2014、2015年度武漢地區(qū)急性呼吸道感染患兒鼻咽分泌物RSV和hMPV基因檢測分析

王曉玲，王強，夏潔

(湖北省武漢市普仁醫(yī)院，武漢430081)

2014、2015年度武漢地區(qū)急性呼吸道感染患兒鼻咽分泌物RSV和hMPV基因檢測分析

王曉玲，王強，夏潔

(湖北省武漢市普仁醫(yī)院，武漢430081)

目的 觀察2014年度和2015年度武漢地區(qū)急性呼吸道感染(ARTIs)患兒鼻咽分泌物中呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(hMPV)基因檢出情況，并分析RSV、hMPV感染的分布特點。方法 2014年1月～2015年12月收治的0～14歲的ARTIs患兒816例(2014年度456例、2015年度360例)，采集患兒鼻咽分泌物，采用RT-PCR檢測RSV G基因、hMPV F基因，通過DNA測序分析基因型。觀察RSV、hMPV感染在不同年度、季節(jié)及不同性別、年齡、病種患兒中的分布情況。結果 816例患兒中，檢出RSV 187例，其中2014年度109例、2015年度78例；檢出hMPV 116例，其中2014年度69例、2015年度47例；2014年度和2015年度hMPV、RSV的檢出率差異均無統(tǒng)計學意義。1～2歲年齡組患兒hMPV檢出率最高，5歲以內患兒hMPV檢出率高于90%；5歲以內患兒RSV檢出率也較高，高于90%。喘息性支氣管炎、毛細支氣管炎患兒hMPV檢出率顯著高于其他感染部位(P均<0.05)，上呼吸道感染、支氣管炎、支氣管肺炎患兒hMPV檢出率較低(10%左右)；支氣管肺炎、毛細支氣管炎患兒RSV檢出率高于其他感染部位(P均<0.05)，喘息性支氣管炎患兒RSV檢出率最低。每年2～3月hMPV、RSV檢出率最高，6～9月最低?；蛐头治鲲@示，2014、2015年度患兒檢出RSV基因型均以A型為主，2014年度患兒檢出hMPV基因型以A2型為主、2015年度以B型為主。結論 RSV和hMPV是武漢地區(qū)ARTIs患兒常見的病原體，RSV、hMPV感染多發(fā)生在5歲以下患兒，且多發(fā)于冬季和早春；RSV感染與支氣管肺炎、毛細支氣管炎有關，hMPV感染與喘息性支氣管炎、毛細支氣管炎有關；RSV流行毒株以A型為主，hMPV流行毒株在2014、2015年度存在差異。

呼吸道感染；呼吸道合胞病毒；人偏肺病毒；兒童；武漢市

急性呼吸道感染(ARTIs)是兒童住院和死亡的主要原因之一，其中5歲以下患兒病死率較高[1]。病毒和細菌感染均能引起ARTIs，以病毒感染最為常見，主要包括呼吸道合胞病毒(RSV)感染和人偏肺病毒(hMPV)感染[2～4]。研究[4,5]表明，RSV和hMPV感染的分布與季節(jié)、地域和人群密切相關，不僅在不同地區(qū)或同一地區(qū)的不同年份、季節(jié)分布有所差異，毒株基因型和所引起疾病的臨床癥狀也可能存在差異。為此，我們觀察了武漢市2014、2015年度ARTIs患兒鼻咽分泌物中RSV、hMPV基因檢出情況，并分析RSV、hMPV感染的分布特點，以期為疾病的防控提供一定參考。

1.1 臨床資料 以武漢市普仁醫(yī)院兒科2014年1月～2015年12月收治的0～14歲的ARTIs患兒為研究對象，排除持續(xù)性哮喘>7 d者?；純褐?，<1歲132例(2014年度78例、2015年度54例)、1～2歲255例(2014年度141例、2015年度114例)、3～5歲343例(2014年度185例、2015年度158例)、6～14歲86例(2014年度52例、2015年度34例)，上呼吸道感染97例(2014年度63例、2015年度34例)、支氣管炎240例(2014年度134例、2015年度106例)、喘息性支氣管炎32例(2014年度21例、2015年度11例)、支氣管肺炎411例(2014年度215例、2015年度196例)、毛細支氣管炎36例(2014年度23例、2015年度13例)。2014、2015年度納入患兒性別、感染部位和年齡差異無統(tǒng)計學意義。患兒于入院2 h內采用負壓吸引器收集鼻咽分泌物，置于2 mL病毒運輸液中，4～10 ℃保存，24 h內送至實驗室以備后續(xù)檢測。

1.2 RSV、hMPV基因檢測 提取鼻咽分泌物中的病毒RNA，進行逆轉錄反應得到cDNA，進行PCR反應。目的基因引物均由上海英俊生物技術有限公司合成。hMPV F基因上游引物序列為5′-CTTTGGACTTAATGACAGATG-3′，下游引物序列為5′-GTCTTCCTGTGCTAACTTTG-3′，產(chǎn)物長度450 bp[6]；RSV G基因C端上游引物序列為5′-ATGATTWYCAYTTTGAAGTGTTC-3′，下游引物序列為5′-GTTATGACACTGGTATACCAACC-3′，RSV A型產(chǎn)物長度665 bp，RSV B型產(chǎn)物長度為740 bp[7]。以GAPDH為內參。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s維持40個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.3 RSV、hMPV DNA測序及基因型分析 回收PCR產(chǎn)物，送至上海英俊生物技術有限公司進行DNA測序。RSV G基因C端PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA測序后與PubMed中的Blast DNA序列進行比對確認，再根據(jù)PCR產(chǎn)物長度確認RSV A型(665 bp)或B型(740 bp)。hMPV F基因的DNA測序結果采用Clustal W2軟件進行序列比對，以GenBank中已有的A1、A2、B1、B2基因型參考序列為參照，分析hMPV的基因型。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；計量資料以中位數(shù)表示，采用Wilcoxon秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 hMPV、RSV基因檢出情況 816例患兒中共檢出hMPV 116例(14.22%)、RSV 187例(22.92%)，其中2014年度檢出hMPV 69例(15.13%)、RSV 109例(23.90%)，2015年度檢出hMPV 47例(13.06%)、RSV 78例(21.67%)。2014年度和2015年度hMPV、RSV的檢出率差異均無統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.2 2014年度及2015年度不同性別、年齡、感染部位患兒hMPV和RSV基因檢出情況 不同性別患兒hMPV、RSV檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。2014年度及2015年度不同年齡、感染部位患兒hMPV和RSV基因檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；1～2歲年齡組患兒hMPV檢出率最高，5歲以內患兒hMPV檢出率高于90%；5歲以內患兒RSV檢出率高于90%。喘息性支氣管炎、毛細支氣管炎患兒hMPV檢出率顯著高于其他感染部位(P均<0.05)，上呼吸道感染、支氣管炎、支氣管肺炎患兒hMPV檢出率較低(10%左右)；支氣管肺炎、毛細支氣管炎患兒RSV檢出率高于其他感染部位(P均<0.05)，上呼吸道感染、支氣管炎患兒RSV檢出率也較高，喘息性支氣管炎患兒RSV檢出率最低。詳見表1。

表1 2014年度及2015年度不同性別、年齡、感染部位患兒hMPV和RSV基因檢出情況

2.3 hMPV、RSV感染的季節(jié)分布 每年2～3月hMPV、RSV檢出率最高，6～9月最低。ARTIs患兒hMPV、RSV感染主要集中在冬春季發(fā)生(見圖1)。

2.4 患兒hMPV、RSV基因型分布 本次受檢標本中hMPV A1、A2、B1、B2四種基因型的毒株均被檢出，分別為4、66、26、21例；除罕見基因型A1型外，其他三種基因型的流行存在年度差異，2014年主要以A2型為主(88.4%，61/69)，2015年以B1(47.8%，22/46)和B2(39.1%，18/46)型為主。在RSV陽性標本中，RSV A型130例，其中2014年度83例、2015年度47例；RSV B型56例，其中2014年度26例、2015年度30例；2014、2015年度RSV基因型均以A型為主，但2015年度RSV B型所占比例高于2014年度(P<0.05)。

圖1 不同月份hMPV、RSV檢出情況

3 討論

病毒感染是兒童ARTIs的重要原因之一，RSV是最常見的呼吸道病毒，hMPV感染也被證實具有普遍性[8]。為了解武漢地區(qū)ARTIs患兒RSV、hMPV感染情況，我們對我院2014、2015年度收治的816例ARTIs患兒鼻咽分泌物標本進行了RSV、hMPV基因檢測，并將PCR擴增出的特異性核酸片段進行DNA測序和基因型分析。

所收集的816例標本中共檢出hMPV陽性116例(14.22%)、RSV陽性187例(22.92%)，2014、2015年度hMPV和RSV的檢出率差異均無統(tǒng)計學意義。不同性別患兒RSV、hMPV檢出情況無統(tǒng)計學差異，但在不同年齡組中有明顯差異。我們發(fā)現(xiàn)，90%的RSV、hMPV陽性標本來自5歲以下患兒，hMPV陽性標本最多來自1～2歲患兒，這與相關報道基本一致[3,4]。

我們觀察了不同感染部位患兒鼻咽分泌物標本中RSV、hMPV檢出情況，發(fā)現(xiàn)上呼吸道感染、支氣管炎、支氣管肺炎患兒hMPV檢出率較低，均在10%左右；而喘息性支氣管炎、毛細支氣管炎患兒hMPV檢出率顯著高于其他感染部位；支氣管肺炎、毛細支氣管炎患兒RSV檢出率高于其他感染部位，RSV在上呼吸道感染和支氣管炎患兒標本中也有較高的檢出率，但在喘息性支氣管患兒標本中檢出率最低。這提示RSV、hMPV感染均與毛細支氣管炎高度相關，hMPV感染還與喘息性支氣管炎有關，而RSV感染與支氣管肺炎的發(fā)病也有一定相關性。

在溫帶地區(qū)，冬季和早春是RSV、hMPV感染的高發(fā)時段。本研究結果顯示，武漢地區(qū)ARTIs患兒標本中RSV、hMPV的最高檢出率也出現(xiàn)在冬季和早春，檢出率最高峰出現(xiàn)在每年2～3月，6～9月檢出率最低。這提示武漢地區(qū)RSV和hMPV的流行特點為全年散發(fā)，冬春季高發(fā)，兩者流行高峰同步出現(xiàn)。

RSV基因型分布存在地域差異，總體以A型為主，不同年份中A、B亞型可共同流行或以一種亞型為主。本研究2014年度收集的標本中檢出RSV A型83例(76.1%)、RSV B型為26例(23.9%)，2015年度檢出RSV A型47例(60.3%)、RSV B型30例(39.7%)，兩年度均以RSV A型流行為主。hMPV是單負鏈RNA病毒，根據(jù)F基因的核酸序列變異情況可將hMPV分為A、B兩大基因型。在不同年份，hMPV流行的基因型會發(fā)生明顯變化[9]。本研究結果顯示，武漢地區(qū)ARTIs患兒標本中同時檢出了hMPV A1、A2、B1、B2四種基因型，其中2014年度主要以A2亞型為主(88.4%)，2015年度以B1(47.8%)、B2(39.1%)亞型為主；A1亞型為罕見基因型，在兩年度中檢出率均小于5%，這與相關報道基本一致[9～11]。

本研究表明，RSV和hMPV是武漢地區(qū)ARTIs患兒常見的病原體，RSV感染主要集中在<5歲患兒，hMPV感染主要集中在<2歲患兒；RSV感染與支氣管肺炎、毛細支氣管炎有顯著相關性，hMPV感染與喘息性支氣管炎、毛細支氣管炎的發(fā)病有關；冬季和早春是RSV、hMPV感染高發(fā)時段；RSV以A型毒株流行為主，而hMPV流行基因型在不同年份有明顯改變。

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王曉玲(E-mail: wxl76329@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.027

R511；R725.6

B

1002-266X(2017)03-0084-03

2016-09-26)