腫瘤預轉移小生境的形成特點及意義

陳新田陳泓宇王建功施明

華北理工大學附屬唐山市人民醫(yī)院 河北唐山 063000;①軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學院研究所;②徐州醫(yī)科大學腫瘤研究所

腫瘤預轉移小生境的形成特點及意義

陳新田 陳泓宇①王建功施 明②

華北理工大學附屬唐山市人民醫(yī)院 河北唐山 063000;①軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學院研究所;②徐州醫(yī)科大學腫瘤研究所

腫瘤；腫瘤轉移；預轉移小生境

腫瘤轉移是腫瘤患者致死的主要原因，約90%的實體瘤患者死于腫瘤轉移。腫瘤早期轉移灶在臨床上難以探查，多數(shù)患者確診時已處于腫瘤晚期，目前尚無有效的手段預防及控制腫瘤轉移。因此，探索腫瘤轉移的相關分子機制一直是腫瘤研究領域的熱點。

1989年，Paget[1]在對晚期乳腺癌轉移的觀察中，提出了“種子與土壤”假說：作為“種子”的腫瘤細胞可隨循環(huán)系統(tǒng)到達全身，但“種子”只能在特定的“土壤”-靶器官中定植生長。2005年，Kaplan等[2]發(fā)現(xiàn)，基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1,SDF-1)/CXCR4信號軸激活可介導VEGFR-1+骨髓來源造血前體細胞招募至預轉移組織，首次提出“預轉移小生境”(pre-metastatic niche)的概念，進一步完善了“種子與土壤”學說。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，預轉移小生境中各種細胞相互作用，共同決定了播散的腫瘤細胞實現(xiàn)轉移的命運。認識預轉移小生境形成的機制，揭示腫瘤轉移前或轉移灶形成早期的分子事件，對于防止腫瘤轉移或在形成難治愈的轉移灶前清除微小轉移灶具有重要的意義。本文將介紹腫瘤預轉移小生境的形成特點及其在腫瘤轉移和臨床治療中的意義。

1 預轉移小生境的細胞組成

播散的腫瘤細胞在預轉移器官中的成功定植依賴于預轉移部位的微環(huán)境，預轉移小生境的形成是腫瘤細胞與非腫瘤細胞(基質細胞及細胞外基質)相互作用導致機體系統(tǒng)性改變的結果。在腫瘤細胞分泌的多種物質(包括細胞因子、酶)以及由此觸發(fā)的復雜信號網(wǎng)絡的調控下，基質細胞(包括免疫細胞、巨噬細胞、成纖維細胞)歷經(jīng)修飾、馴化及適應過程，導致基質細胞表型、生物學特性及組織結構暫時或永久性的改變。多種基質細胞參與調控預轉移小生境的形成，包括免疫細胞、腫瘤相關巨噬細胞(TAM)、腫瘤相關成纖維細胞(CAF)、周皮細胞(pericyte)等。

1.1免疫細胞 免疫細胞是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與防御病原微生物的免疫應答，并可識別腫瘤抗原。然而，免疫細胞包括中性粒細胞、骨髓來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)、樹突狀細胞(DC)、自然殺傷細胞(NK)以及T、B淋巴細胞等可通過分泌多種細胞因子，參與調控預轉移小生境的形成[3]。目前，關于預轉移小生境形成中免疫細胞的招募及其作用的知識甚少。中性粒細胞為循環(huán)中數(shù)量最大的白細胞，在炎癥發(fā)生時最先到達炎癥局部，通過釋放溶菌酶、活性氧(ROS)、過氧化氫(H2O2)等物質發(fā)揮作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞是招募至轉移組織中的主要免疫細胞。對荷瘤小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞播散至肺組織之前，即可見肺組織中有CD11b+Ly6G+中性粒細胞浸潤。浸潤的中性粒細胞多處于成熟狀態(tài)，但與對照組小鼠肺內的中性粒細胞相比，荷瘤小鼠肺中的中性粒細胞的基因表達譜存在明顯的差異。隨轉移灶的形成，中性粒細胞的數(shù)量可進一步增多。小鼠乳腺癌細胞可誘導γδT細胞產(chǎn)生白細胞介素(IL)-17，驅動循環(huán)中性粒細胞擴增及極化，而中性粒細胞則可抑制CD8+T淋巴細胞的激活，從而有利于腫瘤轉移，提示γδT淋巴細胞/IL-17/中性粒細胞軸在乳腺癌肺轉移中的作用[5]。此外，曹雪濤院士課題組[6]發(fā)現(xiàn)，與對照小鼠相比Toll樣受體3(TLR3)缺陷的小鼠的腫瘤肺轉移明顯減少。其機制是正常的II型肺上皮細胞表面可表達天然免疫受體TLR3，識別腫瘤分泌到循環(huán)系統(tǒng)中的外泌體RNA，觸發(fā)趨化因子(CXCL1,CXCL2, CXCL5, CXCL12)表達，從而招募中性粒細胞至預轉移肺組織，形成炎性微環(huán)境，為腫瘤的轉移提供宜居環(huán)境。

腫瘤細胞可分泌多種腫瘤源性抑制因子(tumor derived suppressor factor,TDSF)，動員骨髓來源的細胞(bone marrow derived cell,BMDC)向原位腫瘤或預轉移部位遷移。例如，腫瘤來源的血管內皮生長因子-A(VEGF-A)、胎盤生長因子(PIGF)可招募VEGFR1+BMDCs向肺預轉移小生境遷移[2]。信號轉導和轉錄活化因子-3(STAT3)組成性活化的腫瘤可通過分泌IL-6和IL-10，導致預轉移肺組織中STAT3活化，誘導成纖維細胞分泌纖連蛋白，進而招募CD11b+骨髓細胞在肺組織中聚集[7]。聚集于預轉移小生境中的MDSC可產(chǎn)生ARG1及ROS，抑制效應T淋巴細胞的殺傷功能[8]。不成熟的MDSC具有單核/巨噬細胞和中性粒細胞的特性[9]，低氧誘導因子-1(HIF-1)可活化NF-κB/G-CSF軸，而G-CSF的分泌則可招募MDSC至肺組織，促進乳腺癌肺轉移[10]。

NK細胞作為固有免疫的效應細胞，可通過細胞毒性作用殺傷腫瘤細胞。然而，腫瘤組織中的NK細胞的細胞毒性明顯降低。Platonova等[11]分析了肺癌患者腫瘤組織中浸潤的NK細胞，發(fā)現(xiàn)這些NK細胞中激活型受體NKp30、NKp80、CD16、NKG2D及DNAM-1的表達水平明顯下調，IFN-γ分泌水平顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌(NSCLC)患者腫瘤組織及外周血循環(huán)中的CD56+CD16- NK細胞高表達VEGF、PIGF、IL-8等細胞因子，肺鱗狀細胞癌(SCC)患者外周血NK細胞亞群亦產(chǎn)生高水平的VEGF和PIGF。體外實驗證實，NSCLC和SCC患者的NK細胞上清可誘導內皮細胞的趨化活性，并可促進體外血管樣結構的形成[12]。這些研究結果提示，患者體內NK細胞分泌的相關因子可誘導預轉移部位的血管生成，參與腫瘤轉移過程。

最近的研究結果提示，Treg可進入淋巴結、肝、肺及骨髓，參與腫瘤預轉移小生境形成的調控[13]，并與MDSC協(xié)同，共同維持預轉移小生境的免疫抑制性微環(huán)境[14,15]。脯氨酰羥化酶可誘導Treg聚集于肺組織，抑制預轉移小生境中CD4+和CD8+T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷[16]。腫瘤相關的調節(jié)性B細胞(Breg)則可通過活化TgfβR1/TgfβR2信號通路，促進MDSC產(chǎn)生ROS和NO，進一步抑制CD4+、CD8+T淋巴細胞的功能[17]。值得注意的是，在不同類型的腫瘤組織中，Treg具有不同的免疫調節(jié)功能[18]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[19]，乳腺癌組織中FOXP3+Treg數(shù)量增多常提示疾病無進展及總生存期縮短，并預示患者5年后復發(fā)的風險增加。但是，當結腸癌組織中浸潤的FOXP3+Treg的數(shù)量增加時，患者5年存活率則提高[20]。關于Treg和Breg在腫瘤轉移以及預轉移小生境中的作用仍缺乏深入的探索。

1.2其他類型的細胞 TAM是腫瘤微環(huán)境中重要的細胞群體，通過多種機制參與調控腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移。利用小鼠移植瘤模型的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞發(fā)生肝轉移前數(shù)月，F(xiàn)4/80+CD11b+巨噬細胞即已被招募至肝臟。從肺癌患者腫瘤組織中分離的TAM高表達Cathepsin K、COX-2、MMP-9、PDGF-B、uPA、VEGFA及HGF，這些細胞因子和酶在腫瘤微環(huán)境重塑的過程中可能發(fā)揮重要的作用[21]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[22]，胰腺導管癌患者中的循環(huán)單核細胞及肝組織中的轉移相關巨噬細胞(metastasis associated macrophage, MAM)可通過高表達的顆粒體蛋白(granulin)激活肝星形細胞產(chǎn)生peritostin，誘導預轉移肝組織纖維化微環(huán)境的形成，以維持轉移至肝臟的腫瘤細胞生長。Qian等[23]報道發(fā)現(xiàn)，腫瘤和基質細胞合成的CCL2可對CCR2+的MAM進行招募，促進乳腺癌細胞在肺組織中的定植。

腫瘤微環(huán)境中存在大量的CAF，但這些CAF的起源尚不清楚[24]。有人認為，CAF發(fā)生于腫瘤EMT的轉化過程[25]，但亦有報道提出爭議。Erez等[26]通過基因轉錄譜的比較分析發(fā)現(xiàn)，皮膚癌、乳腺癌及胰腺癌的CAF表達大量的促炎細胞因子及趨化因子，用PDSC5(HPV-16衍生的皮膚癌細胞系)的培養(yǎng)上清處理正常皮膚成纖維細胞，可使細胞馴化為具有促炎活性的CAF。這就提示腫瘤細胞分泌的TDSFs可隨脈管到達預轉移組織部位，馴化預轉移部位中的成纖維細胞轉化為CAF，參與預轉移小生境的形成，進而介導腫瘤細胞生長、血管形成及巨噬細胞的招募。

2 預轉移小生境的誘導及形成

在腫瘤轉移發(fā)生之前，腫瘤細胞可對遠處器官進行時空性調控，誘導、重塑并形成預轉移小生境。在預轉移小生境形成的初級階段，來自原位腫瘤低氧及炎性環(huán)境的多種TDSF招募BMDC、免疫細胞等至預轉移組織，并對預轉移小生境進行誘導馴化。此時，預轉移小生境尚不能支持轉移腫瘤細胞的定植及生存。隨著招募細胞及其產(chǎn)生的細胞因子或其他分子在預轉移部位的相互作用，間質細胞、ECM及脈管系統(tǒng)的重塑，腫瘤預轉移小生境逐步成熟[27,28]。成熟的預轉移小生境為腫瘤細胞定植、存活及增殖提供了宜居環(huán)境，進而開啟腫瘤轉移的開關。

炎癥和低氧環(huán)境可誘導腫瘤細胞產(chǎn)生TDSF，以旁分泌的方式促進腫瘤細胞浸潤及預轉移小生境形成。腫瘤實質細胞、間質細胞及其釋放的多種細胞因子、生長因子、趨化因子、活化的基質成分、金屬蛋白酶共同參與促炎微環(huán)境的誘導、形成及維持[29]。 Sceneay等[30]應用乳腺癌小鼠模型證實，注射低氧誘導的乳腺癌細胞上清可在缺乏原發(fā)腫瘤的情況下，誘導MDSC進入肺組織。進一步研究發(fā)現(xiàn)，浸潤于肺組織的細胞群體包括CD11b+/Ly6Cmed/Ly6G+ MDSC及CD3-/NK1.1+ NK細胞，提示原發(fā)腫瘤在低氧環(huán)境下產(chǎn)生的細胞因子和生長因子可調控CD11b+/Ly6Cmed/Ly6G+ MDSC及CD3-/NK1.1+/CD11blow/CD27low NK細胞招募至預轉移肺組織，這些細胞將成為預轉移小生境的重要細胞群體。

間質細胞、細胞外基質(ECM)及血管的重塑對于預轉移小生境的形成是十分必要的，它們?yōu)檗D移腫瘤細胞的復蘇、活化、存活及增殖提供了宜居環(huán)境。在發(fā)育過程中，ECM重塑受精確的機制調控，主要通過控制酶的表達及活性而完成。預轉移組織中ECM的重塑可能是預轉移小生境形成的第一步。腫瘤來源的外泌體(exosome)和微泡(microvesicle, MV)含多種miRNA和蛋白分子，這些外泌體或MV被基質細胞捕獲后，可誘導基質細胞生物學行為或功能的改變，并調變ECM。乳腺癌細胞產(chǎn)生的MV可被肺成纖維細胞和腦星形膠質細胞攝取。這些MV中含miR-122，后者可通過下調丙酮酸激酶限制小生境細胞對葡萄糖的攝取，提示腫瘤細胞可能對宿主能量代謝進行重編程，改變預轉移小生境細胞對葡萄糖的利用，從而使腫瘤細胞在預轉移小生境中具有競爭性以維持生存[31]。ECM中膠原沉積、組織纖維化及金屬蛋白酶活性異常是腫瘤ECM的重要特征。除生化特性改變外，腫瘤相關ECM的結構及力學特征亦呈現(xiàn)明顯的異常。Elkabets[32]等的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌移植瘤小鼠骨髓中Sca1+cKit-CD45+造血祖細胞可被招募至腫瘤部位，并可介導成纖維細胞的活化，提示來自原發(fā)腫瘤的內分泌信號通過動員骨髓細胞，誘導基質細胞及ECM重塑，影響預轉移小生境的形成，從而支持轉移的腫瘤細胞在遠處器官定植。

預轉移小生境中的脈管系統(tǒng)直接影響循環(huán)腫瘤細胞的浸潤及轉移。多種TDSF可通過旁分泌的方式調控預轉移小生境中血管、淋巴管的重塑，為腫瘤細胞的轉移及定植提供“營養(yǎng)通路”。對小鼠肺轉移模型的研究發(fā)現(xiàn)，在轉移發(fā)生之前即可觀察到肺局部血管通透性增強。原發(fā)腫瘤分泌的TDSF(如CCL2、TNFα、VEGF等)可直接或間接刺激肺血管內皮細胞CCR2的表達及分泌炎性介質(血清淀粉樣蛋白A3和S100A8)，增強局部血管的通透性，并吸引外周血白細胞及BMDC到達局部高滲區(qū)，從而促進腫瘤細胞侵入肺組織[33]。不同類型的間質細胞活躍地參與了血管系統(tǒng)的重塑。在結直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)原位腫瘤中肥大細胞的浸潤程度及其分泌的類胰蛋白酶(Tryptase)與腫瘤血管密度呈正相關[34]。Orimo等[35]發(fā)現(xiàn)，從浸潤性乳腺癌患者中分離的CAF可通過分泌高水平的SDF-1，招募內皮祖細胞，促進血管生成。

某些腫瘤可優(yōu)先通過癌周淋巴管轉移[36]，發(fā)生淋巴轉移的患者預后較差[37]。Lee等[38]在腹股溝脂肪墊接種的乳腺模型中發(fā)現(xiàn)，用三陰性乳腺癌細胞(MDA-MB-231及SUM-149)的無血清培養(yǎng)上清(TCM組)及無血清培養(yǎng)基(SFM組)分別預處理小鼠，TCM組可較早的發(fā)生腋窩、臂淋巴結及肺轉移，且其發(fā)生轉移的肺及淋巴結中可見明顯的淋巴管生成，提示乳腺癌細胞的培養(yǎng)上清在調控腫瘤轉移的同時，還可能調控預轉移部位的淋巴管形成。隨后實驗發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌細胞系通過分泌的IL-6誘導淋巴管內皮細胞(lymphatic endothelial cells,LECs)中的Stat3磷酸化，介導HIF-1α/VEGF/pStat3-pc-Jun-pATF-2聚合體形成，后者可誘導LECs表達CCL5，從而招募腫瘤細胞至預轉移肺組織和淋巴結[39]。

3 潛在的臨床應用價值

綜上所述，腫瘤轉移依賴預轉移小生境的形成。因此，理論上根據(jù)預轉移小生境的形成過程及其組成特點，阻斷預轉移小生境的形成、抑制腫瘤轉移相關的基質細胞在預轉移部位的招募、抑制腫瘤脈管系統(tǒng)的重塑，有可能成為控制腫瘤轉移的新策略。

Labelle等[40]提出，預轉移小生境形成早期，血小板源性趨化因子(CXCL5和CXCL7)為中性粒細胞的快速招募所必須，阻斷CXCL5/CXCL7的受體CXCR2可減少粒細胞在預轉移部位的聚集及抑制轉移腫瘤的定植。在小鼠乳腺癌模型的研究中，CCL2的中和性抗體可抑制骨髓中單核細胞的動員及乳腺癌肺轉移。但停用CCL2抗體后，可觀察到大量的單核細胞入血、腫瘤血管生成及肺組織中轉移腫瘤細胞的增殖，這一現(xiàn)象主要依賴IL-6、VEGFA實現(xiàn)，而聯(lián)用CCL2和IL-6中和抗體，則可有效抑制腫瘤轉移[41]。

目前，預轉移小生境的形成、功能、維持仍有待進一步深入探索。例如，不同類型腫瘤依賴的預轉移小生境的特性及預轉移小生境的誘導機制有何異同？預轉移小生境產(chǎn)生的決定性因素有哪些？哪些因素可能喚醒預轉移小生境中休眠的腫瘤細胞？相關線索的揭示將有助于抑制腫瘤的轉移和進展以及建立轉移性腫瘤治療的新策略。

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(2017-03-17 收稿)(張愛國 編輯)

R 730.231

A

2095-2694(2017)06-500-05

國家自然科學基金(編號：81572845)。

陳新田(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：腫瘤免疫。

施 明。