小鼠糖尿病腎病足細(xì)胞NOD2 mRNA表達(dá)變化及其意義

寧晉靈，高穎

(1天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津300070；2天津市南開(kāi)區(qū)三潭醫(yī)院)

小鼠糖尿病腎病足細(xì)胞NOD2 mRNA表達(dá)變化及其意義

寧晉靈1,2，高穎1

(1天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津300070；2天津市南開(kāi)區(qū)三潭醫(yī)院)

目的 觀察糖尿病腎病(DKD)小鼠足細(xì)胞中細(xì)胞核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2(NOD2) mRNA的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 將分化完全的小鼠足細(xì)胞接種至6孔板，分為DKD組和NC組。DKD組分別加入25、50 mmol/L的膜過(guò)濾葡萄糖溶液刺激24 h制備DKD足細(xì)胞模型；NC組不給予糖刺激。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)兩組細(xì)胞中的NOD2 mRNA。選取上一實(shí)驗(yàn)中篩選出的最適濃度葡萄糖刺激足細(xì)胞制作DKD模型，分為胞壁酰二肽(MDP)組、shRNA組和模型組。MDP組給予2 g/mL的MDP刺激，shRNA組轉(zhuǎn)染NOD2 shRNA，模型組常規(guī)培養(yǎng)，24 h后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中的NOD2、nephrin、腫瘤壞死因子α(TNF-α) mRNA。結(jié)果 DKD組細(xì)胞中NOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于NC組，DKD組中50 mmol/L亞組NOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于25 mmol/L亞組(P均<0.05)。MDP組細(xì)胞中NOD2、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量高于模型組，nephrin mRNA相對(duì)表達(dá)量低于模型組(P均<0.05)；shRNA組細(xì)胞中NOD2、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量低于模型組，nephrin mRNA相對(duì)表達(dá)量高于模型組(P均<0.05)。結(jié)論 DKD小鼠足細(xì)胞中NOD2 mRNA表達(dá)上調(diào)，NOD2 mRNA高表達(dá)時(shí)足細(xì)胞損傷加重，NOD2 mRNA低表達(dá)時(shí)足細(xì)胞損傷減輕；NOD2 mRNA表達(dá)變化可能與DKD的發(fā)病及病情進(jìn)展有關(guān)。

糖尿病腎??；足細(xì)胞；細(xì)胞核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2；nephrin；腫瘤壞死因子α；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

隨著研究不斷深入，糖尿病腎病(DKD)被認(rèn)為是一種由固有免疫系統(tǒng)參與的、有大量免疫細(xì)胞及炎癥介質(zhì)浸潤(rùn)的炎癥反應(yīng)。nephrin是足細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其基因表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致腎損傷及蛋白尿出現(xiàn)，nephrin表達(dá)水平可反映腎臟結(jié)構(gòu)性變化[1]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)由腎臟固有細(xì)胞等合成，通過(guò)生成活性氧簇影響正常腎小球血流、破壞腎小球?yàn)V過(guò)功能，其水平可反映腎損傷程度[2]。細(xì)胞核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2(NOD2)是模式識(shí)別受體(PRRs)NOD蛋白家族中的一員[3]，研究[4]顯示，NOD2基因敲除的DKD小鼠模型腎臟損傷程度減輕。胞壁酰二肽(MDP)是目前體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的NOD2的惟一特異性激動(dòng)劑[5，6]。考慮到足細(xì)胞病理改變始發(fā)于DKD最早期[7,8]，而NOD2與足細(xì)胞的關(guān)系鮮有報(bào)道，故本研究觀察了DKD小鼠足細(xì)胞中NOD2 mRNA的表達(dá)變化，及其對(duì)足細(xì)胞損傷程度(以nephrin、TNF-α mRNA表達(dá)變化表示)的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 小鼠足細(xì)胞由蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司提供(編號(hào)BNCC337685)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)Bio-Rad Cycler System公司產(chǎn)品。所用shRNA由江蘇南通百奧邁科生物科技有限公司構(gòu)建。MDP購(gòu)自湖北鴻運(yùn)隆生物科技有限公司。

1.2 DKD足細(xì)胞中NOD2 mRNA表達(dá)觀察 將分化完全的足細(xì)胞接種至6孔板，分為DKD組和NC組。DKD組分別加入25、50 mmol/L的膜過(guò)濾葡萄糖溶液刺激24 h制備DKD足細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞足突融合，即判定符合DKD的早期病理改變，模型制作成功[9]；NC組不給予糖刺激。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)兩組細(xì)胞中的NOD2 mRNA，以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。觀察DKD組足細(xì)胞足突融合情況，篩選最佳葡萄糖作用濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 NOD2 mRNA表達(dá)變化對(duì)DKD足細(xì)胞損傷的影響觀察 將DKD足細(xì)胞模型(“1.2”實(shí)驗(yàn)中選取的最佳作用濃度的葡萄糖刺激足細(xì)胞獲得)分為MDP組、shRNA組和模型組。MDP組給予2 g/mL的MDP刺激24 h；shRNA組依據(jù)文獻(xiàn)[10]方法轉(zhuǎn)染NOD2 shRNA 24 h；模型組常規(guī)培養(yǎng)24 h。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中的NOD2、nephrin、TNF-α mRNA，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

2 結(jié)果

2.1 DKD足細(xì)胞中NOD2 mRNA的表達(dá)變化 25、50 mmol/L葡萄糖刺激的DKD組足細(xì)胞中NOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.82±0.15、2.78±0.20，NC組為1.00±0.00，其中DKD組NOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于NC組，DKD組中50 mmol/L亞組NOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于25 mmol/L亞組(P均<0.05)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用50 mmol/L的葡萄糖。

2.2 NOD2表達(dá)變化對(duì)DKD足細(xì)胞損傷的影響 MDP組足細(xì)胞中NOD2、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量高于模型組，nephrin mRNA相對(duì)表達(dá)量低于模型組(P均<0.05)；shRNA組足細(xì)胞中NOD2、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量低于模型組，nephrin mRNA相對(duì)表達(dá)量高于模型組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞中NOD2、nephrin、TNF-α mRNA表達(dá)比較

注：與DKD組相比，*P<0.01。

3 討論

幾乎所有的多細(xì)胞生物體都存在由固有免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答反應(yīng)同樣貫穿腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。NOD是PRRs中的一大家族成員，其中最受關(guān)注的NOD2包含2個(gè)Caspase募集區(qū)域(CARD)，可識(shí)別肽聚糖中的MDP并因此被激活，導(dǎo)致NF-κB活化，啟動(dòng)致炎因子轉(zhuǎn)錄并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[11]。NOD2除表達(dá)于炎癥細(xì)胞外，也存在于其他組織細(xì)胞中[12]。NOD2與DKD相關(guān)性的報(bào)道并不多見(jiàn)，但考慮炎癥反應(yīng)在DKD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且NOD2承接著固有免疫系統(tǒng)及炎癥反應(yīng)的進(jìn)行，因此我們推測(cè)NOD2在DKD發(fā)病中發(fā)揮一定作用。

蛋白尿是DKD最早期的臨床表現(xiàn)，而作為腎小球?yàn)V過(guò)膜組成部分的足細(xì)胞可通過(guò)調(diào)節(jié)足突細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)阻止蛋白尿的生成。nephrin在維持足細(xì)胞完整性及腎小球?yàn)V過(guò)屏障正常生理功能中發(fā)揮重要作用，可協(xié)調(diào)足細(xì)胞外信號(hào)向裂孔隔膜肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的傳遞過(guò)程。大量研究結(jié)果顯示，nephrin基因突變可導(dǎo)致嚴(yán)重的蛋白尿及腎損傷，且合并蛋白尿的患者均伴有該基因表達(dá)下調(diào)。此外，腎足細(xì)胞與胰島素相互應(yīng)答反應(yīng)的過(guò)程需要依賴(lài)nephrin的調(diào)控，若nephrin基因沉默可使足細(xì)胞在糖攝取時(shí)喪失對(duì)胰島素的敏感性[13,14]，使得胰島素?zé)o法重構(gòu)足細(xì)胞骨架蛋白，造成足細(xì)胞胰島素抵抗及糖中毒，破壞足細(xì)胞生理功能，形成蛋白尿。因此，我們認(rèn)為nephrin可在一定程度上反映DKD早期病理生理變化。TNF-α在炎癥反應(yīng)中有廣泛的調(diào)節(jié)聯(lián)動(dòng)功能，可誘導(dǎo)NF-κB激活，增加INF-γ、IL-1、CRP等炎癥因子及趨化因子的合成[15]，啟動(dòng)、維持炎癥反應(yīng)的進(jìn)行[16]。相關(guān)研究[17，18]顯示，TNF-α可激活Caspase家族信號(hào)通路，進(jìn)一步上調(diào)NOD2表達(dá)。

本研究采用高糖刺激建立DKD小鼠足細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)高糖刺激可誘導(dǎo)腎足細(xì)胞形成DKD病理改變，并導(dǎo)致NOD2 mRNA高表達(dá)，且呈現(xiàn)一定濃度依賴(lài)性，推測(cè)NOD2 mRNA高表達(dá)可能與DKD的發(fā)病有關(guān)。我們選擇50 mmol/L的葡萄糖用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)制作DKD模型，通過(guò)檢測(cè)nephrin、TNF-α mRNA，觀察NOD2表達(dá)上調(diào)或下調(diào)對(duì)DKD足細(xì)胞損傷的影響。本研究結(jié)果顯示，MDP組足細(xì)胞中NOD2、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量高于模型組，nephrin mRNA相對(duì)表達(dá)量低于模型組，提示隨NOD2表達(dá)上調(diào)，腎足細(xì)胞功能減弱，炎癥反應(yīng)亢進(jìn)；shRNA組足細(xì)胞中NOD2、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量低于模型組，nephrin mRNA相對(duì)表達(dá)量高于模型組，提示隨著NOD2表達(dá)水平下調(diào)，足細(xì)胞功能改善，炎癥反應(yīng)減輕[19]。NOD2可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并通過(guò)某種機(jī)制負(fù)調(diào)節(jié)nephrin基因表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致DKD早期病理生理改變。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們推測(cè)，DKD早期發(fā)病機(jī)制為：機(jī)體第一道免疫防線受到刺激，NOD2被激活并通過(guò)活化的NF-κB啟動(dòng)早期炎癥反應(yīng)，釋放炎癥因子，其中TNF-α對(duì)NOD2有正向調(diào)節(jié)作用[18]，致炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)展；與此同時(shí)，受到炎癥影響的腎足細(xì)胞生理結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，加之NOD2的負(fù)向調(diào)節(jié)，nephrin蛋白表達(dá)受抑制，下調(diào)足細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，導(dǎo)致足細(xì)胞胰島素抵抗及高糖反應(yīng)，腎小球?yàn)V過(guò)功能受損，最終形成蛋白尿。NOD2可能是DKD早期足細(xì)胞病理改變的誘導(dǎo)因素之一。有學(xué)者[20]指出，糖尿病相關(guān)腎損害在糖尿病前期階段就已經(jīng)發(fā)生，這一發(fā)現(xiàn)將早期診斷DKD的重要性提到了更高層面。我們認(rèn)為，NOD2在DKD的早期診斷方面可能有重要價(jià)值，且有望成為DKD的治療靶點(diǎn)。

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高穎(E-mail: 120818667@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.013

R3

A

1002-266X(2017)03-0045-03

2016-01-18)