對(duì)INT-FAK信號(hào)通路調(diào)控腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的思考

陳昱文，劉旺華,3，陳娉婷，曹澤標(biāo)，金夢(mèng)，顏艷艷，周小青,3*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)科，湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410208）

對(duì)INT-FAK信號(hào)通路調(diào)控腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的思考

陳昱文1,2，劉旺華1,2,3，陳娉婷1,2，曹澤標(biāo)1,2，金夢(mèng)1,2，顏艷艷1,2，周小青1,2,3*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)科，湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410208）

腦缺血性疾病是人類健康的主要?dú)⑹种唬嚓P(guān)研究表明，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是造成腦缺血疾病中神經(jīng)系統(tǒng)損害的主要機(jī)制之一，而以整合素-黏著斑激酶（INT-FAK）控制調(diào)節(jié)的PI3K/PDK/Akt以及Raf/MEK/ERK兩條主要信號(hào)途徑引起的細(xì)胞凋亡是其主要作用機(jī)制。凋亡過程出現(xiàn)的諸多能加以調(diào)控的信號(hào)分子，都可以作為治療腦缺血性損傷的潛在靶點(diǎn)。隨著對(duì)腦缺血損傷與神經(jīng)細(xì)胞凋亡關(guān)聯(lián)的深入研究，抗凋亡治療已經(jīng)成為治療腦缺血性疾病的重要途徑。

腦缺血；細(xì)胞凋亡；PI3K/PDK/Akt信號(hào)通路；Raf/MEK/ERK信號(hào)通路

本文引用：陳昱文，劉旺華，陳娉婷，曹澤標(biāo)，金夢(mèng)，顏艷艷，周小青.對(duì)INT-FAK信號(hào)通路調(diào)控腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的思考[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（1）：106-110.

腦缺血疾病造成神經(jīng)系統(tǒng)的損傷主要是由神經(jīng)細(xì)胞凋亡引起的，而神經(jīng)細(xì)胞凋亡涉及眾多細(xì)胞分子通路，而以整合素-黏著斑激酶（integrin-focal adhesion k inase，INT-FAK）介導(dǎo)的信號(hào)通路在神經(jīng)細(xì)胞程序性死亡過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，因此近年來一直是研究的熱點(diǎn)。

1 細(xì)胞凋亡和INT-FAK信號(hào)通路

1.1 細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

以細(xì)胞基質(zhì)粘附為媒介，INT-FAK信號(hào)傳遞分子為細(xì)胞凋亡的主要調(diào)節(jié)因子。INT是存在于細(xì)胞表面的一類受體，具有重要的粘附與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能[1]，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,如纖粘連蛋白、層粘連蛋白等是其主要配體[2]。INT通過胞外段與細(xì)胞外基質(zhì)、胞內(nèi)段與細(xì)胞骨架、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和其它一些蛋白相結(jié)合,介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)外之間的信息傳遞。FAK是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一種酪氨酸激酶，在整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有關(guān)鍵作用。FAK可直接與整合素胞內(nèi)域結(jié)合，或通過樁蛋白相連再與整合素發(fā)生聯(lián)系?；罨腇AK可通過下游與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子激活多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[3]，其主要有磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）以及絲裂原活化蛋白激酶raf[4-5]。這兩種激酶的集合及激活，均能啟動(dòng)PI3K/PDK/Akt和Raf/MEK/ERK這兩條激酶信號(hào)通路，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡。因此，PI3K/PDK/Akt及Raf/ MEK/ERK兩種激酶信號(hào)通路是細(xì)胞凋亡激酶信號(hào)傳遞方面的研究熱點(diǎn)。

1.2 INT-FAK信號(hào)通路的組成及調(diào)控

FAK中可以被磷酸化的酪氨酸有6個(gè)：Tyr397、Tyr407、Tyr576、Tyr577、Tyr861和Tyr925，其中Tyr397最為重要。磷酸化的Tyr397能夠與Src的SH2結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用進(jìn)而激活下游通路。Tyr576和Tyr577起著加強(qiáng)激酶活性的作用，其磷酸化對(duì)于FAK的活性具有顯著促進(jìn)作用。FAK在人體中有重要生理作用，其在人體多種組織中都有所表達(dá)并在生理活動(dòng)中擔(dān)任著重要的角色，同時(shí)還參與著胚胎發(fā)育過程。近幾年一些新的發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)AK參與調(diào)控細(xì)胞的各個(gè)過程諸如生長、錨定、遷移、惡變和凋亡等，從而在腫瘤生成過程中起作用。多種細(xì)胞外信號(hào)，如生長因子、機(jī)械牽拉、整合素等都能激活FAK。FAK的N-端與上游分子結(jié)合后，使Tyr397迅速發(fā)生磷酸化，激活FAK?；罨蟮腇AK可與多條下游通路的多種下游分子結(jié)合并催化其磷酸化，從而激活整條通路。目前，這些FAK通路中有2條為研究熱點(diǎn)。

1.2.1 FAK-PI3K通路來自FAK-PI3K途徑的FAK可被纖連蛋白、整合素等發(fā)出的信號(hào)激活，進(jìn)而激活PI3K/Akt通路。激活后的FAK其Tyr397位點(diǎn)可通過結(jié)合PI3K的SH2結(jié)構(gòu)域進(jìn)而將Src活化，組成FAK-Src復(fù)合體?；罨腜I3K激活A(yù)kt的作用主要有兩方面，一是可以通過TSC2-Mtor-S6K途徑調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞生長[6]；二是能參與到Rac-JNK通路中，調(diào)節(jié)基因表達(dá)[7]。FAK/PI3K通路密切參與細(xì)胞的生長及調(diào)控。磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶參與激活A(yù)kt，活化的Akt又可激活E2F、bcl-2家族、叉頭轉(zhuǎn)錄因子、糖原合成酶3和S6蛋白激酶等下游的因子，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、凋亡。當(dāng)細(xì)胞外部信號(hào)刺激細(xì)胞時(shí)，PI3K被激活，活化后產(chǎn)生的PIP3將Akt/PKB遞送至細(xì)胞膜，這一反應(yīng)不僅使得Akt/PKB的催化活性被激活，將其自身的Thr450和Ser124兩個(gè)位點(diǎn)磷酸化，而且使得PDk-1也隨之定位于細(xì)胞膜，PDK-1就可催化Akt/PKB的Thr308和Ser473磷酸化，完全激活A(yù)kt/PKB，點(diǎn)亮整條信號(hào)通路。ILK，F(xiàn)AK和Shc是三種與細(xì)胞存活有關(guān)的整合蛋白相關(guān)信號(hào)的傳導(dǎo)激酶［8］。整合蛋白的集聚，造成FAK的集和與磷酸化，進(jìn)而結(jié)合并激活PI3K；同時(shí)，F(xiàn)AK激活A(yù)kt，由此激活整條PI3K/Akt信號(hào)通路，通過對(duì)細(xì)胞及胞外基質(zhì)粘附的維持，從而阻止細(xì)胞凋亡［9］。ILK借助粘附胞內(nèi)基質(zhì)而活化和遞呈整合蛋白與胞外基質(zhì)間的信號(hào)［10］?；罨蟮腎LK通過PKB/Akt磷酸化實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生存信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)細(xì)胞懸浮時(shí)，ILK的活性受到抑制。當(dāng)FAK、ILK表達(dá)水平較高時(shí)，細(xì)胞由于缺失基質(zhì)的粘附而免于失巢凋亡。Shc刺激活化整合蛋白為媒介的存活信號(hào)通路是通過與αv和β1直接或間接的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。Shc也是PI3K/Akt的主要激活因子之一。在造血干細(xì)胞里，Shc聚集Gab2（可作用于胰島素受體），接下來Gab2聚集p85（PI3K上的調(diào)節(jié)亞基），進(jìn)而激活PI3K，以此來抑制失巢凋亡。

1.2.2 FAK-MAPK通路Raf/MEK/ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)通路又稱ERK通路，該通路包括MEK、Raf、ERK三種激酶，由此組成的三個(gè)功能單位順次被磷酸化繼而激活。在生理環(huán)境下，ERK是MEK唯一的下游底物，因此MEK及ERK在該途徑中具有不可替代的作用。ERK被激活，可借助磷酸化系統(tǒng)將依次將與細(xì)胞膜表面及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)的核糖體S6蛋白激酶(ribosomal protein S6kinase，RSK)類似的一系列蛋白激酶底物激活。ERK與激活后底物協(xié)同進(jìn)入細(xì)胞核，加速環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP responsive element bindingprotein，CREB)等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，從而調(diào)節(jié)lEG如c-Fos、c-Myc、c-Jun、Egrl等基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。FAK-MAPK通路可以被層粘連蛋白5、生長素受體及二型膠原蛋白等傳遞的胞外信號(hào)激活［11］。首先胞外信號(hào)經(jīng)跨膜蛋白同F(xiàn)ERM結(jié)合，活化FAK，然后Grb2和Cas借助脯氨酸-基序1以及Tyr925結(jié)合活化的FAK，從而將Ras/MAPK途徑激活?；罨蟮腇AK可經(jīng)Ras-Raf-MAPK途徑影響細(xì)胞增殖，也可通過Ras-Raf-ERK刺激活化ERK1/2?；罨蟮腅RK1/2可降低TSC2的活性并誘導(dǎo)Cdk與cyclin D1的表達(dá)，調(diào)控mTOR信號(hào)通路及細(xì)胞周期［12］。FAK/MAPK通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，調(diào)控細(xì)胞增殖中起到了重要的作用。

在Raf/MEK/ERK通路中，聯(lián)接后的整合蛋白和纖聯(lián)蛋白可以激活上游的激酶Raf，Raf的激活途徑受PI3K特有的整合蛋白刺激效應(yīng)所控制，即依賴于PAK途徑中PI3K上Ser338位點(diǎn)的酸化［13-14］。通過自身的直接磷酸化以及對(duì)Raf、MEK、ERK的激活，PAK通過參與Ras-MAPK途徑而發(fā)揮阻止細(xì)胞失巢凋亡及促進(jìn)細(xì)胞存活的作用［15］。此外，PAK至Ras-MAPK的反饋通路也受到FAK整合蛋白刺激作用的控制。在成纖維細(xì)胞里，F(xiàn)AK通過磷酸化p130-Cas（停泊蛋白）促成其與Nck（銜接蛋白）的結(jié)合，接下來Nck和PAK發(fā)生整合蛋白的依賴性結(jié)合，協(xié)同PI3K強(qiáng)化Raf-MAPK的反饋通路。

2 PI3K/PDK/Akt通路在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用

PI3K/PDK/Akt通路作為促存活信號(hào)、抗細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)途徑［16］，在腦缺血保護(hù)、抗細(xì)胞凋亡等方面擔(dān)任著重要的角色。伴隨著PI3K的活化，第二信使PIP3產(chǎn)生，接下來PIP3同胞內(nèi)信號(hào)因子Akt、PDK1結(jié)合,激活PDK1的催化作用，催化Akt蛋白Ser308位點(diǎn)的磷酸化，完成其初步活化，之后在PDK2的催化作用下，Akt蛋白Ser473位點(diǎn)被磷酸化，此時(shí)的Akt完全活化［17］。在某些特別條件下，Akt上的Ser473及Thr308位點(diǎn)磷酸化可以被PI3K抑制劑有效抑制［18］，激活的Akt通過催化磷酸化方式對(duì)其下游靶蛋白Caspase9、NF-κB、Bad、FKHR、GSK-3、p27Kip1、p21Cip1等產(chǎn)生激活或抑制作用,進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡等過程進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究表明［19-20］，PI3K/PDK/Akt信號(hào)途徑是通過Bcal-2以外的其他效應(yīng)分子發(fā)揮抗凋亡作用的。

研究表明，PI3K/PDK/Akt通路與腦血氧供給不足導(dǎo)致的損傷有關(guān)。Jiang等［21］通過細(xì)胞體外培養(yǎng)，探討缺血條件下p-Akt與星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞凋亡現(xiàn)象之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)p-Akt表達(dá)量在缺血后6～12 h內(nèi)明顯增多，表明缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與p-Akt之間相關(guān)性良好。Li等［22］首次建立了新生大鼠血氧缺乏動(dòng)物模型，揭示了模型組大鼠的大腦神經(jīng)元中p-Akt蛋白的表達(dá)隨時(shí)間增加而顯著增加，在恢復(fù)供氧后4h表達(dá)量最高，以后逐漸降低，表明PI3K/PDK/Akt通路在血氧供給不足后被激活。AKT磷酸化水平上升，PI3K/PDK/Akt信號(hào)通路在腦缺血致?lián)p的病理過程中起一定作用，且與損傷的程度有關(guān)。研究表明，大腦在發(fā)育期時(shí)血氧供給不足初期隨著PI3K/PDK/Akt信號(hào)通路的激活，p-Akt表達(dá)水平升高，同時(shí)激活PTEN，激活的PTEN又抑制了p-Akt的表達(dá)，最終致使神經(jīng)元細(xì)胞受損［23］。

3 Raf/MEK/ERK通路在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用

腦血氧供給不足造成的損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這種細(xì)胞凋亡多發(fā)于周邊區(qū)以及腦中某些如紋狀體尾殼核和海馬CA1區(qū)及皮層的散在神經(jīng)元等的缺血敏感區(qū)域。研究結(jié)果表明，從缺血核心區(qū)域到周邊區(qū)域，隨著ATP供能的逐漸充足，細(xì)胞狀態(tài)展現(xiàn)出由壞死漸變至凋亡的情況［24］。在局灶性的缺血模型中，永久梗塞組中凋亡細(xì)胞較之缺血再灌組中凋亡細(xì)胞在數(shù)量上顯著偏低［25］，從缺血影響的時(shí)間以及范圍上看，缺血和再灌后相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)，凋亡仍可繼續(xù)作用，例如，在大鼠的局灶性的缺血后再灌注模型中，再灌后的24至48 h為神經(jīng)元凋亡高發(fā)的階段，且由于不同凋亡信號(hào)間廣泛的傳導(dǎo)和級(jí)聯(lián)，細(xì)胞凋亡可以傳播到更大范圍，這也造成不完全缺血較之完全缺血更加嚴(yán)重腦損傷的原由［26-27］。通過對(duì)細(xì)胞凋亡上游信號(hào)的控制可以對(duì)凋亡情況進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而達(dá)到調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程的目的。

在正常生理狀態(tài)下，MEK在通路中下游的底物只有ERK，活化的ERK通過催化磷酸化對(duì)一系列細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的底物進(jìn)行激活，并通過與其共同進(jìn)入細(xì)胞核的方式催化CREB等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子磷酸化，從而對(duì)即刻早期基因(IBEG)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)［28］。研究結(jié)果表明，當(dāng)Raf活性水平達(dá)到一定高度時(shí)，Raf可細(xì)胞增殖起到促進(jìn)作用，但當(dāng)其活性過高時(shí)，又可以造成細(xì)胞周期的分化或阻滯［29］。Raf/MEK/ERK通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生理性應(yīng)答的過程中擔(dān)任著重要角色，其活化后激活信號(hào)持續(xù)的時(shí)間、強(qiáng)度，以及激活前、后通路中各部分細(xì)胞定位的變化，支架、通路蛋白間的相互作用以及其他通路間的互相干擾等因素都可以參與到調(diào)節(jié)編碼蛋白IEG的磷酸化［30］、穩(wěn)定性以及定位等多種應(yīng)答反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)更大范圍下游蛋白表達(dá)的增強(qiáng)。Raf/MEK/ERK通路既能通過對(duì)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)及修飾影響到細(xì)胞凋亡，又能進(jìn)行自身的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，如活化的ERK能通過催化Raf-1的高度磷酸化，進(jìn)而失去其與Ras結(jié)合并形成復(fù)合物的能力，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)該通路進(jìn)展的阻斷［31］。

4 結(jié)語與展望

腦缺血損傷中細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞基質(zhì)粘附蛋白、凋亡相關(guān)因子、激酶蛋白等不同細(xì)胞分子信號(hào)所介導(dǎo)的過程，被介導(dǎo)的效應(yīng)決定細(xì)胞生存或凋亡的命運(yùn)，乃至細(xì)胞的病變及癌轉(zhuǎn)移。由INT-FAK所介導(dǎo)的以PI3K/PDK/Akt與Raf/MEK/ERK為主的信號(hào)通路在腦缺血時(shí)的神經(jīng)保護(hù)作用受到越來越多的關(guān)注。研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的存活具有重要作用，其中發(fā)揮關(guān)鍵作用的是Akt。由PI3K激活的Akt能夠直接和間接影響多種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和促凋亡蛋白活性，增強(qiáng)抗凋亡基因的表達(dá)和抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白活性，從而促進(jìn)細(xì)胞存活。因此，Akt是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子[32]，以Akt為靶點(diǎn)的神經(jīng)保護(hù)劑對(duì)腦缺血治療有深遠(yuǎn)的意義。Raf/MEK/ ERK通路在腦缺血致細(xì)胞凋亡調(diào)控中也起著重要的作用，其任何一個(gè)環(huán)節(jié)無法激活，將導(dǎo)致信號(hào)通路中斷，不能發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng)，弄清這些機(jī)制必然會(huì)為藥物開發(fā)提供更多明確的靶點(diǎn)，并為腦缺血治療奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。大量研究表明，p38和ERK是MAPK通路的關(guān)鍵蛋白,它們主要參與腦缺血以后的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖分化、氧化應(yīng)激等過程[33]。二者都可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)在腦缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮作用，但p38MAPK對(duì)下游其他調(diào)節(jié)因子的具體調(diào)節(jié)機(jī)制還不夠明晰，有待于進(jìn)一步深入的研究。

目前國內(nèi)外對(duì)于腦缺血損傷機(jī)制研究較多，抗腦缺血損傷的藥物也是研究熱點(diǎn)，很多藥物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型以及細(xì)胞研究上往往可以得到良好的療效，但真正用于臨床的抗腦缺血的藥物卻很少，療效不容樂觀。究其原因，一方面可能與腦缺血患者本身病情存在各因素之間的差異有關(guān)。如何根據(jù)臨床患者的致病因素，體質(zhì)差異，損傷程度、病情進(jìn)程等情況的不同，如何選擇不同的藥物以及用藥劑量與使用時(shí)間等是一項(xiàng)重要的研究工作。除此之外，對(duì)于腦缺血具體的損傷機(jī)制及內(nèi)在關(guān)系研究還不明確。腦缺血性損傷涉及的環(huán)節(jié)和參與的分子及信號(hào)通路相當(dāng)廣泛，如參與再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，主要包含Ras/ERK通路、JNK/MAPK通路、p38MAPK三條通路。而其幾條通路不是獨(dú)立產(chǎn)生效應(yīng)的，通路與通路之間廣泛存在著“對(duì)話”，從而導(dǎo)致通路間產(chǎn)生相互協(xié)同或抑制作用[34]。關(guān)于腦缺血損傷所涉及的各種分子與信號(hào)通路之間的關(guān)系，以及通路與通路互相產(chǎn)生的作用如何，還有待于進(jìn)一步探索。隨著上述問題的研究更加全面，更加透徹，將能夠更好的為抗腦缺血的治療研發(fā)出更優(yōu)秀的藥物[35]，以及根據(jù)患者的不同情況提供更為優(yōu)化的治療方案。

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（本文編輯 匡靜之）

The Thinking of INT-FAK Signaling Pathway in Regulation of Neural Cell Apoptosis After Cerebral Ischemia

CHEN Yuwen1,2，LIU Wanghua1,2,3，CHEN Pingting1,2，CAO Zebiao1,2，JIN Meng1,2，YAN Yanyan1,2，ZHOU Xiaoqing1,2,3*
(1.Discipine of TCM Diagnostics,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.The Key Laboratory of TCM Diagnostics in Hunan Province,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208, China 3.Digital Collaborative Innovation Center of TCM,Changsha,Hunan 410208,China,)

Cerebral ischemia has been one of the killers in human health.The studies found that the apoptosis of neurons is an important mechanism leading to cerebral ischemia injury.Its main mechanism is the cell apoptosis caused by two siganal pathways:PI3K/PDK/Akt and Raf/MEK/ERK which were regulated by INT-FAK.The large number of adjustable signal molecules which exist in apoptosis,it can be used as a potential target for the treatment of cerebral ischemic injury. With the intensive study on the relationship between neurons apoptosis and cerebral ischemia,anti-apoptotic therapies have been the valuable methods.

cerebral ischemia;apoptosis;PI3K/PDK/Akt signaling pathway;Raf/MEK/ERK signaling pathway

R743

A

2015-12-29

國家自然科學(xué)基金（81473567、81373702、81202632）；教育部博士點(diǎn)基金（20124323120003）；湖南省自然科學(xué)基金（13JJ3097）；湖南省教育廳科研項(xiàng)目（14B134）。

陳昱文，男，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)診斷學(xué)。

*周小青，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zxq5381@sohu.com。