響應(yīng)面法優(yōu)化火麻籽蛋白質(zhì)的提取工藝

劉淑霞，郭永霞，魏國江，韓承偉，杜春玉，潘冬梅，徐海軍，關(guān)向軍，王曉飛，郭夢(mèng)橋

（1.黑龍江省科學(xué)院大慶分院大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)大慶163319；3.大慶市綠色農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測(cè)中心大慶163319）

響應(yīng)面法優(yōu)化火麻籽蛋白質(zhì)的提取工藝

劉淑霞1，2，郭永霞2，魏國江1*，韓承偉1，杜春玉3，潘冬梅1，徐海軍1，關(guān)向軍1，王曉飛1，郭夢(mèng)橋1

（1.黑龍江省科學(xué)院大慶分院大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)大慶163319；3.大慶市綠色農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測(cè)中心大慶163319）

運(yùn)用堿提酸沉法從火麻籽中提取粗蛋白質(zhì)。研究中以提取時(shí)間、提取溫度、料液比和提取pH值為影響因素，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以火麻籽蛋白質(zhì)的提取率為指標(biāo)，確定火麻籽提取工藝參數(shù)的最佳組合。結(jié)果表明提取時(shí)間1.58 h、提取溫度49.54℃、液料比20.17：1、提取pH值10.99為蛋白質(zhì)提取的最佳條件，實(shí)際最大提取率為24.47%?；鹇樽训鞍踪|(zhì)含量較高，具有較大的開發(fā)利用價(jià)值。

火麻籽；蛋白質(zhì)；響應(yīng)面法；提取工藝

火麻（Cannabis sativa L.）又叫工業(yè)大麻，火麻籽（Hempseed）是?？浦参锘鹇榈姆N子。在我國主要分布在黑龍江、甘肅、云南、廣西、四川等地?；鹇樽褷I養(yǎng)豐富，主要含有蛋白質(zhì)、油脂、碳水化合物和可溶性纖維，以及小于0.3%的THC和人體所需的維生素和礦物質(zhì)，尤其是磷、鉀、鎂、硫、鈣，鐵和鋅等，同時(shí)，鐵和鋅是人體脂肪酸代謝所必需的輔酶成分，火麻籽中鐵和鋅的含量和比例最適合人體的需要。火麻籽還含有其他多種天然生物活性成分，是現(xiàn)代純天然食品中功能性有效成分與生理功能特性較多的功能性食品代表。因此，本試驗(yàn)以我院選育出的經(jīng)黑龍江省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)登記通過，準(zhǔn)予推廣的“火麻1號(hào)”新品種為原料，對(duì)其進(jìn)行脫脂處理后，利用堿溶酸沉法制備火麻籽蛋白，確定其最佳工藝條件，為今后火麻籽的開發(fā)利用提供了有利的技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為“火麻1號(hào)”麻籽，采自黑龍江省大慶市星火牧場(chǎng)黑龍江省科學(xué)院大慶分院試驗(yàn)基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 火麻籽粗蛋白提取

火麻籽粉碎并脫脂，在一定的溫度下，加入氫氧化鈉溶液，攪拌提取一定時(shí)間，用離心機(jī)以3 500 r/min離心20min，去沉淀，取上清液用0.05 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至一定值，4 000 r/min離心20 min分離除去上清液，將得到的蛋白質(zhì)沉淀加入4倍的蒸餾水，4 000 r/min離心20 min除去上清液，冷凍干燥48 h后稱量得火麻蛋白，設(shè)三次重復(fù)。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取率計(jì)算

脫脂火麻籽中總的蛋白質(zhì)含量按《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5－2010）測(cè)定。脫脂后火麻籽中蛋白質(zhì)的提取率以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w計(jì)，數(shù)值以百分率（%）表示，按以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：

m1—冷凍干燥后得到的蛋白質(zhì)，單位為克（g）；

m0—脫脂火麻籽中總的蛋白質(zhì)，單位為克（g）。

同時(shí)進(jìn)行三次平行測(cè)定，取其算術(shù)平均值至小數(shù)點(diǎn)后第四位。

1.2.3 火麻籽蛋白提取工藝確定

1.2.3.1 因素試驗(yàn)料液比

液料比：在溫度40℃、p H 10、時(shí)間1.5 h，液料比分別為30∶1、25∶1、20∶1、15∶1和10∶1（v/m）的條件下進(jìn)行攪拌提取，離心分離，測(cè)定上清液中的蛋白含量；提取溫度：在液料比20：1（v/m）、pH 10、時(shí)間1.5 h，溫度分別為20、30、40、50和60℃條件下進(jìn)行攪拌提取，離心分離，測(cè)定上清液中的蛋白含量；pH值：在液料比20∶1（v/m）、時(shí)間1.5 h、溫度40℃，pH值分別為8、9、10、11和12條件下進(jìn)行攪拌提取，離心分離，測(cè)定上清液中的蛋白含量；提取時(shí)間：液料比20∶1（v/m）、溫度40℃、p H 10，時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h條件進(jìn)行攪拌提取，離心分離，測(cè)定上清液中的蛋白含量。

1.2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以火麻籽蛋白質(zhì)的百分含量為因變量，以提取時(shí)間、提取溫度、料液比、pH值為自變量，采用四因素五水平二次旋轉(zhuǎn)回歸中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 各因素水平編碼表Tab.1 Levels and codes of factors

2 儀器設(shè)備

中草藥粉碎機(jī)，精密pH計(jì)，精密電子分析天平，電熱鼓風(fēng)干燥箱，離心機(jī)，超級(jí)恒溫水浴箱，數(shù)顯磁力攪拌器，遠(yuǎn)紅外消化爐，凱氏定氮儀。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同液料比對(duì)火麻籽蛋白提取率的影響

從圖1可以看出，隨著液料比的增大，蛋白質(zhì)提取率也隨之增大，但液料比超過20∶1以后，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)緩慢增長態(tài)勢(shì)。所以，在實(shí)際操作中考慮到工作量的關(guān)系，液料比不宜過高。

圖1 液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of the ratio of liquid to solid on extraction rate of protein

3.2 不同提取溫度對(duì)火麻籽粕蛋白提取率的影響

圖2 溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction rate of protein

從圖2中可以看出，溫度在20～40℃范圍蛋白質(zhì)提取率增長趨勢(shì)不明顯，40～50℃之間蛋白質(zhì)提取率增長明顯，超過50℃蛋白質(zhì)提取率明顯呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。50℃下蛋白最高提取率23.30%。

3.3 不同p H對(duì)火麻籽粕蛋白提取率的影響

圖3 pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of pH value on extraction rate of protein

從圖3中可以看出，pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響明顯，pH值8～9時(shí)表現(xiàn)蛋白質(zhì)提取率最低，pH值9～11范圍蛋白質(zhì)提取率增長較快，直到pH值11時(shí)呈現(xiàn)提取率最高，最高提取率為23. 50%，之后開始下滑。

圖4 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of protein

從圖4可以看出，提取時(shí)間0.5～1.0 h，提取率逐漸增長；從1.0～2.5 h提取率變化不明顯，說明溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響較小。

3.2 試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑴c顯著性檢驗(yàn)分析

利用Design expert8.0.6軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，回歸模型的方差分析見表3，得到二次回歸模型方程為：

表2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Experimental design and results of response surfacemethodology

同時(shí)模型的決定系數(shù)R2＝0.9644，校正系數(shù)R2＝0.9467，說明該模型能解釋94.67%響應(yīng)值的變化，與實(shí)際試驗(yàn)擬合良好，試驗(yàn)誤差小，證明應(yīng)用四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)優(yōu)化提取時(shí)間、提取pH值、提取溫度和料液比對(duì)火麻籽蛋白質(zhì)提取是可行的。

從表3中可以得出模型的F值為40.63，對(duì)應(yīng)的P＜0.0001，遠(yuǎn)小于0.01，說明所建立的模型極顯著；A、B、C、D的一次項(xiàng)及二次項(xiàng)對(duì)應(yīng)的P＜0.01，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響極顯著；交互項(xiàng)AD、BC及CD對(duì)應(yīng)的P＜0.05，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響顯著。失擬項(xiàng)的P＝0.9625，大于0.05，說明該模型擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小，所建立的模型是可行的，可用此模型對(duì)火麻籽蛋白質(zhì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。從表3中F值還能得出試驗(yàn)中各因素主次順序?yàn)椋篋＞B＞C＞A，即提取pH值＞提取溫度＞液料比＞提取時(shí)間。

表3 回歸模型的方差分析Tab.3 Variance analysis of regression model

3.2 響應(yīng)面分析

采用降維分析法研究其它兩因素條件固定在零水平時(shí)，有交互作用的兩因素對(duì)火麻籽蛋白質(zhì)百分含量的影響，即提取pH值與提取時(shí)間、液料比與提取時(shí)間和提取溫度與液料比的交互作用對(duì)火麻籽蛋白質(zhì)百分含量的影響。圖5、圖6和圖7是Design－Expert8.0.6軟件繪出三維曲面及其等高線圖，對(duì)這些因素中交互項(xiàng)之間的交互效應(yīng)進(jìn)行分析。

圖5 Y＝f（X1，X4）的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖Fig.5 Responsive surfaces plot and its contourmap of Y＝f（X1，X4）

由圖5可以看出，響應(yīng)曲面坡度相對(duì)較大，等高線呈橢圓形，表明提取時(shí)間和提取pH值兩者交互作用顯著。由等高線可知，沿提取pH值方向等高線密集，而提取時(shí)間方向等高線相對(duì)稀疏，說明提取pH值比提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值峰值的影響大。當(dāng)提取pH值在9～10.5，提取時(shí)間在1～1.6 h范圍內(nèi)，兩者存在顯著的增效作用，響應(yīng)值隨著二者的增加而增大，并達(dá)到極值。

圖6 Y＝f（X2，X3）的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖Fig.6 Responsive surfaces plot and its contourmap of Y＝f（X2，X3）

由圖6可以看出，等高線呈橢圓形，表明提取溫度和液料比兩者交互作用顯著。同時(shí)，沿超聲功率方向等高線較密集，說明提取溫度比料液比對(duì)響應(yīng)值的影響強(qiáng)度更大。當(dāng)提取溫度在30℃～40℃，料液比在15～19范圍內(nèi)，兩者存在顯著的增效作用，響應(yīng)值隨著二者的增加而增大，并達(dá)到極值。而提取溫度在40℃～50℃，料液比在19～25范圍內(nèi)，響應(yīng)值隨兩個(gè)因素的增加而降低。說明模型在試驗(yàn)范圍內(nèi)存在穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。

圖7 Y＝f（X3，X4）的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖Fig.7 Responsive surfaces plot and its contourmap of Y＝f（X3，X4）

由圖7可以看出，響應(yīng)曲面坡度相對(duì)較為陡峭，等高線呈橢圓形，表明料液比和提取pH值兩者交互作用顯著。同時(shí)，提取pH值對(duì)提取率的響應(yīng)曲面比料液比對(duì)其的響應(yīng)曲面更為陡峭，說明提取pH值比料液比對(duì)響應(yīng)值的影響強(qiáng)度更大。當(dāng)提取pH 9～10.5，料液比在10～23范圍內(nèi)，響應(yīng)值隨著二者的增加而增大。而提取pH值在10.5～11，料液比在23～25范圍內(nèi)，響應(yīng)值隨兩個(gè)因素的增加而降低。說明模型在試驗(yàn)范圍內(nèi)存在穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。

3.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與驗(yàn)證試驗(yàn)

通過優(yōu)化結(jié)果，選出“火麻1號(hào)”麻籽蛋白質(zhì)制備的最佳工藝參數(shù)，并得出麻籽蛋白質(zhì)的最大百分含量見表4。

表4 “火麻1號(hào)”麻籽蛋白質(zhì)制備的最佳工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證表Tab.4 Optimum process parameters optimization for hemp protein preparation and verification experiment results

按上述優(yōu)化試驗(yàn)條件并結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得“火麻1號(hào)”麻籽蛋白質(zhì)提取量平均值為24.47%，與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.54%，說明重復(fù)性良好，試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果可行。

4 結(jié)論

采用堿提酸沉法和響應(yīng)面試驗(yàn)確定了“火麻1號(hào)”麻籽中蛋白質(zhì)提取的最佳條件：提取時(shí)間1. 58 h、提取溫度49.54℃、料液比1∶20.17、提取pH值10.99，最大實(shí)際提取率為24.47%。“火麻1號(hào)”麻籽中蛋白質(zhì)含量較高，具有較大的開發(fā)利用價(jià)值，這對(duì)于我院培育出的火麻新品種的推廣、開發(fā)和利用具有重要的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

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Optim ization of Extraction Technology of Hemp Protein by Response Surface M ethod

LIU Shuxia1，2，GUO Yongxia2，WEIGuojiang1*，HAN Chengwei1，DU Chunyu3，PAN Dongmei1，XU Haijun1，GUAN Xiangjun1，WANG Xiaofei1，GUO Mengqiao1
（1.Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences，Daqing 163319，Heilongjiang，China；2.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China；3.Daqing Green Agricultural Products Monitoring Center，Daqing 163319，Heilongjiang，China；）

The traditionalmethod of alkaliextraction and acid precipitation was used to gain the protein of“Hemp seed No.1”in this paper.Four factors were taken into account，including extracting time，emperature，ratio of liquid to solid and pH value.Meanwhile the single factor tests and response surface experimentwere designed to get the optimal combination for the max extraction ratio of protein. The result showed that under the optimized condition of extracting time 1.58 h，extracting temperature at 49.54℃，pH 10.99，ratio of liquid to solid 20.17：1，the protein yield could reach 25.01%.Italso indicated that“Hemp seed No.1”had high content of protein，which would be of great value for futher development and utilization.

hemp seed；protein；response surfacemethod；extraction technology

R284.2

：A

1671－3532（2017）01－0037－07

2016－09－05

基金來源：黑龍江省院所基本應(yīng)用技術(shù)研究“鹽漬化土壤漢麻高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效栽培技術(shù)模式研究與示范”

劉淑霞（1982－），女，副研究員，作物栽培學(xué)與耕作學(xué)研究。E－mail：258426121＠qq.com

魏國江（1963－），男，高級(jí)農(nóng)藝師，作物遺傳育種與開發(fā)利用。E－mail：weiguojiang2008＠163.com