宮頸鱗癌組織中跨膜受體蛋白Notch3的表達變化及其意義

高薇薇，張青，馮佳，黃芳，王偉，張曙

(南通大學附屬醫(yī)院，江蘇南通226001)

宮頸鱗癌組織中跨膜受體蛋白Notch3的表達變化及其意義

高薇薇，張青，馮佳，黃芳，王偉，張曙

(南通大學附屬醫(yī)院，江蘇南通226001)

目的 觀察宮頸鱗癌組織中跨膜受體蛋白Notch3的表達變化，并探討其意義。方法 收集宮頸鱗癌組織石蠟標本及其對應(yīng)的正常宮頸組織石蠟標本各116例、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ+Ⅱ級病灶石蠟標本53例及CINⅢ級病灶石蠟標本41例，采用免疫組化法檢測各標本中的Notch3，分析Notch3表達與宮頸鱗癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 宮頸鱗癌組織、正常宮頸組織、CIN Ⅲ級組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級組織中Notch3的陽性表達率分別為52.6%、21.6%、43.9%和41.5%，宮頸鱗癌組織中Notch3的陽性表達率高于正常宮頸組織、CIN Ⅲ級組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級組織，CIN Ⅲ級組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級組織中Notch3的陽性表達率高于正常宮頸組織(P均<0.01)。Notch3表達與宮頸鱗癌肌層浸潤深度、組織分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。Notch3表達陽性者和Notch3表達陰性者中位生存期分別為43、62.3個月，兩者相比，P<0.05。Notch3表達陽性者1年生存率為93.4%、3年生存率為60.7%、5年生存率為31.1%，Notch3表達陰性者分別為98.2%、83.6%、60.0%，二者1、3、5年生存率相比，P均<0.05。結(jié)論 宮頸鱗癌組織中Notch3陽性表達率升高，Notch3表達與腫瘤肌層浸潤深度、組織分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，Notch3可能參與了宮頸鱗癌的發(fā)生及發(fā)展。

宮頸癌；宮頸鱗癌；跨膜受體蛋白；Notch3；Notch信號通路；宮頸上皮內(nèi)瘤變

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，近年來呈現(xiàn)發(fā)病年輕化趨勢。鱗癌是宮頸癌最常見的組織學類型[1]。早期宮頸鱗癌患者預(yù)后較好，手術(shù)治療、放化療、免疫治療及中醫(yī)藥治療等方式有助于延長患者生命，故宮頸鱗癌的早期診斷意義重大[2]?？缒な荏w蛋白Notch信號通路在腫瘤發(fā)生過程中的作用是近年研究的熱點，現(xiàn)已證實Notch信號通路參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化等過程[3]。Notch3是Notch受體家族的重要成員，廣泛存在于多種組織細胞中。本研究觀察了宮頸鱗癌組織中Notch3的表達變化，探討Notch3與宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及與宮頸鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 宮頸鱗癌組織標本及其來源 收集南通大學附屬醫(yī)院病理科2009年1月～2010年12月獲取并留存的宮頸鱗癌組織石蠟標本及其對應(yīng)的正常宮頸組織石蠟標本各116例，宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ+Ⅱ級病灶石蠟標本53例及CIN Ⅲ級病灶石蠟標本41例。宮頸鱗癌標本來源病例均為原發(fā)病例，術(shù)前未經(jīng)過放化療、免疫治療或中藥治療。宮頸鱗癌患者年齡27～74歲，年齡<46歲61例、≥46歲55例；97例患者術(shù)后采取單純放療、放化療聯(lián)合治療、免疫治療或中藥治療，19例患者術(shù)后未采取輔助治療。CIN Ⅰ+Ⅱ級患者年齡26～69歲，<49歲31例、≥49歲22例。CIN Ⅲ級患者年齡29～77歲，<47歲19例、≥47歲22例。所有病例均具有完整的臨床病理資料，隨訪日期截止至2015年12月31日，所有患者均獲得隨訪。

1.2 宮頸鱗癌組織中Notch3的檢測 采用免疫組化EnVision法，所有標本經(jīng)4%甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片；切片經(jīng)70 ℃烘烤45 min，二甲苯脫蠟，檸檬酸修復(fù)液(pH 6.0)高溫高壓修復(fù)20 min，30%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗(兔抗人Notch3多克隆抗體，1∶200)，冰箱內(nèi)4 ℃過夜，滴加二抗；DAB顯色，復(fù)染，0.1%鹽酸酒精分化，脫水，封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知的陽性切片作為陽性對照。Notch3可定位于細胞質(zhì)、細胞膜和細胞核，陽性染色表現(xiàn)為細胞核出現(xiàn)黃色至棕黃色細小顆粒。在每張切片選取具有代表意義的5個高倍視野，每個視野計數(shù)250個細胞。根據(jù)陽性細胞百分比和染色強度綜合判定結(jié)果：陽性細胞百分比<5%計0分，5%～<25%計1分，25%～<50%計2分，50%～<75%計3分，≥75%計4分；染色強度為淺黃色或無色計0分，黃色計1分，深棕色計2分，棕褐色計3分；上述兩項得分乘積為0～6判定為Notch3無或低表達(即陰性)，7～12判定為Notch3高表達(即陽性)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。做Kaplan-Meier生存曲線進行預(yù)后分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸鱗癌組織中Notch3的表達變化 宮頸鱗癌組織、正常宮頸組織、CIN Ⅲ級組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級組織中Notch3的陽性表達率分別為52.6%(61/116)、21.6%(25/116)、43.9%(18/41)和41.5%(22/53)，宮頸鱗癌組織中Notch3的陽性表達率高于正常宮頸組織、CIN Ⅲ級組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級組織，CIN Ⅲ級組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級組織中Notch3的陽性表達率高于正常宮頸組織(P均<0.01)。

2.2 Notch3表達與宮頸鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Notch3表達與宮頸鱗癌肌層浸潤深度、組織分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、腫瘤最大徑無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 Notch3表達與宮頸鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 Notch3表達與宮頸鱗癌預(yù)后的關(guān)系 Notch3表達陽性者中位生存期為43個月，Notch3表達陰性者中位生存期為62.3個月，兩者相比，P<0.05。Notch3表達陽性者1年生存率為93.4%、3年生存率為60.7%、5年生存率為31.1%，Notch3表達陰性者分別為98.2%、83.6%、60.0%，二者1、3、5年生存率相比，P均<0.05(見圖1)。

圖1 Notch3表達與宮頸鱗癌患者生存時間的關(guān)系

3 討論

宮頸鱗癌的發(fā)生是多種因素、多基因參與的過程，宮頸鱗癌預(yù)后影響因素很多，治療效果并不十分理想[4]。因此，尋找宮頸鱗癌的特異性治療靶點意義重大。Notch信號通路是近年討論的熱點。Notch信號通路是哺乳動物進化過程中高度保守的信號通路，在胚胎發(fā)育過程中，Notch受體與配體結(jié)合后可發(fā)生活化，活化的Notch受體直接轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合，激活靶基因，此過程不依賴第二信使的信號通路發(fā)揮作用，具有自身特殊性。但由于Notch信號通路中含有多個受體與配體，激活Notch同時可激活其他多種信號通路[5,6]。Notch信號通路在腫瘤及神經(jīng)退行性變發(fā)病、免疫功能調(diào)控、胚胎發(fā)育、血管生成等病理生理過程中起著重要作用[7,8]。由Notch基因編碼的Notch受體在細胞分化進程中起整體協(xié)調(diào)作用，在細胞發(fā)育成熟后則呈現(xiàn)低水平表達。在哺乳動物體內(nèi)，Notch受體是在細胞表面表達的Ⅰ型跨膜蛋白，主要含有Notch1、2、3、4四個亞型。其中，Notch3最早在增生的神經(jīng)上皮細胞中被發(fā)現(xiàn)，19號染色體易位往往會導(dǎo)致Notch3過表達。Notch3與Notch家族其他成員存在高度相似性，但在結(jié)構(gòu)上有所差異，主要是其胞內(nèi)段的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(TAD)較其他成員明顯縮短，因此，Notch3的轉(zhuǎn)錄激活性能相對較弱[3]。

目前，多項研究[9～11]發(fā)現(xiàn)Notch3涉及人類多種實體腫瘤的生成過程，如非小細胞肺癌(NSCLC)、食管鱗癌、急性T淋巴細胞白血病、卵巢漿液性癌等。研究[12,13]發(fā)現(xiàn)Notch1能誘導(dǎo)HIF-1表達，調(diào)節(jié)VEGF表達，促進腫瘤血管生成，促進NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移。Ohashi等[14～16]的研究結(jié)果顯示，特異性阻斷Notch3表達后NSCLC細胞增殖受到明顯限制，推測機制是腫瘤細胞對EGFR酪氨酸激酶抑制劑的敏感性增強，減少腫瘤細胞中MAPK磷酸化水平，從而抑制腫瘤細胞增殖。Liu等[17]發(fā)現(xiàn)食管鱗癌細胞中Notch3呈高表達，Notch3參與誘導(dǎo)鱗狀細胞分化和浸潤性生長。學者們在關(guān)于急性T淋巴細胞白血病的研究[18]和關(guān)于卵巢漿液性癌的研究[19]中也得出了類似結(jié)論。還有研究[20,21]發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細胞株OVCA429中，激活Notch3能激活Slug、Snail信號通路，降低E-鈣黏蛋白表達，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。我們推測在宮頸鱗癌組織中的Notch3陽性率可能同樣增加，Notch3表達與宮頸鱗癌患者的預(yù)后可能存在一定關(guān)聯(lián)。

本研究分別檢測了宮頸鱗癌、CIN Ⅰ+Ⅱ級病灶、CIN Ⅲ級病灶及正常宮頸組織中的Notch3，結(jié)果顯示，宮頸鱗癌組織中Notch3的陽性表達率高于正常宮頸組織、CIN Ⅲ級組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級組織，CIN Ⅲ級組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級組織中Notch3的陽性表達率高于正常宮頸組織，Notch3表達與宮頸鱗癌肌層浸潤深度、組織分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示Notch3可能參與了宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。進一步分析顯示，Notch3表達陽性者中位生存期短于Notch3表達陰性者，Notch3表達陽性者1、3、5年生存率小于Notch3表達陰性者，提示Notch3的表達預(yù)示著宮頸鱗癌患者預(yù)后不良，可能是由于Notch3促進了上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，具體機制待進一步證實。

盡管已有許多研究對宮頸鱗癌的發(fā)病機制進行闡述，但仍未有重大突破。結(jié)合本研究結(jié)果，我們認為，Notch3可能有癌基因的性質(zhì)，其高表達與宮頸鱗癌的發(fā)生、進展密切相關(guān)，Notch3有望作為宮頸鱗癌潛在的治療靶點。

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張曙(E-mail: tdfyzs@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.022

R737.33

B

1002-266X(2017)03-0070-03

2016-08-12)