SENP1基因沉默的人Ⅱ型肺泡上皮細胞系構(gòu)建

趙許，董文斌，雷小平，李清平，康蘭，趙帥，張嬋

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

SENP1基因沉默的人Ⅱ型肺泡上皮細胞系構(gòu)建

趙許，董文斌，雷小平，李清平，康蘭，趙帥，張嬋

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

目的 構(gòu)建穩(wěn)定沉默SUMO特異性蛋白酶1(SENP1)基因的人Ⅱ型肺泡上皮細胞系HEPApiC。方法 構(gòu)建沉默SENP1基因的LV3-SENP1-RNAi慢病毒載體。將HEPApiC細胞分為實驗組、對照組、空載組，實驗組感染LV3-SENP1-RNAi，空載組感染空載體，對照組不做特殊處理；感染72 h后觀察綠色熒光強度，采用qRT-PCR檢測HEPApiC細胞中的SENP1 mRNA，采用Western blotting法檢測SENP1蛋白。結(jié)果 經(jīng)酶切鑒定及測序分析，成功構(gòu)建LV3-SENP1-RNAi慢病毒載體質(zhì)粒，包裝后得到高滴度的病毒顆粒。感染LV3-SENP1-RNAi的HEPApiC細胞中GFP表達隨時間延長逐漸增強，說明LV3-SENP1-RNAi成功感染HEPApiC細胞。實驗組、對照組、空載組細胞中SENP1 mRNA相對表達量分別為0.026、0.050、0.057，SENP1蛋白相對表達量分別為0.161±0.015、0.781±0.046、0.811±0.008；實驗組SENP1 mRNA及蛋白相對表達量降低，與對照組及空載組相比，P均<0.05。結(jié)論 成功構(gòu)建了穩(wěn)定沉默SENP1基因的HEPApiC細胞系。

小泛素相關修飾蛋白質(zhì)類；人Ⅱ型肺泡上皮細胞；基因沉默；RNA干擾

隨著新生兒復蘇技術(shù)的提高，早產(chǎn)兒存活率也顯著上升，這與呼吸機的使用有很大關系。研究[1]發(fā)現(xiàn)，氧化應激反應是新生兒高氧肺損傷的重要發(fā)病機制之一，而呼吸機等新型醫(yī)療技術(shù)的應用增加了新生兒尤其是早產(chǎn)兒氧暴露的風險。高氧使患兒體內(nèi)活性氧簇(ROS)生成增多，SUMO特異性蛋白酶1(SENP1)被激活，沉默接合型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(SIRT1)的734位賴氨酸去SUMO化，減少SIRT1去乙?；せ罴毎蛲龅鞍譸53，進而誘導細胞凋亡[2]；而SIRT1可降低ROS水平，促進p53去乙?；?，抑制細胞凋亡[3]。因此推測SENP1可能通過SIRT1調(diào)節(jié)機體ROS水平，參與高氧肺損傷的發(fā)病過程。為進一步研究SENP1的功能及其在高氧肺損傷氧化應激反應中的作用機制，我們構(gòu)建了穩(wěn)定沉默SENP1基因的人Ⅱ型肺泡上皮細胞系HEPApiC，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與主要材料 HEPApiC細胞由西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中心實驗室保存，HEK293T細胞由上海中科院細胞庫提供，HEPApiC細胞及HEK293T細胞培養(yǎng)于配制好的培養(yǎng)液中，在37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清；引物，DEPC，RT試劑，熒光定量PCR試劑，Sybr green Ⅰ，ECL增強化學發(fā)光檢測試劑盒，PrimeSTARTMHS DNA聚合酶，膠回收試劑盒，質(zhì)粒小量抽提試劑盒，DNase Ⅰ(RNase-free)，Ex TaqTMR-PCR ver.2.1，AMV Reverase Transcriptase，BamH Ⅰ，NOtI EcoRI，T4 DNA ligase buffer，NucleoBond Xtra Midi Plus；制備感受態(tài)試劑盒，SENP1一抗(兔來源)，內(nèi)參GAPDH一抗(兔來源)，羊抗兔IgG二抗。

1.2 LV3-SENP1-RNAi的構(gòu)建及包裝 在GenBank查得SENP1(NM_29843)序列，依據(jù)RNA干擾(RNAi)原則設計三條引物，即ATF3-Mus-356、ATF3-Mus-546、ATF3-Mus-736，根據(jù)沉默效果選取ATF3-Mus-356作為靶序列并擴增，經(jīng)EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ酶切得到線性LV3，經(jīng)純化、T4 DNA連接酶定向連接，將得到的表達載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，PCR法及酶切法鑒定陽性克隆，對其進行測序和序列比對分析以驗證LV3-SENP1-RNAi的構(gòu)建情況。利用質(zhì)粒系統(tǒng)(LV3，PG-p1-VSVG，PG-P2-REV，PG-P3-RRE)對LV3-SENP 1-RNAi進行慢病毒包裝(其中LV3慢病毒穿梭質(zhì)粒能表達GFP)，制備慢病毒顆粒。分別抽提上述四種質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染常規(guī)培養(yǎng)的HEK293T細胞：轉(zhuǎn)染前1 d取狀態(tài)良好的對數(shù)期HEK293T細胞，胰蛋白酶消化，按2×106/皿接種，在37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；當細胞密度達60%～70%時，加入混合液(含質(zhì)粒及磷酸鈣)，8 h后更換新鮮培養(yǎng)液，72 h后收集細胞上清液，4 000 r/min離心10 min后收集病毒上清液，0.45 μm濾器過濾，4 ℃、25 000 r/min離心2 h，而后以預冷的500 μL的DMEM重懸病毒沉淀，4 ℃溶解過夜。采用倍比稀釋法測定病毒滴度。

1.3 LV3-SENP1-RNAi感染HEPApiC細胞 取生長狀況良好的HEPApiC細胞，胰蛋白酶消化吹打成單細胞懸液，以(3～5)×104/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。鋪板時細胞融合率約50%，待融合率達70%且細胞狀態(tài)良好時開始后續(xù)試驗。將HEPApiC細胞分為兩組，實驗組按30個感染復數(shù)(MOI)/孔感染重組慢病毒顆粒，空載組按20 MOI/孔感染空載體。24 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。96 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP熒光，計算感染效率。

1.4 SENP1基因沉默的HEPApiC細胞的構(gòu)建及驗證 將HEPApiC細胞分為實驗組、對照組、空載組。實驗組及空載組依照“1.3”方法進行感染，對照組為未感染細胞。三組細胞均置于37 ℃、 50 mL/L CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液。

1.4.1 SENP1 mRNA檢測 采用qRT-PCR法。按照說明書方法，感染72 h后提取細胞總mRNA，通過反轉(zhuǎn)錄反應體系生成cDNA，經(jīng)過SYBR green Ⅰ熒光染料反應著色后用PCR儀進行檢測。SENP1基因上游引物序列為5′-CCAGCATTTTAACTAACCAGGAAC-3′，下游引物序列為5′-GCTAAGTTATCTGGCTGATGTGG-3′；GAPDH上游引物序列為5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物序列為5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。PCR擴增條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環(huán)35次，72 ℃檢測信號。檢測完畢得出Ct值，以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

1.4.2 SENP1蛋白檢測 采用Western blotting法。感染72 h后收集三組細胞，提取總蛋白，稀釋方法同BSA標準品溶液，在酶標儀562 nm波長處測定吸光度值，依據(jù)BSA標準溶液吸光度值減Blank值的平均值繪制標準曲線，將各樣品溶液的吸光度值減Blank值的平均值帶入標準曲線，計算樣品中的蛋白濃度。蛋白上樣，經(jīng)聚丙烯氨酰胺凝膠電泳，SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，封閉液封閉，一抗孵育，二抗孵育，洗滌，曝光后分析目的條帶的灰度值，以經(jīng)內(nèi)參校正后的灰度值表示目的蛋白的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LV3-SENP1-RNAi的構(gòu)建及鑒定情況 慢病毒表達載體的酶切鑒定結(jié)果與預期相符，說明目的基因成功插入載體，測序結(jié)果正確(圖1)，LV3-SENP1-RNAi慢病毒表達載體構(gòu)建成功。顯微鏡下見轉(zhuǎn)染慢病毒載體后的HEK293T細胞發(fā)出綠色熒光。經(jīng)逐孔稀釋滴度測定法測定LV3-SENP1-RNAi病毒滴度為9×108TU/mL，LV3-GFP病毒滴度為3×108TU/mL。

圖1 重組質(zhì)粒測序結(jié)果

2.2 LV3-SENP1-RNAi感染HEPApiC細胞情況 觀察HEPApiC細胞中GFP表達情況(見圖2)，發(fā)現(xiàn)感染LV3-SENP1-RNAi的細胞中GFP表達隨時間延長逐漸增強，96 h后熒光達到最強，說明LV3-SENP1-RNAi成功感染HEPApiC細胞。

注：A、B分別為感染空載體細胞的可見光、熒光圖像，C、D分別為感染LV3-SENP1-RNAi細胞的可見光、熒光圖像。

圖2 感染LV3-SENP1-RNAi的HEPApiC細胞中GFP表達情況

2.3 SENP1基因沉默HEPApiC細胞的構(gòu)建及驗證情況 實驗組、對照組、空載組細胞中SENP1 mRNA相對表達量分別為0.026、0.050、0.057，SENP1蛋白相對表達量分別為0.161±0.015、0.781±0.046、0.811±0.008；實驗組SENP1 mRNA及蛋白相對表達量降低，與對照組及空載組相比，P均<0.05，表明感染LV3-SENP1-RNAi的HEPApiC細胞SENP1 mRNA及蛋白敲減成功，建立了穩(wěn)定沉默SENP1基因的HEPApiC細胞系。

3 討論

氧化應激是細胞發(fā)生損傷、凋亡最常見的原因之一。當機體遭受各種有害刺激時，體內(nèi)ROS產(chǎn)生過多或過快均會影響機體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡，當氧化系統(tǒng)占據(jù)主導地位時，極易發(fā)生組織損傷。目前，吸入高體積分數(shù)氧(高氧)是新生兒尤其是早產(chǎn)兒救治的重要手段，但高氧會誘導機體產(chǎn)生大量ROS。早產(chǎn)兒發(fā)育不成熟，對ROS的清除能力不足，高氧吸入治療早期即有可能發(fā)生急性肺損傷，一旦治療不及時或不當，將會大大增加支氣管、肺發(fā)育不良的發(fā)生率[4，5]。沉默接合型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(SIRT1)是一類高度保守的依賴煙堿腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的第3類組蛋白去乙?；竅6]，能介導細胞分化、凋亡、衰老，影響信號轉(zhuǎn)導、氧化應激、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等重要生理過程，且在定位于細胞核才能發(fā)揮相應作用[7，8]。前期研究[9～11]顯示SIRT1參與了早產(chǎn)兒高氧誘導的氧化應激反應，了解SIRT1的功能及其上下游基因在氧化應激中發(fā)揮的作用十分必要。SENP1作為SIRT1的特異性去SUMO化酶，能通過對SIRT1的去SUMO修飾影響其在細胞核內(nèi)外的分布，從而影響SIRT1的功能及其對下游基因的調(diào)控。因此我們認為，如果能夠在氧化應激發(fā)生早期下調(diào)SENP1表達，有望抑制其對SIRT1的去SUMO化作用，抑制p53的活性，減少細胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(靶蛋白上特定氨基酸磷酸化、乙?；?、甲基化、糖基化等)是蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學功能的重要調(diào)節(jié)機制之一[12]。SUMO修飾是其中非常重要的一種，主要通過與靶蛋白共價連接發(fā)揮相應的修飾作用[13]。SENPs家族在SUMO化修飾與去SUMO化修飾之間發(fā)揮杠桿作用[14]。作為SENPs家族重要成員之一，SENP1同樣具有這種作用。SENP1可水解SUMO蛋白暴露其C端甘氨酸殘基，為SUMO與底物蛋白賴氨酸結(jié)合位點結(jié)合并修飾靶蛋白提供基礎；也可切斷SUMO與底物蛋白間的異肽鍵，實現(xiàn)去SUMO化過程[13]。目前學者們無法肯定SENP1是通過何種機制影響SIRT1的分布與功能，干擾SENP1基因表達能為二者間關系的研究提供參考。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在高氧條件下，SENP1蛋白表達減少，SIRT1表達也發(fā)生相應改變，說明二者之間可能存在聯(lián)系，并且均與氧化應激有關。

我們借助RNAi技術(shù)制備了三條SIRT1基因的干擾引物，選取ATF3-Mus-356作為靶序列并擴增。RNAi主要通過將外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA導入細胞，特異性降解與該段RNA同源的mRNA，繼而降低靶蛋白表達[15]。研究發(fā)現(xiàn)，相比致癌病毒，慢病毒雖然具有更復雜的復制周期、含有更復雜的基因組，但它們能感染非分裂細胞和分化末端的細胞。本研究成功構(gòu)建LV3-SENP1-RNAi慢病毒載體質(zhì)粒，將包裝好的病毒顆粒成功感染HEPApiC細胞，在熒光顯微鏡下，能通過載體上攜帶的GFP表達情況評價感染效率。本研究結(jié)果顯示，感染LV3-SENP1-RNAi的HEPApiC細胞中GFP表達隨時間延長逐漸增強，說明LV3-SENP1-RNAi成功感染HEPApiC細胞。進一步通過qRT-PCR與Western blotting檢測驗證顯示，實驗組SENP1 mRNA及蛋白相對表達量低于對照組及空載組，說明穩(wěn)定沉默SENP1基因的HEPApiC細胞系構(gòu)建成功。上述結(jié)果為進一步研究SENP1基因在新生兒高氧肺損傷發(fā)生中的具體作用機制奠定了實驗基礎。

[1] Buczynski BW, Maduekwe ET, O′Reilly MA. The role of hyperoxia in the pathogenesis of experimental BPD[J]. Semin Perinatol, 2013,37(2):69-78.

[2] Yang YH, Olashaw N, Santo V, et al. SIRT1 sumoylation regulates its deacetylase activity and cellular response to genotoxic stress[J]. Nat Cell Biol, 2007,9(11):1253-1262.

[3] Hori YS, Kuno A, Hosoda R, et al. Regulation of FOXOs and p53 by SIRT1 Modulators under Oxidative Stress[J]. PLoS One, 2013,9(11):73875.

[4] Dang H, Yang L, Wang S, et al. Calcitonin gene-related peptide ameliorates hyperoxia-induced lung injury in neonatal rats[J]. Tohoku J Exp Med, 2012,227(2):129-138.

[5] Allison BJ, Crossley KJ, Flecknoe SJ, et al. Ventilation and oxygen: dose-related effects of oxygen on ventilation-induced lung injury[J]. Pediatr Res, 2010,67(3):238-243.

[6] Hori YS, Kuno A, Hosoda R, et al. Regulation of FOXOs and P53 by SIRT1 modulators under oxidative stress[J]. PLoS One, 2013,8(9):73875-73882.

[7]Autiero I, Costantini S, Colonna G. Human Sirt-1: Molecular Modeling and Structure-Function Relationships of an Unordered Protein[J]. PLoS One, 2009,4(10):7350.

[8] Gravina GL, Senapedis W, McCauley D, et al. Nucleo-cytoplasmic transport as a therapeutic target of cancer[J]. J Hematol Oncol, 2014,12(7):85.

[9] 楊熙,董文斌,李清平,等.早產(chǎn)兒氧暴露后外周血單個核細胞活性氧增加使SIRT1產(chǎn)生核質(zhì)穿梭[J].細胞與分子免疫學雜志,2015,31(12):1669-1672+1676.

[10] 楊熙,董文斌,李清平,等.白藜蘆醇對高氧誘導早產(chǎn)兒外周血單個核細胞氧化應激損傷的影響及其機制研究[J].中國當代兒科雜志,2016,18(1):72-77.

[11] 張春艷,李清平,康蘭,等.白藜蘆醇上調(diào)人肺泡上皮細胞SIRT1表達抑制高氧誘導的細胞凋亡[J].細胞與分子免疫學雜志,2015,31(5):590-595.

[12] Wang J. SUMO conjugation and cardiovascular development[J]. Front Biosci, 2009,14(4):1219-1229．

[13] Hickey CM, Wilson NR, Hochstrasser M. Function and regulation of SUMO proteases[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012,13(12):755-766.

[14] Xu Z, Chan HY, Lam WL, et al .SUMO proteases: redox regulation and biological consequences[J]. Antioxid Redox Signal, 2009,11(6):1453-1484.

[15] Stovall DB, Wan M, Zhang Q. DNA vector-based RNA interference to study gene function in cancer[J]. J Vis Exp, 2012,4(64):4129.

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Establishment of HEPApiCs cell line stably silencing SENP1

ZHAOXu,DONGWenbin,LEIXiaoping,LIQingping,KANGLan,ZHAOShuai,ZHANGChan

(TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To establish human type II alveolar epithelial cells (HEPApiC) that can stably silence SUMO specific protease 1 (SENP 1) . Methods We constructed the LV3-SENP1-RNAi lentiviral vector silencing SENP1 gene.HEPApiC cells were divided into the experimental group, control group and empty vector group. The experimental group was infected with LV3-SENP1-RNAi, the empty vector group with empty vector and the control group was not treated. After 72-hour infection, the green fluorescence intensity was observed, the SENP1 mRNA in HEPApiC cells was detected by qRT-PCR, and SENP1 protein was detected by Western blotting.Results After restriction enzyme digestion and sequencing, the LV3-SENP 1-RNAi lentiviral vector plasmid was successfully constructed and we got a virion with a high titer. The expression of GFP in HEPApiC cells infected with LV3-SENP1-RNAi was gradually increased with time, indicating that LV3-SENP1-RNAi successfully infected HEPApiC cells. The relative expression of SENP1 mRNA in the experimental group, the control group and the empty vector group was 0.026, 0.050, and 0.057; and the relative expression of SENP1 protein was 0.161±0.015, 0.781±0.046 and 0.811±0.008, respectively. The expression of SENP1 mRNA and protein in the experimental group was lower than that in the control group and empty vector group, allP<0.05.Conclusion HEPApiCs cell line stably silencing SENP1 is successfully established.

small ubiquitin-related modifier proteins; human typeⅡalveolar epithelial cells; gene silencing; RNA interference

國家自然科學基金資助項目(81571480)；四川省科技廳科研項目(2014NZ0014)；瀘州市政府-瀘州醫(yī)學院聯(lián)合專項資金資助項目(2013LZLY-J08)。

趙許(1990-)，女，碩士研究生，主要研究方向為新生兒疾病。E-mail: linda1990xu@sina.com

董文斌(1967-)，男，教授，碩士生導師，主要研究方向為新生兒疾病。E-mail: dongwenbin2000@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.005

R722.19

A

1002-266X(2017)03-0016-04

2016-06-30)

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