浸潤性乳腺癌中mtDNAHV2區(qū)突變及意義

金昭延

摘要：目的 檢測乳腺癌患者mtDNA D-loop環(huán)HV2區(qū)體細(xì)胞性突變并探討它在腫瘤發(fā)生中的作用。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)像多態(tài)性（PCR-SSCP）的方法對20例浸潤性乳腺導(dǎo)管癌組織和癌旁正常組織的mtDNA非編碼區(qū)D-loop環(huán)HV2區(qū)進(jìn)行分析，將出現(xiàn)異常條帶所有標(biāo)本進(jìn)行基因測序。結(jié)果 經(jīng)PCR-SSCP檢測，在20例乳腺癌mtDNA中共發(fā)現(xiàn)7例出現(xiàn)異常條帶；測序結(jié)果顯示，7例測序標(biāo)本中，HV2區(qū)共檢測到31個(gè)新的突變位點(diǎn)，其中有3個(gè)屬于微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI），7例移碼突變，其余為點(diǎn)突變（point mutation），7個(gè)位點(diǎn)位于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。結(jié)論 浸潤性乳腺導(dǎo)管癌mtDNA HV2區(qū)是一個(gè)高度多態(tài)性和突變性的區(qū)域，它與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系。

關(guān)鍵詞：浸潤性乳腺癌；mtDNA；HV2區(qū)；聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)像多態(tài)性

Abstract：Objective To detect the effect of mutations of HV2 region of D-loop in mtDNA of the breast cancer.Methods It analysed the HV2 region of D-loop in mtDNA in the 20 cases invasive ductual breast carcinoma and 20 cases paracarcinoma tissues by PCR and PCR-single stranded conformation polymorism.Results The 7 cases exceptional bands were found from 20 breast carcinoma in all of the samples by PCR-SSCP；and the sequencing results indicated that 31 new HV2 mutations were found in 7 sequencing specimens，the 3 of them were mitochondrial microsatellite instability（MSI）；the 7 of them were frameshift mutations；others were point mutation；and the 7 of them located in the region of mtDNA replication and transcription.Conclusion The mtDNA HV2 region is a highly polymorphic and mutatble region，that could be some relations in the breast carcinoma development.

Key words：Invasive ductual breast carcinoma；mtDNA；HV2；PCR-single stranded conformation polymorism

線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）存在于細(xì)胞質(zhì)的線粒體中，是細(xì)胞內(nèi)唯一的核外遺傳物質(zhì)，由16569bp組成的雙鏈閉合環(huán)狀分子，含有自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的遺傳體系。mtDNA含有37個(gè)編碼基因，包括編碼氧化磷酸化系統(tǒng)13個(gè)蛋白質(zhì)的亞單位、2個(gè)rRNA及22個(gè)tRNA的結(jié)構(gòu)基因。由于不受組蛋白保護(hù)，修復(fù)功能不完善，很容易成為致癌物質(zhì)攻擊的標(biāo)靶。因此mtDNA的突變與細(xì)胞癌變之間的關(guān)系已經(jīng)越來越受到重視，成為研究的熱點(diǎn)。本文利用PCR-SSCP和基因測序法對mtDNA D-loop環(huán)HV2區(qū)的基因突變情況進(jìn)行了研究，并探討了突變在乳腺癌進(jìn)程中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 取自2004年5月～2005年7月延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科手術(shù)的患者，20例乳腺癌組織及相對應(yīng)的癌旁正常組織，手術(shù)后切除部分組織立即投入液氮中，后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?0例乳腺癌患者年齡為36～73歲，平均（51.15±9.54）歲，所選標(biāo)本均經(jīng)病理確診為浸潤性導(dǎo)管癌。

1.2方法

1.2.1組織DNA提取 應(yīng)用小量組織DNA提取純化試劑盒進(jìn)行組織DNA的提取，并用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白定量分析儀進(jìn)行DNA提取及純度檢測。選用GeneAmp 2400型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為HV2：5'-CTC ACG GGA GCT CTC CAT GC-3'（sense）；5'-GAC TGT TAA AAG TGC ATA CCG C-3'（antisense）；擴(kuò)增產(chǎn)物大小為403bp，在94℃預(yù)變性5分，之后進(jìn)入循環(huán)，94℃30s，退火60℃30s，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)，后72℃延伸7分，4℃冷卻。2%瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2 PCR-SSCP分析 取PCR產(chǎn)物10μl與等量的2×上樣緩沖液，98℃變性5分，冰浴15 min。然后取該變性液5μl上樣于8%聚丙烯酰氨凝膠，220伏電壓電泳3 h后，進(jìn)行銀染觀察分析條帶：1%HNO3中氧化20分，蒸餾水中沖洗2次，20s/次；12mM硝酸銀中染色30分，蒸餾水中沖洗2次，20s/次；0.28mM碳酸鈉和0.04%甲醛混合液中顯色至色帶清晰；10%冰醋酸中終止染色固定5分。

1.2.3基因測序 PCR-SSCP分析出現(xiàn)異常條帶者，用相應(yīng)的DNA再次擴(kuò)增，再經(jīng)過PCR-SSCP分析，仍出現(xiàn)異常條帶者，將PCR產(chǎn)物純化后基因測序分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果用（x±s）表示，采用單樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析檢驗(yàn)各組資料間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1組織DNA提取、PCR擴(kuò)增和PCR-SSCP結(jié)果 DNA樣本經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測，OD260/OD280均≥1.7；HV2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測均顯示單一條帶，與DNA Marker所提供的片段定位相符，說明所檢測的片段上沒有明顯的插入和缺失。結(jié)果發(fā)現(xiàn)20例乳腺癌患者中有7例患者經(jīng)過PCR-SSCP分析出現(xiàn)異常區(qū)帶。

2.2測序結(jié)果 本研究在7例乳腺癌組織mtDNA在乳腺癌組織mtDNA D-loop環(huán)HV2區(qū)，有7處發(fā)生移碼突變（單個(gè)核插入或缺失）其余均為點(diǎn)突變，轉(zhuǎn)錄因子X（TFX，nt 233-260）有2例3次突變、Y（TFY，nt 276-303）有1例次突變。共有23差異位點(diǎn)位于重鏈起始區(qū)（OH，nt 110-441）。

3 討論

mtDNA與核基因組一樣也存在不穩(wěn)定，其形式以D-loop環(huán)區(qū)（CA）n和polyC長度不穩(wěn)定多見[1-2]。Aral等[3-4]用限制性內(nèi)切酶BsaXI找到了一個(gè)迅速檢測D310多態(tài)性的一種方法。甲狀腺癌[5]、乳腺癌、膀胱癌、及子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌中均存在D310區(qū)突變。本研究中11例標(biāo)本均發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定，且都位于D310區(qū)域，D310是位于D-環(huán)區(qū)303～315的polyC序列，是實(shí)體腫瘤突變的熱點(diǎn)，其突變形式多為單堿基插入或缺失。線粒體基因組不穩(wěn)定的原因可能是活性氧的破壞﹑滑鏈錯(cuò)配和不平衡交換。并且對甲狀腺癌的研究發(fā)現(xiàn)D310區(qū)突變與腫瘤的組織類型和分化程度無關(guān)。負(fù)責(zé)mtDNA復(fù)制的DNA聚合酶γ在4個(gè)核苷酸以上的多聚核苷酸區(qū)復(fù)制的忠實(shí)性低可能是D310區(qū)具有高突變率的主要原因。D310的長度變化可能通過影響mtDNA復(fù)制或使腫瘤細(xì)胞獲得選擇性生長優(yōu)勢而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

本研究使用PCR-SSCP方法檢測測了20例乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織HV2區(qū)，共發(fā)現(xiàn)32個(gè)多態(tài)性變化。除了與基因庫記載相重復(fù)的多態(tài)性變化外，又發(fā)現(xiàn)新的多態(tài)性位點(diǎn)10個(gè)，可見HV2區(qū)是一個(gè)具有高度多態(tài)性的區(qū)域，而這種多態(tài)性反映了線粒體DNA的核苷酸順序是1981年Sanger等通過對西方人線粒體DNA測序得出的，因此在本研究中發(fā)現(xiàn)的新的多態(tài)性也可能是人種和地域差異的反映。

通過統(tǒng)計(jì)分析mtDNA基因突變浸潤性導(dǎo)管癌與乳腺纖維腺瘤無顯著性，但是乳腺纖維腺瘤的突變率要高于浸潤性導(dǎo)管癌提示線粒體變異可能是婦科惡性腫瘤形成過程中的一個(gè)早期現(xiàn)象，并持續(xù)存在于癌癥演變的全過程。但由于本研究所測例數(shù)較少，尚有待于進(jìn)一步證實(shí)。因?yàn)闄z測腫瘤細(xì)胞中的mtDNA突變比檢測核DNA（nDNA）突變要簡單可靠，因此，檢測組織細(xì)胞中mtDNA突變有可能成為一種腫瘤輔助診斷方法。

參考文獻(xiàn)：

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[5]Ding Z，Ji J，Chen G，et al.Analysis of mitochondrial DNA mutations in D-loop region in thyroid lesions.[J].Biochim Biophys Acta，2010，1800（3）：271-274.

編輯/金昊天