亞麻類萌發(fā)素蛋白基因LuGLP1－13的克隆及表達(dá)分析

于瑩，袁紅梅，程莉莉，趙東升，陳晶，吳建忠，張樹權(quán)，吳廣文

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱，150086）

亞麻類萌發(fā)素蛋白基因LuGLP1－13的克隆及表達(dá)分析

于瑩，袁紅梅，程莉莉，趙東升，陳晶，吳建忠，張樹權(quán)，吳廣文*

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱，150086）

類萌發(fā)素蛋白（Germin－like proteins，GLPs）是一類防御應(yīng)答蛋白，在植物抗病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。前期研究工作發(fā)現(xiàn)一個(gè)類萌發(fā)素蛋白基因（Lus10003267）在亞麻鹽堿脅迫下數(shù)字基因表達(dá)譜（DGE）數(shù)據(jù)中顯著上調(diào)，推測(cè)該基因可能與亞麻鹽堿應(yīng)答脅迫有關(guān)。本研究利用亞麻L(zhǎng)us10003267基因序列和RT－PCR方法克隆了亞麻類萌發(fā)素蛋白基因，命名為L(zhǎng)uGLP1－13，其CDS長(zhǎng)687bp，編碼228個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，該蛋白質(zhì)分子量為24.3ku，等電點(diǎn)為5. 77，不穩(wěn)定系數(shù)為23.64，是一種較穩(wěn)定的酸性蛋白。該蛋白具有信號(hào)肽序列，是一種胞外分泌蛋白。多序列比對(duì)及進(jìn)化分析表明，該蛋白具有典型的GLPs家族特征，與蓖麻、毛果楊及胡楊的GLPs家族蛋白親緣關(guān)系相對(duì)最近。熒光定量PCR結(jié)果表明，亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因在鹽堿脅迫下被顯著誘導(dǎo)表達(dá)（尤其在堿性鹽脅迫下），推測(cè)該基因可能參與亞麻應(yīng)答鹽堿脅迫的過(guò)程，這一結(jié)果為進(jìn)一步研究亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因的功能和耐鹽堿分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。

亞麻；類萌發(fā)素蛋白；基因克??；鹽堿脅迫；表達(dá)分析

Thompson等于1980年在研究小麥胚芽特定蛋白時(shí)首次發(fā)現(xiàn)了萌發(fā)素蛋白（Germin proteins）［1］。隨后，許多與小麥萌發(fā)素蛋白結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，這類蛋白質(zhì)被命名為類萌發(fā)素蛋白（Germin－like proteins，GLPs）。GLPs是一類由多基因編碼的位于細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白，通過(guò)離子鍵結(jié)合為穩(wěn)定的低聚物而存在于細(xì)胞外基質(zhì)中［2－3］。GLPs主要以結(jié)構(gòu)蛋白、受體和酶的形式參與植物體內(nèi)各種生理生化反應(yīng)。GLPs能夠清除植物體內(nèi)過(guò)多的活性氧物質(zhì)（Reactive oxygen species，ROS），反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2可通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)，還可通過(guò)纖維素交聯(lián)作用增強(qiáng)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。

GLPs作為病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis－related proteins，PRs）家族的成員，與植物應(yīng)答生物脅迫與非生物脅迫密切相關(guān)［4］。GLPs除了具有草酸鹽氧化酶和超氧化物歧化酶等酶類的結(jié)構(gòu)和功能外，還具有受體和結(jié)構(gòu)蛋白的功能。近年來(lái)，對(duì)植物GLPs功能的研究多集中在擬南芥等模式植物上。目前，亞麻GLPs基因的克隆及功能分析還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。對(duì)于GLPs參與植物應(yīng)答鹽堿脅迫功能的研究主要集中在中性鹽脅迫方面，堿性鹽脅迫方面還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

前期研究工作中，亞麻（Linum usitatissimum L.）鹽堿脅迫下數(shù)字基因表達(dá)譜（DGE）測(cè)序結(jié)果顯示，一個(gè)亞麻類萌發(fā)素蛋白基因（Lus10003267）的表達(dá)在鹽堿脅迫下顯著上調(diào)（尤其是堿性鹽脅迫下），推測(cè)該基因可能與亞麻應(yīng)答鹽堿脅迫相關(guān)。本研究利用亞麻類萌發(fā)素蛋白基因序列及RT－PCR方法，克隆了亞麻類萌發(fā)素蛋白基因，并利用生物信息學(xué)方法分析了該基因及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位及進(jìn)化關(guān)系等信息，結(jié)合熒光定量PCR方法對(duì)該基因在不同鹽堿脅迫時(shí)間及不同鹽堿脅迫濃度下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，旨在為進(jìn)一步研究該基因的功能和亞麻應(yīng)答鹽堿脅迫的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料及鹽堿脅迫處理

亞麻種子黑亞19號(hào)由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。黑亞19號(hào)是從16份亞麻品種篩選出來(lái)的較耐鹽堿的亞麻品種［5］。將亞麻播種于裝有蛭石的花盆中，每隔3 d澆一次1/2 MS營(yíng)養(yǎng)液，待生長(zhǎng)三周后（苗高約10 cm），采用水培方式對(duì)亞麻幼苗進(jìn)行鹽堿脅迫處理。分別采用不同鹽堿脅迫濃度（50 mM、75 mM、100 mM NaCl，5 mM、10 mM、15 mM Na2CO3，30 mM、40 mM、50 mM NaHCO3）處理亞麻材料24 h；分別采用100 mM NaCl、15mM Na2CO3和50 mM NaHCO3分別處理1 h、6 h和24 h。脅迫處理后，全植株取樣，液氮速凍，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

總RNA提取采用北京原平皓生物技術(shù)有限公司植物RNA快速提取試劑盒（HF109－02），反轉(zhuǎn)錄采用東洋紡（上海）生物科技有限公司ReverTra Ace qPCR RT Kit試劑盒（FQS－301），熒光定量PCR采用東洋紡（上海）生物科技有限公司SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒（QPK－201T），PCR擴(kuò)增采用東洋紡（上海）生物科技有限公司KOD Plus Neo試劑盒（Lot：266600），電泳指示物（DNA Marker）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（TAKARA）。

1.2 方法

1.2.1 亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因的克隆

提取亞麻總RNA（具體步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書），用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，紫外分光光度計(jì)（Nanodrop）測(cè)定其純度和濃度。反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行第一鏈cDNA的合成（具體步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書），得到的cDNA保存于－20℃冰箱中備用。根據(jù)網(wǎng)上公布的亞麻GLP基因（Lus10003267）的序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物（表1）。PCR反應(yīng)體系（20μl）：2μl 10×Buffer（含Mg2＋），1μl上游引物（10μmol/L），1μl下游引物（10μmol/L），2μl dNTP（10 mmol/L），1μl cDNA模板（20 ng/μl），1μl Taq酶（5U），12μl ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃2 min（30個(gè)循環(huán)）；72℃10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，引物合成及基因測(cè)序工作由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

表1 亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因克隆及熒光定量PCR所用引物Tab.1 Primer sequences of flax LuGLP1－13 gene and actin gene

1.2.2 亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因序列生物信息學(xué)分析

利用在線程序protparam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）對(duì)LuGLP1－13蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。利用在線程序SOPMA（http：//npsa－pbil.ibcp.Fr）對(duì)LuGLP1－13蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用在線程序CELLO v.2.5 server（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）對(duì)LuGLP1－13蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析。利用在線程序SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)LuGLP1－13蛋白質(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。利用DNAMAN軟件對(duì)亞麻L(zhǎng)uGLP1－13蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析。利用MEGA v5軟件將41個(gè)其他植物GLPs蛋白質(zhì)與亞麻L(zhǎng)uGLP1－13蛋白質(zhì)構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.3 亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因表達(dá)模式分析

以組成型表達(dá)亞麻Actin基因作為內(nèi)參對(duì)照，根據(jù)克隆得到的LuGLP1－13基因序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)亞麻熒光定量PCR引物（表1），由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。先通過(guò)普通PCR擴(kuò)增判斷引物的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳。選擇最佳退火溫度，確保沒(méi)有引物二聚體產(chǎn)生后，按該退火溫度進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。應(yīng)用ABI7500熒光定量PCR儀，以各取樣點(diǎn)的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（20μl）：10μl50×SYBRGreen Mix，0.1μl 50×ROX，1μl cDNA模板（20 ng/μl），2μl dNTP（10 mmol/L），1μl上游引物（10μmol/L），1μl下游引物（10μmol/L），4.9μl ddH2O。反應(yīng)程序：95℃1min，95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)，于72℃收集熒光，反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和融解曲線，得到相應(yīng)的Ct值。采用以各取樣時(shí)間點(diǎn)亞麻Actin基因的量為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)試驗(yàn)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)，根據(jù)Ct值的大小，采用2－△△CT算法［6］計(jì)算表達(dá)量；采用SPSS16.0軟件中的單因素方差分析法（One－Way Anova）對(duì)表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因的克隆

從鹽堿脅迫處理后的亞麻全植株中提取總RNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1A），用紫外分光光度計(jì)測(cè)定280 nm，260 nm和230 nm波長(zhǎng)下吸光值，同時(shí)計(jì)算A260/A280和A260/A230的比值。結(jié)果表明，28S rRNA電泳條帶的亮度大于18S rRNA條帶，兩條條帶很清晰的分開(kāi)，所得到的RNA比較完整?？俁NA濃度為112 ng/μl，A260/A280為1.95，A260/A230為2.05，所提取的RNA基本上沒(méi)有雜質(zhì)的污染，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用基因特異引物和RT－PCR方法，以cDNA為模板做PCR擴(kuò)增得到目的基因產(chǎn)物，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1B）。結(jié)果表明，克隆得到1個(gè)約700 bp的目的條帶，將PCR產(chǎn)物切膠回收并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示所得條帶為687 bp，后續(xù)的生物信息學(xué)分析表明，此序列編碼GLP蛋白，故命名為L(zhǎng)uGLP1－13。

圖1 亞麻總RNA電泳圖及LuGLP1－13基因的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of total RNA of flax and LuGLP1－13 gene amplification

2.2 亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因及編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

2.2.1 亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因及編碼蛋白質(zhì)序列分析

將亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因的測(cè)序結(jié)果與網(wǎng)上公布的Lus10003267的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明LuGLP1－13基因與Lus10003267的mRNA序列在編碼區(qū)第600個(gè)核苷酸的位置存在1個(gè)SNP的差異（T變?yōu)镃），該SNP并沒(méi)有導(dǎo)致氨基酸序列的變化。LuGLP1－13基因長(zhǎng)度為687 bp，編碼228個(gè)氨基酸。理化性質(zhì)分析結(jié)果表明LuGLP1－13蛋白質(zhì)分子量為24.3 ku，等電點(diǎn)為5.77，不穩(wěn)定系數(shù)為23.64，說(shuō)明它是一種較穩(wěn)定的酸性蛋白質(zhì)。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明LuGLP1－13的N端具有信號(hào)肽，可能的剪切位點(diǎn)位于第22和第23個(gè)氨基酸殘基之間，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示它定位在細(xì)胞外或細(xì)胞膜上，推測(cè)LuGLP1－13蛋白質(zhì)是一種胞外分泌蛋白（圖2）。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明LuGLP1－13蛋白質(zhì)中α－螺旋（H）、β－折疊（E）、延伸鏈（T）和無(wú)規(guī)則卷曲（C）所占百分比分別為22.37%、30.7%、12.72%和34.21%，屬于混合型蛋白。

圖2 亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因的信號(hào)肽預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位分析Fig.2 Signal peptide prediction and subcellular localization of LuGLP1－13 gene in flax

2.2.2 亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因的序列比對(duì)及進(jìn)化分析

將亞麻L(zhǎng)uGLP1－13蛋白質(zhì)序列與擬南芥AtGLP1－13（GL113_ARATH）［7］、花生AhGLP1－1（ADD71877）［8］、大麥HvGLP1a（ABG46232）［9］、豌豆PsGLP（CAB65369）［10］、杜鵑RmGLP1（BAG75122）［11］的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重序列比對(duì)（圖3）。結(jié)果表明，六種植物的GLPs均具有三個(gè)高度保守的寡肽，分別命名為Box A、Box B、BoxC。Box A、B、C的保守氨基酸序列分別為QDXCVA－、G－N－PH－HPR－－EX－－XX－G、GXXHFQ－N－G，其中“－”表示任意氨基酸，“X”為疏水氨基酸。Box B和Box C中的三個(gè)組氨酸（His，H）和一個(gè)谷氨酸（Glu，E）殘基能結(jié)合金屬離子，與GLPs的SOD活性密切相關(guān)。在N端都具有一個(gè)信號(hào)肽，用于蛋白定位，因?yàn)镚LPs屬于胞外分泌蛋白。

圖3 亞麻L(zhǎng)uGLP1－13蛋白與其他植物GLPs蛋白的多重序列比對(duì)Fig.3 Multiple alignment of amino acid sequence of LuGLP1－13 and other plant GLPs

將亞麻L(zhǎng)uGLP1－13蛋白序列與41個(gè)植物GLPs蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹（圖4）。這41個(gè)GLPs蛋白來(lái)自13個(gè)不同物種，其中擬南芥的成員有26個(gè)。進(jìn)化樹分析表明LuGLP1－13蛋白與GLP亞家族1的蛋白都聚類到了一個(gè)大類中，與亞麻L(zhǎng)uGLP1－13蛋白親緣關(guān)系最近的蓖麻、毛果楊和胡楊的GLP蛋白，可能是由于亞麻與蓖麻、毛果楊和胡楊都屬于金虎尾目，所以蛋白的序列結(jié)構(gòu)相近。

圖4 亞麻L(zhǎng)uGLP1－13蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic tree of the amino acid sequence of LuGLP1－13 and GLPs from other plant species

2.3 亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因鹽堿脅迫下的表達(dá)模式分析

利用熒光定量PCR方法對(duì)亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因在不同鹽堿脅迫種類不同鹽堿脅迫時(shí)間下的表達(dá)模式進(jìn)行了研究（圖5）。結(jié)果表明，亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因在100 mM NaCl脅迫下呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，6 h表達(dá)量最高，表達(dá)量大約是對(duì)照的100倍，1 h和6 h的表達(dá)量與對(duì)照相比差異極顯著（圖5A）。在15 mM Na2CO3和50 mM NaHCO3脅迫下該基因的表達(dá)隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，24 h的表達(dá)量分別是對(duì)照的1500倍及6000倍。其中15mM Na2CO3脅迫6h和24 h的表達(dá)量與對(duì)照相比差異極顯著；50mM NaHCO3脅迫6h的表達(dá)量與對(duì)照相比差異顯著，脅迫24 h的表達(dá)量與對(duì)照相比差異極顯著（圖5B－C）。

圖5 不同鹽堿脅迫時(shí)間下亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因的表達(dá)模式分析Fig.5 Expression levels of LuGLP1－13 gene under different saline－alkaline stress time

利用熒光定量PCR方法對(duì)亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因在不同鹽堿脅迫種類不同鹽堿脅迫濃度下的表達(dá)模式進(jìn)行了研究（圖6）。結(jié)果表明，亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因在不同濃度NaCl脅迫下呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在50 mM時(shí)表達(dá)量最高，表達(dá)量大約是對(duì)照的25倍，50 mM與75 mM時(shí)的表達(dá)量與對(duì)照相比差異極顯著（圖6A）。在不同濃度Na2CO3和NaHCO3脅迫下該基因的表達(dá)隨脅迫濃度的增高而增加，最高表達(dá)量分別是對(duì)照的1500倍及6000倍，其中10 mM Na2CO3脅迫時(shí)的表達(dá)量與對(duì)照相比差異顯著，15 mM Na2CO3脅迫時(shí)的表達(dá)量與對(duì)照相比差異極顯著；40 mM NaHCO3和50 mM NaHCO3脅迫時(shí)的表達(dá)量與對(duì)照相比差異極顯著（圖6B－C）。亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因在鹽堿脅迫下的表達(dá)模式分析表明，該基因受到鹽堿脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，尤其是堿性鹽脅迫，其可能參與了亞麻應(yīng)答鹽堿脅迫的過(guò)程。

圖6 不同鹽堿脅迫濃度下亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因的表達(dá)模式分析Fig.6 Expression levels of LuGLP1－13 gene under different saline－alkaline stress concentrate

3 討論

GLPs屬于cupins蛋白家族，幾乎存在于所有植物中，而且家族成員眾多，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）有32個(gè)成員，水稻（Oryza sativa）有42個(gè)成員，大麥（Hordeum vulgare）有21個(gè)成員［9］。雖然GLPs家族成員的蛋白質(zhì)序列相似度不高，但都具有共同的結(jié)構(gòu)特征，如Box A、Box B和Box C三個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)區(qū)，其中的三個(gè)組氨酸構(gòu)成了萌發(fā)素蛋白的酶活性位點(diǎn)，可用來(lái)結(jié)合金屬離子，成熟的GLPs在N端都有一個(gè)能幫助蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外的信號(hào)肽［2，12］。本研究通過(guò)RTPCR技術(shù)獲得了一個(gè)亞麻的類萌發(fā)素蛋白基因LuGLP1－13，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因所編碼的蛋白在N末端具有一段信號(hào)肽序列，還具有Box A、Box B和Box C三個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)區(qū)和三個(gè)組氨酸殘基，初步推斷LuGLP1－13基因是典型的植物GLPs蛋白家族基因。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明該蛋白與蓖麻、毛果楊和胡楊等類萌發(fā)素蛋白屬于相同的進(jìn)化分支。

類萌發(fā)素蛋白作為一種植物防御應(yīng)答蛋白，在植物抗病過(guò)程中起重要作用。因此，對(duì)植物GLPs功能的研究大多集中在抗病方面。近年來(lái)的研究表明，GLPs也是一類參與植物對(duì)逆境脅迫響應(yīng)的重要基因，可受多種非生物脅迫的誘導(dǎo)。Komatsu等研究發(fā)現(xiàn)，大豆在淹水脅迫時(shí)，四個(gè)大豆GLPs前體表達(dá)下調(diào)［13］。Pinheiro等研究發(fā)現(xiàn)，白羽扇豆在連續(xù)干旱13 d后一個(gè)GLP（gi1171937）表達(dá)量開(kāi)始積累［14］。Membré等研究發(fā)現(xiàn)，三個(gè)擬南芥GLPs基因（AtGER1、AtGER2、AtGER3）分別在煙草中異源表達(dá)后都增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)高溫脅迫的抗性［15］。Lu等研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)GmGER9的轉(zhuǎn)基因煙草與對(duì)照相比具有較高的耐鹽能力［16］。本研究的熒光定量PCR結(jié)果顯示，亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因的表達(dá)受到鹽堿脅迫的誘導(dǎo)。在中性鹽NaCl脅迫下，呈先升高后降低的趨勢(shì)。在堿性鹽Na2CO3和NaHCO3脅迫下呈上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，而且表達(dá)量明顯高于NaCl脅迫，說(shuō)明該基因在亞麻應(yīng)答鹽堿脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用，尤其是堿性鹽脅迫下。不同鹽堿脅迫時(shí)間的研究結(jié)果表明，LuGLP1－13基因一般在鹽堿脅迫后6 h時(shí)表達(dá)量迅速增加，說(shuō)明該基因的表達(dá)不是亞麻對(duì)鹽堿脅迫瞬間的應(yīng)激反應(yīng)。不同鹽堿脅迫濃度的研究結(jié)果表明，在低濃度時(shí)LuGLP1－13基因的表達(dá)量隨濃度的增加而增大（如Na2CO3和NaHCO3脅迫），高濃度時(shí)隨濃度的增加而減少（如NaCl脅迫），說(shuō)明該基因的表達(dá)在一定的鹽堿脅迫濃度下達(dá)到一個(gè)相對(duì)平衡，平衡破壞后表達(dá)量會(huì)下降。推測(cè)該基因參與亞麻應(yīng)答鹽堿脅迫的途徑是鹽堿脅迫在脅迫初期會(huì)形成離子脅迫和滲透脅迫，同時(shí)植物體內(nèi)會(huì)積累大量ROS，脅迫后期引起氧化脅迫（蛋白質(zhì)的氧化和脂質(zhì)的過(guò)氧化）。鹽堿脅迫初期，LuGLP1－13基因的表達(dá)量會(huì)增加，主要通過(guò)SOD、OXO、AGPPase等抗氧化系統(tǒng)幫助亞麻進(jìn)行體內(nèi)解毒，清除ROS，從而緩解脅迫帶來(lái)的損傷。但當(dāng)脅迫到達(dá)一定濃度和時(shí)間后，LuGLP1－13基因的表達(dá)量會(huì)下降，因?yàn)閬喡轶w內(nèi)的平衡遭到嚴(yán)重破壞，已經(jīng)不能通過(guò)大量表達(dá)該基因進(jìn)行損傷的修復(fù)，同時(shí)大量表達(dá)可能會(huì)給植物帶來(lái)更大的負(fù)擔(dān)，所以后期表達(dá)量會(huì)下降。因此，GLPs可能在植物應(yīng)答鹽堿脅迫的過(guò)程中扮演著重要的角色，但這還需要我們提供更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)加以證明。對(duì)亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因今后可以在以下幾方面展開(kāi)深入研究：（1）利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)及RNA干擾技術(shù)對(duì)亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因功能進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證；（2）結(jié)合酵母雙雜交系統(tǒng)或GST－pulldown技術(shù)，對(duì)LuGLP1－13基因參與亞麻鹽堿脅迫應(yīng)答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的上下游元件進(jìn)行篩查，從而確定亞麻L(zhǎng)uGLP1－13基因在調(diào)控通路中的作用；（3）對(duì)亞麻GLP基因家族其他成員進(jìn)行研究，分析各成員在亞麻應(yīng)答鹽堿脅迫過(guò)程中的作用。

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Cloning and Expression Analysis of LuGLP1－13 Gene of Flax

Yu Ying，Yuan Hongmei，Cheng Lili，Zhao Dongsheng，Chen Jing，Wu Jianzhong，Zhang Shuquan，Wu Guangwen
（Institute of Industrial Crops，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086，China）

Germin－like proteins（GLPs）is a kind of defense response gene，which plays an important role in the process of plant disease resistance.In the previous study，a GLPs gene（Lus10003267）was significantly up－regulated under saline－alkaline stress by digital gene expression in flax，suggesting that this genemay be participated in saline－alkaline stress response.In this study，the Lus10003267 gene was cloned by RT－PCR and named as LuGLP1－13.The CDS of this gene was 687bp，encoding 228 amino acids.Bioinformatics analysis showed that themolecular weight of the protein was 24.3ku，the isoelectric point was 5.77，and the unstable coefficient was 23.64，which was a relatively stable acidic protein.LuGLP1－13 has a signal peptide sequence，which is a kind of extracellular proteins.Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis showed that the protein has a typical GLPs family characteristic，and it had the closest relationship with Ricinus communis，Populus trichocarpa and Populus euphratica GLPs.The results of qRT－PCR showed that the LuGLP1－13 gene wassignificantly induced under saline－alkaline stress（especially the alkaline salt stress），suggesting that this genemay be involved in the response process to saline－alkaline stress.This study provided theoretical basis for further study on the function of LuGLP1－13 gene and themolecularmechanism of salinealkaline tolerance in flax.

flax；germin－like proteins；gene cloning；saline－alkaline stress；expression analysis

S563.2

：A

1671－3532（2017）01－0012－07

2016－09－07

黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士科研啟動(dòng)金（201507－41）；國(guó)家麻類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS－19－S03）

于瑩（1981－），助理研究員，博士，主要從事亞麻分子育種研究。E－mail：yuying_1981_0451＠163.com

*

：吳廣文（1964－），研究員，主要從事亞麻遺傳育種研究。E－mail：wuguangwenflax＠163.com