寡核苷酸管芯片技術檢測和鑒別我國不同組植原體*

王圣潔，林彩麗，嚴東輝，于少帥，李 永，汪來發(fā)，樸春根，郭民偉，淮穩(wěn)霞，田國忠

(中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所，國家林業(yè)局森林保護學重點實驗室，北京 100091)

寡核苷酸管芯片技術檢測和鑒別我國不同組植原體*

王圣潔，林彩麗，嚴東輝**，于少帥，李 永，汪來發(fā)，樸春根，郭民偉，淮穩(wěn)霞，田國忠**

(中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所，國家林業(yè)局森林保護學重點實驗室，北京 100091)

[目的]不同組植原體檢測和鑒別的特異性探針已有報道，為了篩選出適合于我國不同組植原體檢測和鑒別的特異性探針，建立管芯片檢測和鑒別植原體技術，并對我國發(fā)生的疑似植原體病害進行鑒別。[方法]通過PCR擴增結(jié)合管芯片雜交技術，對收集到的15種植原體侵染的植物樣品及其健康對照進行檢測和鑒別。[結(jié)果]建立了管芯片檢測和鑒別植原體技術體系。15種病害樣品中，13種獲得顯著的陽性雜交信號，并且所有的健康對照都呈現(xiàn)為陰性。13種植原體病害依16Sr DNA直接測序可分為16Sr Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、XIX四組植原體。在所有探針中，植原體的通用探針(Pp-502)可以檢測到所有確定的植原體樣品。16SrⅠ組特異性探針(PpⅠ-465)可以確定16SrⅠ組的泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮和萵苣黃化4種植原體樣品。16SrII組特異性探針(PpⅡ-629)僅可以確定16Sr II組的花生叢枝、甘薯叢枝和臭矢菜叢枝3種植原體樣品。但16SrV組的棗瘋病、櫻桃致死黃化和重陽木叢枝及16Sr XIX組的板栗黃化皺縮植原體與其他組?；蕴结樈杂忻黠@的交叉雜交信號。相比于PCR擴增的凝膠電泳檢測，管芯片檢測的靈敏度提高了1 000倍。對疑似植原體病害的診斷結(jié)果顯示河南濮陽的紅花槐叢枝的病原應為16SrV組植原體，福建福州的長春花黃化叢枝應為16SrⅠ組植原體；而北京戒臺寺牡丹黃化皺葉和內(nèi)蒙古包頭柳樹叢枝未出現(xiàn)任何植原體?；碾s交信號。[結(jié)論]管芯片雜交技術作為一種檢測和鑒別植原體的方法，可應用于我國植原體病害調(diào)查和診斷，并為植原體的鑒別和分類提供可靠的依據(jù)。

管芯片；植原體；病害鑒定與診斷；16Sr DNA基因

植原體(Phytoplasma，原稱 Mycoplasma-like organism 簡稱MLO)，是一類類似植物病原細菌但無細胞壁的原核生物。能引起許多重要的糧食作物、蔬菜、觀賞植物和果樹等經(jīng)濟林木的嚴重病害。目前，在國際上已經(jīng)報道的植原體相關病害多達1 000余種，在我國發(fā)生的也有100多種[1]。由于植原體暫時還不能實現(xiàn)體外培養(yǎng)，針對該類病害的高度抗性品種又很難獲得，實際生產(chǎn)中該類病害的防治措施主要是依靠清除染病的植株，杜絕侵染來源。因而及早的發(fā)現(xiàn)感病植物中植原體的存在，及時采取相應的措施，將帶毒植物予以鏟除，對該類病害的防治具有重要意義[2]。因此，建立快速、高效、準確的植原體鑒定檢測體系變得尤為重要，這方面的研究經(jīng)歷了前期主要依靠生物學、電鏡觀察、抗生素試驗相結(jié)合的傳統(tǒng)方法進行檢測，到后期隨著生物技術的發(fā)展，基于酶聯(lián)免疫反應、核酸雜交以及PCR技術的檢測方法也相繼建立，檢測的靈敏度和準確性不斷提高[3-6]。

基因芯片又稱DNA芯片或DNA微陣列，是指固著在載體上的高密度DNA微點陣。其原理是根據(jù)核酸的分子雜交衍生而來，即應用已知序列的核酸作為探針，對未知序列的核酸序列進行雜交檢測[7]?；蛐酒鶕?jù)不同的載體類型以及用途可以分為不同的類型，如基因表達芯片、測序芯片、診斷芯片等。同時針對不同的芯片類型，又建立了不同的芯片技術平臺，比較成熟的有Affymentrix公司的Gene-Chip系列、Agilent公司的aCGH芯片系列、BioPrime公司的ArrayCGH系列、博奧生物的晶芯系列以及Alere公司的ArrayTube系列等。相比于傳統(tǒng)的核酸雜交技術，基因芯片具有快速、平行、高效、高通量、高靈敏度、可自動化操作等特點，自被發(fā)明以來，在醫(yī)學、生命科學、農(nóng)業(yè)、林業(yè)及環(huán)境科學等領域得到了廣泛的應用[8-10]。

生物芯片的核心是核酸雜交技術，早在20世紀末期，已經(jīng)有不少學者將核酸雜交技術應用于植原體的研究中[11]。2004年Herdia等[12]對DNA芯片在植物病毒、類病毒及植原體病原檢測上的應用潛力進行過報道。2007年Bertolini[13]將PCR與dot blot相結(jié)合成功的實現(xiàn)了16SrX組植原體的檢測。同年，Nicolaisen等[14]針對植原體的16Sr DNA基因設計特異性引物，在BioPrime Array平臺上建立了可以鑒別和檢測大部分16Sr 亞組的植原體芯片檢測方法。2011年Lenz 等[15]報道了用植原體16S-23S間區(qū)為靶標的寡核苷酸芯片區(qū)分不同植原體，獲得了與上述16Sr DNA基因芯片類似的分辨效果；至2015年，Lenz等[16]又選取植原體核糖體蛋白基因rps3，rpl22和rps19作為靶標基因，設計特異性探針，同樣實現(xiàn)了植原體不同亞組間的芯片鑒別和檢測，并嘗試對田間和混合感染樣品的檢測。其中，Nicolaisen所采用的方法，由于對PCR產(chǎn)物使用Cy3-dCTP進行標記、且需對標記反應產(chǎn)物進行純化，而且雜交反應需過夜，導致檢測過程和時間過長，操作較為繁瑣。Lenz的方法，簡化了雜交的過程，可以在2小時內(nèi)完成檢測，但是其所需設備比較龐大、昂貴。相比于Lenz所使用的芯片掃描平臺Tyhoon 900，Alere公司的ATR 03 Reader芯片掃描平臺，具有設備簡單，方便攜帶、快速反應的特點，可以實現(xiàn)在2小時內(nèi)完成雜交，非常適合野外和現(xiàn)場試驗。

我國植原體病害發(fā)生嚴重，而且存在不同亞組的植原體共同危害的現(xiàn)象。為了調(diào)查分析我國植原體的分類情況，我們將Nicolaisen針對16Sr DNA所設計的探針結(jié)合Alere公司定制的管芯片對所收集到的植原體進行應用研究，以期篩選出適用于我國不同組植原體分類鑒定的特異性探針組，并在此基礎上建立適合于野外使用的管芯片鑒定和檢測植原體的方法。與此同時，我們也將此方法應用于我國一些疑似植原體病害的鑒別和分類研究。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所使用的植原體材料及其健康對照，采集自我國不同的地區(qū)，其編號及分類信息詳見表1。CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒(DN14)購自北京艾德萊生物科技有限公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、以及感受態(tài)細胞E.coliDH5α、克隆載體 pMD18-T均購自寶生生物(大連)有限公司。管芯片雜交試劑盒購自德國Alere生物技術有限公司。

表1 植原體樣品及來源Table 1 Origin and information of phytoplasma samples

1.2 方法

測序獲得序列與NCBI上下載的植原體各組代表序列利用MEGA軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹采用N-J法，Bootstrap 值為1 000，非固醇甾原體(Acholeplasmalaidlawii)和螺原體(Spiroplasmachrysopicola)作為外類群，確定所采集植原體的分類地位。1.2.2 特異性探針設計及管芯片定制 參考Nicolaise等[14]針對植原體的16Sr DNA設計的探針組，包含了一對通用引物Pp-fwd(5’-AGTGGCGAACGGGTGAGTAAC-3’)和Pp-rev (5’-CGTTTACGGCGTGGACTACCAG-3’)以及一組針對不同組植原體特異性的探針(見表2)。管芯片的制作委托德國Alere生物技術有限公司進行，將人工合成的探針序列，經(jīng)點樣機按設計的排布點在管芯片中。探針序列及陽性對照在載體上的分布情況(見圖1)。

表2 探針序列Table 2 Probe sequences

1.2.3 靶標基因的生物素標記及管芯片雜交 本實驗采用生物素標記靶標基因，方法是在合成設計的通用探針的引物Pp-fwd/Pp-rev時，在引物Pp-rev的5’端進行生物素修飾。并以此帶有標記的引物組對樣品進行PCR擴增，PCR擴增程序：25 μL擴增反應體系中含有制備的DNA模板1 μL，正反向引物各0.5 μL(10 μM)，2 × PCR預混液(0.05 U/μL Taq DNA 聚合酶, 4 mM MgCl2和 0.4 mM dNTPs)12.5 μL，ddH2O補至25 μL。反應程序：94℃ 3 min；94℃ 15 s, 62℃ 30 s, 72℃ 1 min, 共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。管芯片的雜交和洗滌過程，將PCR產(chǎn)物、純水和雜交緩沖液C1按照1∶9∶90配制雜交混合液，其余參照Alere公司雜交試劑盒的操作說明進行。將芯片掃描的信號強弱按等級進行劃分，并賦值。最強信號為Biotin-Marke賦值為10，無信號賦值為0，按照雜交信號的強弱借助軟件Heml 1.0制作雜交結(jié)果的Heatmap圖。

1.2.4 管芯片探針特異性驗證和疑似植原體病害材料檢測 按照管芯片檢測步驟，分別對已經(jīng)確立了分類地位的16SrⅠ組、16SrⅡ組、16SrⅤ組和16SrXIX組的植原體組織和對應的健康組織進行檢測。同時對采集的疑似植原體病害的植物材料和健康對照進行檢測驗證。

1.2.5 管芯片鑒定和檢測植原體靈敏度測定 將樣品PaWB-HBBD用引物R16mF2/R16mR1進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化后，與克隆載體 pMD18-T 16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞E.coliDH5α中。在含有IPTG和X-gal的LB篩選平板上挑取白色菌落并搖菌培養(yǎng)。用質(zhì)粒純化試劑盒(Takara Mini BEST Ver.2.0)從上述培養(yǎng)液中提取重組質(zhì)粒DNA，并送北京華大基因進行測序驗證。

將上述提取的重組質(zhì)粒DNA，10倍梯度稀釋，并作為模板進行PCR擴增和管芯片檢測。比較瓊脂糖凝膠電泳和管芯片雜交的檢測靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 植原體樣品16S rDNA的擴增與測序

應用植原體16Sr DNA基因的通用引物R16mF2/R16mR1對15種植原體侵染植物樣品及其健康對照的DNA進行PCR擴增，凝膠電泳檢測結(jié)果顯示所有的健康植物對照均未出現(xiàn)陽性擴增結(jié)果。一些疑似植原體病害的發(fā)病組織DNA也未擴增出陽性的結(jié)果。包括牡丹皺葉黃化(PsYC-BJMTG)和柳樹叢枝(SaWB-NMBT)。剩下的13種具有典型癥狀的發(fā)病組織DNA，均獲得陽性擴增結(jié)果。將具有陽性結(jié)果的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因測序，測序結(jié)果與GenBank中已報道的[18]植原體不同組的序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)。結(jié)果顯示所收集的植原體材料分布在四個組，分別是16SrⅠ組、16SrⅡ組、16SrⅤ組和16SrXIX組。

2.2 管芯片探針雜交結(jié)果和特異性驗證

按照所建立的管芯片檢測和鑒定植原體的方法對所收集到的我國發(fā)生的16Sr不同組植原體的DNA及其健康對照進行管芯片雜交，從雜交結(jié)果的Heatmap圖(圖4)可以看出，Nicolaisen等所設計的針對16Sr DNA基因的探針，與健康植物對照皆無雜交信號，而分別與不同組植原體有強弱不同的雜交信號。其中17號探針(Pp-502)作為植原體通用探針能與我國不同地區(qū)采集的、已系統(tǒng)鑒定的不同組的所有植原體都有很強的雜交信號，可以成為各種植原體病害初步診斷的理想探針。但另一通用探針16號(Pp-148)按現(xiàn)有的檢測方法與條件，其所產(chǎn)生雜交信號較弱。15號探針(PpXIV-585)，原是針對16S rXIV組所設計的組特異性探針，但是實驗結(jié)果卻顯示其可以和16SrⅠ組、16SrⅤ組和16SrXIX組植原體產(chǎn)生相對較強的雜交信號。

注：a：管芯片示意圖；b：探針分布圖；c：探針點代號Note: a: ArrayTube diagram; b: Probe distribution; c: Probe code.圖1 管芯片示意及探針分布圖Fig.1 Array diagram and probe distribution

16SrⅠ組的泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮和萵苣黃化四種已知分類地位的植原體材料的管芯片雜交結(jié)果來看，針對16SrⅠ組所設計的組特異性的1號探針(PpⅠ-465)有很好的特異性。4種16SrⅠ組的樣品均出現(xiàn)較強的雜交信號，同時其他組的樣品不出現(xiàn)雜交信號。同樣，針對16SrⅡ組所設計的組特異性3號探針(PpⅡ-629)也表現(xiàn)出了良好的組間特異性，所有16SrⅡ組的花生叢枝、甘薯叢枝和臭矢菜叢枝3個植原體樣品可產(chǎn)生較強的雜交信號，并且其他組的樣品不出現(xiàn)雜交信號。但是同樣針對16SrⅡ組設計的另外一個特異性探針2號(PpⅡ-471)，卻沒能出現(xiàn)任何雜交信號。

16SrⅤ組的棗瘋、櫻桃致死黃化和重陽木叢枝三個植原體樣品所產(chǎn)生的雜交信號譜較為復雜且相似，除了通用探針17號(Pp-502)外和15號探針(PpXIV-585)出現(xiàn)了較強的雜交信號外，6號探針(PpV-221)、8號探針(PpVII-621)、9號探針(PpVIII-634)以及16號探針(Pp-148)均出現(xiàn)了中等強度的雜交信號。其中只有6號探針是設計的16SrⅤ組特異性探針，與屬于B亞組的棗瘋病和櫻桃致死黃化有中等強度的雜交信號，但屬于H亞組的重陽木叢枝則未出現(xiàn)雜交信號，較難判斷為陽性結(jié)果。

圖2 基于植原體16Sr DNA 序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on the 16s DNA of phytoplasm

類似的情況也出現(xiàn)在板栗黃化皺縮植原體樣品中，即除與通用引物16和17號分別產(chǎn)生中等和很強的雜交信號外，也與16SrIV和16SrXIV探針有中等強度信號。根據(jù)Lin[19]的報道其屬于16SrXIX組，但是Nicolaisen在設計探針時，并沒有針對16SrXIX組設計特異性的探針，不過從系統(tǒng)發(fā)育上看16SrXIX組的植原體與16Sr IV組的植原體關系較近，因此在板栗黃化皺縮植原體樣品的管芯片雜交結(jié)果中，16Sr IV組的特異性探針5號(PpIV-630)出現(xiàn)了較弱的信號。

A：泡桐叢枝; B：健康泡桐; C：花生叢枝; D：健康花生; E：棗瘋病; F：健康棗樹; G：板栗皺縮黃化; H：健康板栗A: Paulownia witches-broom; B: Health paulownia; C: Peanut witches-broom; D: Health peanut; E: Jujube witches-broom; F: Health jujube; G: chestnut yellows crinkle; H: Health chestnut圖3 芯片雜交結(jié)果Fig.3 Results of ArrayTube hybridization

注：圖中雜交信號越強，顏色越紅，藍色為沒有雜交信號Note: The strong hybridization signal was red, blue repsented no signal圖4 芯片雜交結(jié)果的Heatmap圖Fig.4 Heatmap of ArrayTube Hybridization

另外，我國發(fā)生的4個組共13個植原體皆與所設計的針對與16SrIII、VI、X和XII四個組的所有探針無任何雜交信號，表明不存在于這些組的交叉反應問題，也意味著這些植原體樣品不存在與這四個組植原體的混合感染。

2.3 不同組植原體序列與寡核苷酸探針序列比對

將通過測序獲得的各個組的序列與所有具有雜交信號的探針序列進行比對，計算各組序列與探針序列的匹配率(見表3)?？梢钥闯?，通用探針Pp-148和Pp-502與測定的四個組植原體的對應序列幾乎完全匹配，僅16SrII組樣品序列與Pp-502探針有一個堿基的差別。16SrI組樣品序列與PpⅠ-465探針序列完全匹配。16SrII組樣品序列與PpⅡ-629探針序列完全匹配。從而確證了所設計的這幾個探針鑒定植原體的特異性和準確性。然而也發(fā)現(xiàn)雖然16SrV組植原體樣品的序列與所設計的組特異性探針PpV-221探針序列完全匹配，。但是從雜交的結(jié)果上來看，雜交信號的強弱并不跟其序列的匹配率成完全的正相關(參見圖4)；，如通用探針Pp-148與四個組樣品的序列都完全匹配，但是其雜交的信號強度顯著弱于通用探針Pp-502。而且同樣，16SrV組樣品序列與PpV-221探針序列完全匹配，與PpⅦ-621探針序列有3個堿基的錯配，與PpⅧ-634探針序列有4個堿基的錯配，與PpXIV-585探針序列有3個堿基的錯配，但是該組植原體與PpⅦ-621、PpⅧ-634和PpXIV-585探針所對應的雜交信號卻都明顯強于PpV-221探針。甚至，16SrI組樣品序列與PpXIV-585探針序列錯配堿基達到了7個，但是也出現(xiàn)了較很強的雜交信號。因而，我們認為，在現(xiàn)行的Alere公司提供的試劑和雜交條件下，Nicolaisen等設計的針對16SrV、VIII、XIV等組的探針并非檢測和鑒定相應組植原體的特異性理想探針。另外尚不清楚為什么雖然通用探針Pp-148與測定的四個組植原體樣品的序列也都完全匹配，但是其雜交的信號強度總是顯著弱于通用探針Pp-502。

表3 不同組樣品序列與各探針的匹配率Table 3 Matching ratio between different sample sequences and probes

注：括號內(nèi)為錯配的堿基數(shù)，匹配率：(探針堿基總數(shù)-錯配堿基數(shù))/探針堿基總數(shù)

Note: The number of mispairing base was indicated in brackets, matching ratio: (total number of probe bases-the number of mispairing base)/Total number of probe bases

2.4 管芯片鑒定和檢測植原體靈敏度

將泡桐叢枝樣品PaWB-HBBD的16Sr DNA基因擴增后，連接到克隆載體pMD18-T上后組建重組質(zhì)粒，提取重組的質(zhì)粒，純化后進行10倍梯度稀釋，并作為模板分別進行PCR檢測和管芯片檢測。實驗結(jié)果顯示，以植原體通用引物R16mF2/R16mR1的傳統(tǒng)PCR檢測，在質(zhì)粒濃度稀釋到10-4倍時，達到凝膠電泳的檢測限度(見圖5)。但是管芯片檢測在質(zhì)粒稀釋到10-7倍時，仍可出現(xiàn)較好的雜交信號(見圖6)。因此可以表明相比于傳統(tǒng)PCR檢測，管芯片檢測植原體的方法的靈敏度提高了1 000倍。并且采用管芯片檢測的方法，不僅能實現(xiàn)靈敏度的提高，還能實現(xiàn)植原體不同組的鑒定。而且當稀釋度達到10-7時，與16SrXIV組探針的交叉雜交信號也明顯減弱，而16SrI?；蕴结樅屯ㄓ锰结樀男盘柸暂^強。

圖5 PCR檢測靈敏度Fig.5 PCR detection sensitivity

圖6 管芯片檢測靈敏度Fig.6 ArrayTube detection sensitivity

2.5 疑似植原體病害的檢測與鑒定

近年來，我國不同地方出現(xiàn)了一些園林綠化樹種的未知病害，如發(fā)生在北京市門頭溝戒臺寺的牡丹黃化皺葉病害，其具有典型的植原體病害特征，如皺葉、黃化、叢枝、巨芽等。發(fā)生在內(nèi)蒙古包頭市的柳樹叢枝病害，同樣出現(xiàn)小葉、叢枝等典型癥狀。以及河南濮陽發(fā)生的紅花槐叢枝、福建福州出現(xiàn)的長春花黃化叢枝均為第一次發(fā)現(xiàn)。

圖7 疑似植原體病害癥狀Fig.7 The symptom of suspected phytoplasma disease

我們將新建立的管芯片鑒定與檢測植原體的方法應用于這些未知疑似植原體病害的檢測與鑒定中。從實驗結(jié)果看，牡丹黃化皺葉和柳樹叢枝樣品，均沒能出現(xiàn)陽性雜交信號。紅花槐叢枝產(chǎn)生了很好的雜交信號，并且雜交結(jié)果和16SrⅤ組的棗瘋病、重陽木叢枝等結(jié)果相一致。因此可以判定引起河南濮陽紅花槐叢枝的病原是屬于16SrⅤ組的植原體。同樣長春花黃化叢枝的雜交結(jié)果與16SrI組的泡桐叢枝病、苦楝叢枝病等相一致，因此判定出現(xiàn)在福建福州的長春花黃化叢枝的病原菌為16SrI組的植原體。

3 討論

植物病害的準確快速診斷、病菌的檢測與鑒別是病害防治的前提與基礎。植原體的檢測與鑒別目前主要依靠針對16Sr DNA的PCR擴增及測序來進行。生物芯片技術作為新興的高度集成化的分析和研究手段，在植物病原檢測與鑒定方面，因其無可比擬的高信息量、高通量、靈敏、快速和準確的特點顯示出了巨大潛力。特別是針對一些混合感染的植物病害，生物芯片由于可以同時針對不同的病原設計檢測探針，其檢測的優(yōu)勢將更加明顯。Lenz等對rp基因設計的探針芯片采用多引物PCR擴增產(chǎn)物進行芯片雜交，證明不同組植原體間的兩兩人工混樣可以被同時檢測，而且也能從田間采集的樣品中檢測出16SrI組和16SrX組植原體的混合感染。本研究將Nicolaisen所設計16Sr DNA探針整合到Alere公司的管芯片和ATR 03 Reader芯片掃描平臺上，用生物素標記引物直接PCR，建立在管狀芯片內(nèi)進行植原體鑒定和檢測的方法。首次利用植原體管芯片并結(jié)合序列分析技術，對我國植原體病原種類進行系統(tǒng)的比較鑒定和生態(tài)調(diào)查，進一步明確了我國不同地區(qū)、不同寄主植物上發(fā)生的重要植原體病原的分類地位。

3.1 管芯片探針的特異性對植原體檢測的影響

在收集到的11種已確定分類地位的植原體以及4種疑似植原體病害材料的管芯片檢測中，結(jié)果顯示16Sr DNA基因的探針，與健康植物對照皆無雜交信號，而分別與不同組植原體有強弱不同的雜交信號。由此肯定所設計的17種探針都具植原體特異性，因而都具備植原體病害診斷和病原檢測價值；特別是17號探針(Pp-502)作為植原體通用探針能與我國不同地區(qū)采集的、已系統(tǒng)鑒定的不同組的所有植原體都有很強的雜交信號，因而是確定各種植原體侵染和病害初步診斷的首選通用探針。組特異性的1號探針(PpⅠ-465)對4種不同寄主植物上的16SrⅠ組植原體均有很好的鑒定效果，且與其它組的樣品不出現(xiàn)交叉雜交信號。3號探針(PpⅡ-629)對16SrⅡ組的分別來源于福建泉州的花生叢枝和甘薯叢枝及海南三亞的臭矢菜叢枝3個植原體?；岳硐?。所以1號探針和3號探針可以作為16SrⅠ組和16SrⅡ組植原體?；澡b定的鑒定探針。

1：牡丹黃化皺縮; 2：健康牡丹; 3：柳樹叢枝; 4：健康柳樹; 5：紅花槐叢枝; 6：健康槐樹; 7：長春花黃化叢枝; 8：健康長春花1: Peony yellows crinkle; 2: Health peony; 3: Willow witch-broom; 4: Health willow; 5: Robinia hispida L. witches-broom; 6: Health Robinia hispida L.; 7: Periwinkle yellow and witches-broom; 8: Health periwinkle圖8 疑似植原體病害管芯片雜交結(jié)果Fig.8 ArryayTube hybridization of suspected phytoplasma disease

16SrⅤ組的組特異性探針(PpV-221)與我國發(fā)生的該組B亞組的棗瘋和櫻桃致死黃化和H亞組的重陽木叢枝植原體的特異性較差，?；噪s交信號較弱，且與其他組的探針存在不同程度的交叉雜交現(xiàn)象。從我們所建立的系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出16SrVII組的Erigeron witches’-broom[18]和16SrVIII組的Loofah witches’-broom[20]在進化上與16SrⅤ組的植物原體較近，因此其16Sr RNA相似度較高，探針的序列比對也顯示，它們之間僅有幾個堿基的差別，因此會出現(xiàn)交叉雜交反應。但對比這三個16SrV組植原體探針雜交結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)三者具有相似陽性雜交點陣圖，似乎可以作為該組植原體的特征性識別標簽或指紋。比如，田間采集的福建福州的長春花黃化叢枝的芯片雜交點陣圖與16SrI組的所有植原體芯片檢測結(jié)果完全一致，因而應鑒定為該組植原體。而發(fā)生在河南濮陽的紅花槐叢枝應是16SrV組植原體侵染所致。從常規(guī)PCR的測序驗證上也印證了芯片雜交結(jié)果的準確性。

3.2 管芯片檢測技術的影響因素

探針核酸分子與待檢測樣本中的目標核酸分子的結(jié)合緊密程度，決定了雜交反應的熒光信號強度。由于AT與GC結(jié)合的自由能有差別，不同的探針在雜交熱力學性質(zhì)上有差別。在雜交的過程中，雜交的溫度，雜交溶液中的Na+、Mg2+離子濃度以及溶液的pH值都會影響雙鏈DNA的穩(wěn)定性。本研究中所采用的雜交體系，與Nicolaisen等所報道的并不完全相同，因此在結(jié)果上產(chǎn)生了不同組之間的交叉雜交信號。也可能正是由于雜交條件的不同，使得在匹配率上完全匹配的通用探針Pp-148并沒有出現(xiàn)較好的雜交結(jié)果。

基于16Sr DNA和16S-23S間區(qū)序列設計的芯片目前也存在技術難點。由于擴增產(chǎn)生的片段不能過長，不同組之間16SrRNA的變異性不高，設計區(qū)分度很高的探針具有一定的難度。加之植原體大都具有兩個核糖體操縱子，因而如果其中一個操縱子發(fā)生了變異，將直接影響鑒定結(jié)果的準確性。進一步選擇單拷貝、且變異程度較高的靶標基因為rp基因仍具有一定的局限性，不能實現(xiàn)針對如16Sr VIII, XI, XIII, XIV, XV組的植原體的檢測[16]。因此進一步的研究可以通過選擇一些相對保守，又有一定變異性的、單拷貝基因作為探針設計的靶標基因，來實現(xiàn)不同組之間、組內(nèi)不同亞組乃至不同植原體株系的的區(qū)分。利用管芯片技術對支原體[21]和其他細菌菌株[22-23]的基因分型已有成功的報道。

3.3 管芯片檢測技術具有較高的靈敏度

芯片檢測靈敏度的實驗表明，相比于傳統(tǒng)PCR的方法，管芯片的檢測方法靈敏度提高了1 000倍。這可能是兩個方面的原因：首先管芯片的檢測技術是在PCR擴增的基礎上，結(jié)合顏色反應實現(xiàn)對結(jié)果的判定，其中由酶促反應介導的生物素與底物的顏色反應是一個信號放大的過程，因此提高了靈敏度。其次管芯片檢測在第一步擴增時，所使用的引物組為Pp-fwd/Pp-rev所擴增的片段遠小于引物組R16mF2/R16mR1。因此在同樣循環(huán)的情況下，短片段的擴增效率更高。

3.4 管芯片技術在植原體檢測方面具有較大的應用潛力

植原體病害，具有一些典型的癥狀，如黃化、叢枝等。這些病害作為生產(chǎn)上急需解決的疑難問題，其檢測與鑒定對開展相應的植物保護措施具有指導性的意義。1994年 KHADHAIR[24]首次報道了發(fā)生在加拿大埃德蒙頓地區(qū)的柳樹叢枝病。2012年Zhang[25]報道了發(fā)生在我國內(nèi)蒙古鄂爾多斯等地區(qū)的柳樹叢枝病，并根據(jù)其16Sr DNA的RFLP分析，將其歸類為16SrVI-A組。針對我國出現(xiàn)的一些疑似植原體的病害如牡丹黃化皺葉和柳樹叢枝。我們也進行了管芯片的檢測研究。但是根據(jù)我們管芯片的檢測結(jié)果中，柳樹叢枝和牡丹黃化皺葉的樣品并沒有明顯的植原體信號產(chǎn)生。相比與采用的巢氏PCR的方法，管芯片的檢測靈敏度較弱。但是考慮到巢氏PCR假陽性結(jié)果較高，因此柳樹叢枝植原體的鑒定方面，需要其他方法相互驗證。

4 結(jié)論

本研究基于管芯片技術平臺建立了植原體病害檢測與鑒定的新方法，篩選出一系列具有特異性的探針。所建立的新的檢測方法，相較于普通PCR，其檢測靈敏度提高，省去序列分析鑒定步驟，且具有結(jié)果穩(wěn)定可靠、高通量和檢測時間短等優(yōu)點。因而，在植原體病原菌的診斷、檢測、鑒定和系統(tǒng)分類及病害生態(tài)調(diào)查中會具有較大的應用潛力。

應用管芯片檢測技術，對疑似植原體病害的診斷結(jié)果顯示河南濮陽的紅花槐叢枝的病原應為16SrV組植原體，福建福州的長春花黃化叢枝應為16SrⅠ組植原體；而北京戒臺寺牡丹黃化皺葉和內(nèi)蒙古包頭柳樹叢枝未出現(xiàn)任何植原體?；碾s交信號。同時在本次田間調(diào)查和采樣過程中也發(fā)現(xiàn)一些植原體病害已分布范圍廣、危害嚴重，如泡桐叢枝、棗瘋病等；而另一些病害，比如四川西昌的櫻桃致死黃化、北京懷柔的板栗黃化皺縮、福建泉州的花生和甘薯叢枝、永安的萵苣黃化等。雖然為區(qū)域性病害，但危害和造成的經(jīng)濟損失嚴重，且存在進一步擴展蔓延的風險。

管芯片雜交技術作為一種檢測和鑒別植原體的新方法，可應用于我國植原體病害調(diào)查和診斷，并為植原體病害更為科學有效的防控提供技術支撐。

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(責任編輯：崔 貝)

Diagnostics and Detection of Different Groups Phytoplasmas in China Using an Oligonucleotide Microarray on the Platform of ArrayTube

WANGSheng-jie,LINCai-li,YANDong-hui,YUShao-shuai,LIYong,WANGLai-faPIAOChun-gen,GUOMin-wei,HUAIWen-xia,TIANGuo-zhong

(Key Laboratory of Forest Protection of State Forestry Administration, Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection,Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China)

[Objective]To find the optimal specific probe and develop the detection technique using oligonucleotide microarray on the platform of ArrayTube to detect and identify the phytoplasmas associated with plant disease in China. [Method]PCR amplification and microarray hybridization were used to detect 15 symptomatic plants probably infected with phytoplasma and asymptomatic plants as healthy controls collected from different regions in China. [Result] Phytoplasma 16S rDNA were detected in 13 of 15 symptomatic plants but not in all the healthy controls. Thirteen phytoplasmas were classified into 16Sr I, 16Sr II, 16Sr V and 16Sr XIX groups. Among 17 tested probes, the universal probe designated Pp-502 could be used to detect all phytoplasmas associated with plant disease. The specific probe designated Pp I-465 for 16Sr I group could be used to detect four phytoplasma strains of 16Sr I group associated with paulownia witches’-broom, chinaberry witches’-broom, mulberry dwarf and lettuce yellows. The probe Pp II-629 for 16Sr II could be used to detect three phytoplasma strains 16Sr II group associated with peanut witches’-broom, sweet potato witches’-broom and cleome witches’-broom. Three phytoplasma strains of 16Sr V associated with jujube witches’-broom, cherry lethal yellows andBischofiapolycarpawitches broom and chestnut yellows crinkle phytoplasma of 16Sr XIX could also be detected by specific probes, but they showed obvious cross hybridization with other group probes. Compared with PCR amplification, the sensitivity of microarray to detect phytoplasma in plant increased by 1000-fold. Phytoplasmas of 16SrI and 16SrV group respectively were detected in periwinkle with symptoms of phyllody and witches’-broom collected from Fujian province andRobiniahispidawith symptom of witches’-broom collected from Henan province. While no phytoplasma was detected in peony with symptom of yellowing collected from Beijing and willow with symptom of witches’ broom collected from Inner Mongolia Autonomous Region. [Conclusion]The oligonucleotide microarray on the platform of ArrayTube could be used as a method to investigate phytoplasmas in China, and could provide a sound basis for the phytoplasma identification and classification.

Phytoplasma; detection and identification; 16Sr DNA gene; ArrayTube

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.014

2016-02-01

“十二五”農(nóng)村領域國家高技術研究發(fā)展科技計劃(863)課題(2012AA101501)、林業(yè)微生物資源子平臺運行與服務項目(NIMR2016-7)。

王圣潔(1989—)，男，博士研究生。主要方向：分子植物病理。E-mail:wsjguoyang@126.com
* 致謝：德國Alere公司Regina Heinze博士、孫曉明碩士等提供的技術幫助；河南濮陽林科院謝守江、包頭林科所王立清、北京戒臺寺等提供病害樣品；北京農(nóng)學院任爭光博士提取部分DNA樣品
** 共同通訊作者：田國忠，研究員，博士生導師，從事分子植物病理研究。E-mail: tian3691@163.com；嚴東輝，研究員，碩士生導師，從事樹木微生物及寄主-病原分子互作研究。E-mail: yandh@caf.ac.cn

S763.1

A

1001-1498(2017)01-0099-12