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    丹參川芎嗪對(duì)博來霉素誘導(dǎo)大鼠肺間質(zhì)病變的影響

    2017-02-23 13:58:17宋遠(yuǎn)圓殷寒秋殷松樓
    醫(yī)學(xué)信息 2016年36期
    關(guān)鍵詞:博來霉素羥脯氨酸

    宋遠(yuǎn)圓 殷寒秋 殷松樓

    摘要:目的 觀察丹參川芎嗪對(duì)博來霉素所致間質(zhì)性肺病大鼠肺組織病理變化及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)表達(dá)的影響。方法 45只SD雄性成年大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組模型組和丹參川芎嗪治療組(治療組),每組15只。模型組、治療組經(jīng)氣管一次性滴注博來霉素(5mg/kg)0.2ml~0.3ml復(fù)制間質(zhì)性肺病大鼠模型;對(duì)照組經(jīng)氣管滴注同體積生理鹽水;造模后第1 d起,治療組每日經(jīng)腹腔注射丹參川芎嗪2ml/kg,對(duì)照組及模型組每日經(jīng)腹腔注射同等體積生理鹽水。于第28 d處死各組大鼠,取肺組織行蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson染色觀察肺臟組織病理變化;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織TNF-α、NF-κB的表達(dá);堿樣本水解法測(cè)定肺組織中羥脯氨酸含量。結(jié)果 ①對(duì)照組未見明顯炎癥、膠原沉積及纖維化改變;模型組可見明顯肺泡炎癥、膠原沉積、纖維化改變,TNF-α、NF-κB表達(dá)明顯增高;②治療組肺泡炎和肺纖維化程度均較模型組輕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);③治療組肺組織中TNF-α、NF-κB的表達(dá)較模型組減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);④治療組羥脯氨酸(hydroxyproline)含量較模型組減少(P<0.05)。結(jié)論 TNF-α、NF-κB在模型組大鼠肺組織中水平明顯降低,提示丹參川芎嗪改善大鼠肺間質(zhì)性病變可能與抑制肺組織TNF-α、NF-κB表達(dá)、抑制膠原沉積有關(guān)。

    關(guān)鍵詞:丹參川芎嗪;肺間質(zhì)疾病;博來霉素;TNF-α、NF-κB;羥脯氨酸

    間質(zhì)性肺?。╥nterstitial lung disease,ILD)是一組主要累及肺間質(zhì)、肺泡及細(xì)支氣管的肺部彌漫性疾病,病因未明,可以是原發(fā)的,也可以繼發(fā)于多種疾病、某些藥物及石棉、粉塵等,其中結(jié)締組織病是繼發(fā)性間質(zhì)性肺病最常見病因。ILD病變進(jìn)展快,死亡率高,其共同的病理特征為不同程度的炎癥及纖維化表現(xiàn),最終可進(jìn)展為肺纖維化(pulmonary fibrosis),該病目前缺乏有效的治療手段,主要治療藥物糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑,不良反應(yīng)多且部分患者對(duì)治療反應(yīng)差,隨病情遷延,可出現(xiàn)呼吸衰竭、嚴(yán)重感染、心血管疾病等,是患者死亡的重要原因。在ILD發(fā)病機(jī)制研究中,多種細(xì)胞因子參與的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)是研究的熱點(diǎn)。TNF-α作為一種前炎癥細(xì)胞因子,在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中調(diào)節(jié)刺激其他細(xì)胞因子共同介導(dǎo)肺泡炎,在肺泡炎進(jìn)展為肺纖維化過程中發(fā)揮重要作用[1]。NF-κB家族是具有多向轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白,存在于多種細(xì)胞中,其激活后可使細(xì)胞合成并釋放大量炎性介質(zhì),進(jìn)而刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原纖維[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)丹參、川芎嗪在抗炎、抗纖維化方面有重要作用[3]。本研究觀察丹參川芎嗪對(duì)博來霉素誘導(dǎo)間質(zhì)性肺病大鼠肺組織病理變化的影響,探討丹參川芎嗪ILD發(fā)生中的治療作用及可能機(jī)制。

    1資料與方法

    1.1材料

    1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物 雄性SD大鼠45只,體質(zhì)量200~230g,由徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。平陽霉素(BLM-A5,天津太河藥業(yè)有限公司),丹參川芎嗪注射液(貴州拜特制藥有限公司)。

    1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗鼠TNF-α多克隆一抗抗體,兔抗鼠NF-κB多克隆一抗抗體,羊抗兔SP試劑盒,濃縮型DAB試劑盒(均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司),羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物工程研究所),Masson染色試劑盒(南京凱基生物工科技公司)。

    1.1.3實(shí)驗(yàn)器材 Multiskan Spectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Scientific公司),普通光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

    1.2實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1動(dòng)物分組與造模 將45只SD雄性成年大鼠在實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)一周,隨機(jī)分為3組:對(duì)照組、模型組和治療組,每組15只。參照文獻(xiàn)[4-5]進(jìn)行造模。模型組、治療組用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,仰臥固定于置于手術(shù)平板上,將手術(shù)平板置于45度傾斜,采用口-氣管插管法,將16 G腰穿針經(jīng)口-聲門插入氣管,連接1 ml注射器,緩慢注入博來霉素生理鹽水溶液(5 mg/kg)約0.2 ml~0.3 ml,繼續(xù)注入0.3 ml的空氣,注后立即將動(dòng)物直立并左右旋轉(zhuǎn),使藥液在肺內(nèi)均勻分布。

    1.2.2藥物干預(yù) 對(duì)照組大鼠同樣方法注入等體積的生理鹽水。造模后對(duì)照組和模型組每日予生理鹽水約2 ml/kg腹腔注射,治療組每日經(jīng)腹腔注射丹參川芎嗪注射液(2 ml/kg)。各組分別于氣管內(nèi)注藥后第28 d各處死大鼠。

    1.2.3肺組織標(biāo)本收集 將大鼠稱重后,以10%水合氯醛(0.3ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,固定于鼠手術(shù)板上,經(jīng)腹主動(dòng)脈放血法處死大鼠。取左肺組織放于4%多聚甲醛溶液固定。隨機(jī)在不同部位取材3塊,石蠟包埋,制作成3 μm厚的切片。同時(shí)收取右肺組織-80℃保存,測(cè)羥脯氨酸含量。

    1.3指標(biāo)檢測(cè)

    1.3.1免疫組織化學(xué)檢測(cè) TNF-α、NF-κB的表達(dá)一抗分別為兔抗鼠TNF-α多克隆抗體、NF-κB多克隆抗體,稀釋度為1:200,二抗為HRP標(biāo)記羊抗兔IgG,按免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)在高倍鏡視野(×400)下隨機(jī)取10個(gè)視野,測(cè)量細(xì)胞中陽性顆粒的平均光密度(OD),計(jì)算各平均值。

    1.3.2肺組織羥脯氨酸含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱量肺組織標(biāo)本100mg,采用堿水解法檢測(cè)各組大鼠肺組織中羥脯氨酸的含量,具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.3.3肺組織病理學(xué)檢查 光學(xué)顯微鏡下觀察肺泡炎和肺纖維化,隨機(jī)選擇10個(gè)視野,根據(jù)Szapiel等[6]方法確定。肺泡炎分為4級(jí):無肺泡肺炎0分;輕度肺泡肺炎1分;中度肺泡肺炎2分;重度肺泡肺炎3分。肺間質(zhì)纖維化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):無纖維化0分;輕度肺纖維化1分;中度肺纖維化2分;重度肺纖維化3分。

    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1大鼠一般行為改變 對(duì)照組大鼠體重增加,喜活動(dòng),毛發(fā)光澤。模型組和治療組大鼠在造模后出現(xiàn)活動(dòng)減少,精神差,飲食及飲水減少,毛發(fā)無光澤,體重下降,并出現(xiàn)呼吸急促、咳嗽及撓鼻等呼吸系癥狀,其中模型組大鼠上述表現(xiàn)最明顯,治療組大鼠一般狀況較B組好,體重下降不明顯,7 d后飲食及飲水較前增加,體重有所上升。

    2.2大鼠肺組織形病理情況 模型組大鼠肺組織HE染色可見第28天肺泡結(jié)構(gòu)破壞,支氣管壁及其周圍,血管周圍及肺間質(zhì)可見膠原形成、纖維化,見圖1;Masson染色可見明顯的藍(lán)色膠原纖維。治療組肺泡炎及纖維化程度均較模型組減輕,見圖2。

    圖1 各組大鼠肺組織病理改變(蘇木精-伊紅染色,×200)

    注:A、B、C分別代表對(duì)照組、模型組、治療組。

    圖2 各組大鼠肺組織病理改變(蘇木精-伊紅染色,×200)

    注:A、B、C分別代表對(duì)照組、模型組、治療組。

    3組動(dòng)物肺組織炎癥評(píng)分的比較對(duì)照組無明顯炎癥反應(yīng),治療組炎癥反應(yīng)較對(duì)照組重,但較模型組明顯減輕(P<0.05),見表1。

    3組動(dòng)物肺組織纖維化評(píng)分的比較對(duì)照組無明顯纖維化;治療組纖維化程度較對(duì)照組較重(P<0.05),但較模型組明顯減輕(P<0.05),見表1。

    2.3免疫組化檢測(cè)各組大鼠肺組織TNF-α表達(dá) 肺組織中TNF-α主要在胞質(zhì)表達(dá),并主要分布于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡I型上皮細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞。模型組肺組織TNF-α的表達(dá)較對(duì)照組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);治療組肺組織TNF-α的表達(dá)高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但低于模型組(P<0.05),見表2,圖3。

    圖3 各組大鼠肺組織TNF-α免疫組化染色(×200)

    注:A、B、C分別代表對(duì)照組、模型組、治療組。

    2.4免疫組化檢測(cè)各組大鼠肺組織NF-κB表達(dá) NF-κB主要在胞核表達(dá),模型組大鼠肺組織NF-κB較對(duì)照組及治療組表達(dá)明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);治療組肺組織NF-κB的表達(dá)高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但低于模型組(P<0.05),見表2,圖4。

    圖4 各組大鼠肺組織NF-κB免疫組化染色(×200)

    注:A、B、C分別代表對(duì)照組、模型組、治療組。

    2.5肺組織羥脯氨酸含量與對(duì)照組比較 模型組及治療組肺組織羥脯氨酸含量較對(duì)照組均明顯增加(P<0.05);與模型組相比,治療組大鼠肺組織羥脯氨酸含量明顯降低(P<0.05),見表3。

    3討論

    ILD常由早期的肺泡炎進(jìn)展到肺纖維化,病死率高,早期診斷和治療是阻斷ILD進(jìn)展的關(guān)鍵[7]。ILD確切的發(fā)病機(jī)制及病因尚未完全明確,其中對(duì)于細(xì)胞因子在ILD發(fā)生發(fā)展過程中的作用研究較為深入。近年來表明TNF-α在ILD患者及動(dòng)物模型中均有高表達(dá)[8-10]。TNF-α是一種多效性細(xì)胞因子,在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等方面有重要作用。TNF-α可導(dǎo)致炎癥、細(xì)胞壞死、新血管的形成,并可促進(jìn)內(nèi)皮素-1的產(chǎn)生而引起血管壁的損傷。作為重要的前炎癥細(xì)胞因子,TNF-α可以促進(jìn)lL-1、IL-2、IL-6、CCL2、PDGF、TGF-β1等細(xì)胞因子產(chǎn)生及分泌,觸發(fā)肺泡上皮細(xì)胞的"瀑布式"炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),而TGF-β1作為肺纖維化的始動(dòng)因素,是目前已知最強(qiáng)的促纖維化因子[10]。胡玉潔等[11]觀察TNF-α的特異性阻斷劑依那西普可直接阻斷MAPKs信號(hào)通路,同時(shí)可通過下調(diào)TGF-β1的表達(dá)抑制MAPKs的活化從而阻斷肺纖維化的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)中,在模型組大鼠肺組織中早期即可發(fā)現(xiàn)TNF-α的表達(dá),在第28 d,模型組大鼠肺組織TNF-α表達(dá)仍明顯高于對(duì)照組及治療組,肺泡炎及肺纖維化程度較對(duì)照組及治療組重,提示TGF-β1在肺泡炎的發(fā)生及由肺泡炎進(jìn)展為肺纖維化的過程中發(fā)揮重要作用。NF-κB是研究較多的核轉(zhuǎn)錄因子,其能介導(dǎo)TNF-α觸發(fā)過度的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,造成細(xì)胞損傷,導(dǎo)致細(xì)胞存活率明顯降低[12]。本實(shí)驗(yàn)中,NF-κB在對(duì)照組肺組織中偶有表達(dá),在模型組中,表達(dá)明顯增多,主要表達(dá)于肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞及炎癥細(xì)胞核中,提示肺組織高表達(dá)NF-κB與肺組織纖維化形成關(guān)系密切。羥脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)是膠原蛋白所特有的氨基酸,通過對(duì)肺組織中羥脯氨酸含量的測(cè)定,可以了解其膠原蛋白分解代謝狀況,因此測(cè)定HYP的含量常被用于肺纖維化的研究。本實(shí)驗(yàn)Hyp含量測(cè)定表明,對(duì)照組相比,模型組及治療組肺組織中Hyp含量增高,而治療組中Hyp含量低于同時(shí)期模型組,提示丹參川芎嗪能調(diào)節(jié)肺組織中膠原代謝,減輕肺組織膠原沉積,從而起到減輕肺纖維化的作用。

    近年來,丹參聯(lián)合川芎治療肝纖維化、肺纖維化、腎臟纖維化及心肌纖維化等方面均有報(bào)道。丹參的主要功效為祛瘀止痛,活血通經(jīng),丹參能顯著抑制白細(xì)胞聚集,減少肺內(nèi)活性物質(zhì)的產(chǎn)生,從而減輕肺損傷。有研究表明丹參可抑制NF-κB的活化,減少細(xì)胞因子炎癥介質(zhì)的合成與釋放,減少成纖維細(xì)胞的活化[13]。丹參可以增加Fas及Bax的表達(dá)并降低Bcl-2的表達(dá),促使成纖維細(xì)胞凋亡[14],而起到抗肺纖維化的作用。川芎嗪可直接清除具有細(xì)胞毒性作用的自由基,抗脂質(zhì)過氧化,具有改善微循環(huán)、擴(kuò)張小動(dòng)脈、拮抗鈣離子的作用,能抑制成纖維細(xì)胞分裂、增殖,從而起到抗組織損傷和防治肺纖維化作。川芎嗪可通過作用于TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,下調(diào)TGF-β1和Smad2/3的表達(dá)發(fā)揮抗纖維化的作用[15]。在高糖所致的慢性腹膜炎大鼠模型中,川芎嗪可拮抗大鼠腹膜間皮細(xì)胞MCP-1和NF-κBp65的表達(dá),減輕腹膜慢性炎癥,延緩腹膜纖維化的發(fā)生。丹參與川芎嗪既有相似的藥理作用,又有各自不同的作用靶點(diǎn),兩者聯(lián)合應(yīng)用可減少單藥用藥劑量,降低毒副作用。本實(shí)驗(yàn)中,我們經(jīng)氣管一次性滴注博來霉素復(fù)制間質(zhì)性肺病大鼠模型,發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間變化,模型組大鼠肺組織病理顯示從肺泡炎逐漸變?yōu)榉伍g質(zhì)纖維化,說明間質(zhì)性肺病動(dòng)物模型復(fù)制成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與模型組相比較,治療組TNF-α、NF-κB表達(dá)明顯減少,Hyp含量減低,結(jié)合病理學(xué)變化,提示腹腔注射丹參川芎嗪合劑能明顯改善博來霉素所致的肺泡炎,減輕炎癥浸潤(rùn),抑制TNF-α、NF-κB合成和分泌,抑制膠原沉積,從而減少成纖維細(xì)胞的增殖與活化,改善肺間質(zhì)性病變的預(yù)后。

    總之,丹參聯(lián)合川芎嗪能減輕肺纖維化程度,其機(jī)制可能通過抑制TNF-α及NF-κB的表達(dá),減輕炎癥反應(yīng),對(duì)肺纖維化的發(fā)生有一定預(yù)防作用。

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    編輯/申磊

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