去泛素化酶Rpn11在套細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及其臨床病理意義

雷堅　劉小柳　張蕓　曾亮　劉志紅

摘要：目的：探討去泛素化酶Rpn11蛋白在套細(xì)胞淋巴瘤（MCL）中的表達(dá)及其臨床病理意義。方法：收集20例初治MCL的標(biāo)本及資料，以10例反應(yīng)性增生淋巴組織標(biāo)本為對照，免疫組化檢測組織中Rpn11蛋白的定位及表達(dá)，分析Rpn11表達(dá)與患者的臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果：Rpn11蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿。MCL病理組織中Rpn11蛋白表達(dá)陽性率85%，高于對照組織40%（P=0.03）。套細(xì)胞淋巴瘤組織中Rpn11蛋白表達(dá)的陽性率與患者的Ann Arbor分期、血清白蛋白水平、Ki-67指數(shù)均相關(guān)（P<0.05），與呈陰性表達(dá)的MCL比較，Rpn11陽性者分期更晚、白蛋白水平更低、Ki-67指數(shù)更高。而Rpn11表達(dá)與患者的MIPI分組、B癥狀、骨髓浸潤、pz一微球蛋白無關(guān)（P>0.05）。結(jié)論：Rpn11蛋白在MCL病理組織中的表達(dá)較對照組織為高，Rpn11可能是MCL預(yù)后較差的指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：套細(xì)胞淋巴瘤；Rpn11；去泛素化；免疫組化

中圖分類號：R733.4 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-2409（2016）05-0001-05

套細(xì)胞淋巴瘤（Mantle cell lymphoma，MCL）屬于非霍奇金淋巴瘤中成熟B細(xì)胞腫瘤的一種，以t（11；14）（q13；q32）和Cyclin D1過度表達(dá)為其分子遺傳學(xué)特征，2008年WHO將MCL定為“高度侵襲性”，80%～90%患者確診時為Ann ArborⅢ、Ⅳ期，中位生存時間3～5年。作為一種侵襲性高、早期發(fā)現(xiàn)困難的淋巴瘤，MCL發(fā)生的病理機制及疾病進展的分子基礎(chǔ)仍不明確。泛素-蛋白酶體途徑是真核生物細(xì)胞內(nèi)蛋白選擇性降解的重要途徑。泛素-蛋白酶體系通過參與癌性轉(zhuǎn)化、腫瘤進展、免疫逃逸及腫瘤耐藥等諸多代謝過程，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。臨床研究表明MCL是所有非霍奇金淋巴瘤中對蛋白酶體抑制劑最敏感的-類淋巴瘤，提示泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在套細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展中存在功能紊亂。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中去泛素化酶可以避免錯誤修飾的蛋白進入泛素化降解途徑。去泛素化酶Rpn11（Regulatory particle non-ATPase 11）是蛋白酶體19s調(diào)節(jié)亞基蓋子的組成部分，Rpn11亞基作為蛋白酶體中最保守的非ATP酶，其在蛋白酶體去泛素化過程中發(fā)揮多效性作用，但目前國內(nèi)外尚未見關(guān)于Rpn11在MCL中作用的研究報道。本研究采用免疫組化方法檢測Rpn11在MCL組織中的表達(dá)情況，探討其與MCL臨床預(yù)后指標(biāo)的關(guān)系，為MCL的臨床治療及預(yù)后評估提供相關(guān)依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

本研究收集2013年1月至2015年12月經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院病理科確診的初治MCL標(biāo)本共20例作為研究對象。所有病例均經(jīng)組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)、骨髓或外周血免疫表型確診，分期依據(jù)Ann Arbor標(biāo)準(zhǔn)，危險度分層按照套細(xì)胞淋巴瘤國際預(yù)后指數(shù)（MIPI）標(biāo)準(zhǔn)進行。收集患者臨床資料，包括性別、年齡、MIP1分組、Ann Arbor分期、是否骨髓浸潤、B癥狀、β₂-微球蛋白、血清白蛋白、Ki-67指數(shù)。另選10例反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織標(biāo)本作為對照。

1.2方法

1.2.1詘劑 Rpn11〔Anti-PSMD14 antibody（EPR4257）abl09123〕兔單克隆抗體購自abcam公司。DAB染色液試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.2.2免疫組化 所有標(biāo)本均經(jīng)10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，2.5μm厚度連續(xù)切片。4μm厚的連續(xù)切片用于免疫組化檢測，切片經(jīng)過烤片，二甲苯脫蠟，經(jīng)檸檬酸抗原修復(fù)液進行微波修復(fù)20 min，3%H₂O₂孵育10 min，非免疫血清孵育10 min，滴加Rpn11兔單克隆抗體（1：500稀釋），4℃冰箱孵育過夜。然后按照福州邁新生物技術(shù)公司DAB染色液試劑盒操作說明書染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。

1.2.3結(jié)果判定 免疫組化結(jié)果參考Friedrichs標(biāo)準(zhǔn)進行評分：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；著色細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞百分率≤5%為0分，6%～20%為1分，21%～50%為2分，≥51%為3分；染色程度與染色細(xì)胞百分率得分乘積為最后得分，>1分判為陽性表達(dá)；≤1分判為陰性表達(dá)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對資料進行統(tǒng)計分析，率的比較采用Fisher確切概率法。選擇雙向檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 MCL臨床病理資料分析

MCL患者20例，男16例，女4例；中位年齡59.5（44～77）歲；Ann Arbor分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期4例，Ⅲ期9例，Ⅳ期6例。MIPI危險度分組：低危10例（50%），中危7例（35%），高危3例（15%）。骨髓侵犯6例，脾臟受累2例，腸道受累5例。其中9例患者存在B癥狀。免疫表型顯示：MCL細(xì)胞均表達(dá)CD20和CD5，T細(xì)胞抗原CD3陰性，均表達(dá)bcl-2與Cvclin D1，CD10、bcl-6陰性或弱陽性。

2.2 Rpn11蛋白在MCL及反應(yīng)性增生淋巴結(jié)中的表達(dá)

HE染色可見腫瘤細(xì)胞呈小到中等體積的淋巴樣細(xì)胞，胞核不規(guī)則，變異性染色質(zhì)密集，核仁不明顯。Rpn11定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，呈棕黃色。實驗結(jié)果顯示MCL組織中Rpn11陽性表達(dá)率為85%（17/20），反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織中陽性表達(dá)率為40%（4/10），兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.03）。詳見圖1。

2.3 MCL患者Rpn11蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性分析

套細(xì)胞淋巴瘤組織中Rpn11蛋白表達(dá)的陽性率與患者的Ann Arbor分期、血清白蛋白水平、Ki-67指數(shù)均相關(guān)（P<0.05）；與呈陰性表達(dá)的MCL患者比較，Rpn11陽性患者的分期更晚、白蛋白水平更低、Ki-67指數(shù)更高。而Rpn11表達(dá)與患者的MIPl分組、B癥狀、骨髓浸潤、β₂-微球蛋白水平無關(guān)（P>0.05）。詳見表1。

3討論

近年來，隨著淋巴瘤分子標(biāo)志物研究的深入，如Ki-67、TP53、SOX11、IGHV等許多與MCL預(yù)后密切相關(guān)的分子標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，另外，一些有關(guān)信號通路、表觀遺傳學(xué)等的分子標(biāo)記物正在研究中。本研究通過免疫組化技術(shù)，發(fā)現(xiàn)去泛素酶Rpn11在套細(xì)胞淋巴瘤組織中表達(dá)增強，提示泛素一蛋白酶體系統(tǒng)異常參與套細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展。分析Rpn11表達(dá)與MCL臨床相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Rpn11陽性患者的分期更晚、白蛋白水平更低、Ki-67更高，提示Rpn11可能是MCL的一項預(yù)后差的指標(biāo)。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)存在于所有真生物的細(xì)胞內(nèi)，通過蛋白酶體降解泛素標(biāo)記的蛋白，是蛋白質(zhì)選擇性降解的主要方式。去泛素化通過影響細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等參與腫瘤的發(fā)生和進展。哺乳動物細(xì)胞中，3種去泛素化酶與26 s蛋白酶體相關(guān)：USP14、UCHL5和Rpn11。研究發(fā)現(xiàn)，USP14和UCHL5的小分子靶向抑制物b-AP15可以誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡，并且可以逆轉(zhuǎn)硼替佐米的耐藥，此外，b-AP15抗MM骨髓瘤活性還與下調(diào)Cyclin B1、導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期停滯相關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)，b-AP15可以誘導(dǎo)華氏巨球蛋白血癥（B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤中的一種）腫瘤細(xì)胞的凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)Rpn13在骨髓瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并且臨床前數(shù)據(jù)證實靶向Rpn13抑制劑可以逆轉(zhuǎn)蛋白酶體抑制劑bortezomib耐藥、改善骨髓瘤患者預(yù)后。以上研究結(jié)果提示，作為以Cyclin D1過表達(dá)為特征的小B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，套細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生可能與去泛素化酶功能失常相關(guān)。筆者研究發(fā)現(xiàn)Rpn11在MCL組織中陽性率較反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織高，提示除了蛋白酶體抑制劑，去泛素化酶也有可能成為MCL治療的潛在靶點，這為去泛素化酶抑制劑用于治療MCL提供了理論上的可行性。