成完整的植株。但是，在不同倍性間雜交胚的發(fā)育中，胚往往出現(xiàn)中途敗育或退化[7-8]，這極大地降低了育種效率。王愛玲等[9]認為，不同培養(yǎng)基作為胚挽救成功的重要外界條件，創(chuàng)造幼胚發(fā)育的良好外在條件可以提高胚的發(fā)育率和成苗率，并且氨基酸在胚珠發(fā)育培養(yǎng)基中的作用早已引起許多學者的廣泛關(guān)注[5]。胚挽救技術(shù)能有效地提高葡萄雜交育種效率，是育種中基因重組的有力橋梁，使可能敗育或?qū)⒁獢∮呐呓?jīng)過適宜的培養(yǎng)，獲得再生植株，這對加快葡萄的雜交育種進程具有重要意義。

刺葡萄耐高溫高濕、低光照和高抗病性，在南方已有多年的栽培歷史，在湖南刺葡萄資源非常豐富[3]。本研究旨在將豐富的刺葡萄資源加以利用，將刺葡萄與優(yōu)良的歐美種葡萄進行雜交，以期得到適合湖南露地栽培雜交新品種，降低設(shè)施成本及生產(chǎn)中農(nóng)藥化肥的使用。本研究通過對取樣時間的確定，基本培養(yǎng)基的選擇及對不同雜交組合進行雜種胚培養(yǎng)，已得到適合刺葡萄遠緣雜交胚挽救的適合方法，期望得到刺葡萄三倍體雜交新品種。本試驗采用胚挽救技術(shù)培養(yǎng)三倍體雜種，極大的提高了刺葡萄優(yōu)質(zhì)資源的利用，拓寬了刺葡萄育種的范圍，縮短了育種年限。下一步，我們將對雜種幼苗進行分子倍性鑒定。

[1] 王飛, 王躍進, 周會玲, 等. 無核葡萄與中國野生葡萄雜種胚發(fā)育和敗育的細胞學研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報: 自然科學版, 2005, 33(3): 61-65.

[2] 郭印山, 高秀巖, 趙玉輝, 等. 金星無核葡萄胚挽救技術(shù)研究初報[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2004(3): 6-8.

[3] 石雪暉, 楊國順, 劉昆玉, 等. 湖南省刺葡萄種質(zhì)資源研究進展[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2014(4): 47-49.

[4] 趙艷華, 程和禾, 吳雅琴, 等. 三倍體葡萄種質(zhì)創(chuàng)新及倍性快速鑒定[J]. 園藝學報, 2011, 38(6): 1161-1166.

[5] 孫馬, 王躍進. 中國野生葡萄染色體倍性研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學報, 2006, 15(6): 148-152.

[6] 徐海英, 閆愛玲, 張國軍. 葡萄二倍體與四倍體品種間雜交胚挽救取樣時期的確定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2005, 38(3): 629-633.

[7] 陳香波, 曹孜義. 離體葡萄未成熟胚成苗途徑研究[J]. 果樹科學, 2000, 17(4): 261-264.

[8] 董曉玲, 賀普超. 無核葡萄楊格爾的胚發(fā)育及胚珠培養(yǎng)[J]. 果樹科學, 1991, 8(2): 87-90.

[9] 王愛玲, 王躍進, 唐冬梅, 等. 提高無核葡萄胚挽救中幼胚成苗率的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2010, 43(20): 4238-4245.

Study on distant hybridization and embryo rescue technique of Vitis davidii Foёx Ziqiu

ZHOU Jun, LUO Zhiyong*, LIAO Xiaoshan, WEN Bin, TAN Jing, HUANG Tao, ZHOU Lei
(Zhuzhou Institute of Agricultural Sciences, Zhuzhou 412007)

In order to obtain new triploid germplasm, Vitis davidii Foёx Ziqiu were chosen to cross with tetraploid (European and American Hybrid), the acquired ovules were cultured by the embryo rescue technique. The different media and sampling time were investigated. The result showed that modified B5 was better as base medium, 50～55 days after pollinating were suitable sampling time. The cross combinantion by tetraploid(Koyho) as female parent got a higher seedling rate, it's 22.8%.

Vitis davidii Foёx; Ziqiu; distant hybridization; embryo rescue

S663.1

A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.01.006

2016-10-13

湖南省市自然科學聯(lián)合基金（2016JJ5040）

周?。?983-），男，碩士學位，主要研究刺葡萄雜交育種、刺葡萄釀酒。

*通訊作者：羅智勇（1972-），男，本科學歷，主要研究水果育種與栽培、刺葡萄釀酒。E-mail: 280029425@qq.com