增加規(guī)則重復(fù)序列對光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914熱滯活性的影響

王軍 杜榮俸 劉忠淵 毛新芳

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

增加規(guī)則重復(fù)序列對光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914熱滯活性的影響

王軍 杜榮俸 劉忠淵 毛新芳

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

旨在探究光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914結(jié)構(gòu)與熱滯活性（Thermal hysteresis activity，THA）的關(guān)系。采用基因合成的方法，在光滑鱉甲抗凍蛋白基因ApAFP914中增加單個規(guī)則重復(fù)序列并進行蛋白原核表達及熱滯活性測定。結(jié)果顯示，增加單個重復(fù)序列的ApAFP-C914為312 bp，融合蛋白TrxA-ApAFP-C914經(jīng)SDS-PAGE及Western bolt分析表明，分子量為34 kD。差示掃描量熱法（Differential scanning calorimetry，DSC）測定表明，在50 μg/mL的濃度下，增加單個重復(fù)序列顯著提高了ApAFP的THA活性。光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914增加一個重復(fù)序列可顯著提高其熱滯活性。

抗凍蛋白；差式掃描量熱法；重復(fù)序列；熱滯活性

產(chǎn)生抗凍蛋白（Antifreeze protein，AFP）是許多昆蟲應(yīng)對低溫脅迫的方式之一，抗凍蛋白依靠吸附抑制理論吸附在冰晶表面，通過降低溶液的非平衡結(jié)冰溫度（Non-equilibrium freezing point），從而在溶液降溫過程中阻滯冰晶生長，其與溶液熔點（Melting point）間的差值稱為熱滯值（Thermal Hysteresis Activity，THA）［1，2］。AFP的THA隨其結(jié)構(gòu)和濃度進行變化，THA常用于比較不同類型AFP的抗凍活性及評價AFP對于冰晶生長的抑制作用。

AFP結(jié)構(gòu)中的冰晶結(jié)合位點對于其發(fā)揮抗凍活性具有重要作用，通過該位點上規(guī)則排列的一些特定氨基酸與冰晶晶格中的水分子進行相互匹配［3，4］，通過疏水作用力與冰晶晶體面結(jié)合。大多數(shù)昆蟲AFP具有相似的β-螺旋結(jié)構(gòu)［5］，在其結(jié)構(gòu)的單個平面中包含由4-7個冰晶結(jié)合域（Ice binding domains，IBD）組成的冰晶結(jié)合位點（Ice binding site，IBS），而在每個冰晶結(jié)合域中都包含由蘇氨酸組成的TXT基序，這些基序在一個面上的累積形成AFP的IBS［6］。通過對松皮天牛Rhagium mordax AFP的TXT基序進行點突變實驗表明，將TXT基序中非規(guī)則的氨基酸替換為蘇氨酸后，在低濃度下THA增強了2倍［7］，而非TXT基序位點的突變對于RmAFP熱滯活性沒有顯著影響。通過計算機模擬AFP與水分子在低溫下的相互作用，TXT基序經(jīng)過負向突變后，在冰晶生長過程中，突變體蛋白不能穩(wěn)定的結(jié)合在其表面［8，9］以抑制冰晶生長。

目前已有研究表明，增加AFP結(jié)構(gòu)中的規(guī)則重復(fù)序列可以成倍地提高其THA活性［9-11］，然而AFP的THA并沒有隨著重復(fù)序列的不斷增加而提高，雖然在一定程度上增加了蛋白與冰晶的結(jié)合面，然而當(dāng)重復(fù)序列數(shù)超過一定值后會出現(xiàn)熱滯活性下降的情況［11］。因此昆蟲AFP重復(fù)序列與THA的關(guān)系，還有待于進一步研究。

本研究以光滑鱉甲ApAFP-914為藍本，采用DNA合成法，對ApAFP-914基因進行序列改造，在其中增加一個規(guī)則重復(fù)序列的基因片段，使得蛋白結(jié)構(gòu)中的重復(fù)序列數(shù)達到8個，并將人工改造后的ApAFP-C914亞克隆構(gòu)建至原核表達載體pET-32a上，與pET32a-ApAFP-914同步進行誘導(dǎo)表達，純化獲得融合蛋白Trx-ApAFP-914及Trx-ApAFP-C914，用差示掃描量熱法（Differential scanning calorimetry，DSC）測定其熱滯活性［12，13］，并比較兩種蛋白在不同濃度下的熱滯活性，以探索增加規(guī)則重復(fù)序列對ApAFP-914熱滯活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pET32a-ApAFP-914 為本實驗室保存，人工改造基因ApAFP-C914由上海捷瑞（GENEray）公司合成，質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工（Sheng gong），SDS-PAGE試劑盒購自北京賽馳（Cell chip），Ni+純化柱料購自Qiagen公司，感受態(tài)細胞BL21（DE3）及DH5α為北京全式金（Trans gene）公司產(chǎn)品，蛋白純化柱購自Bio-Rad公司，透析袋、超濾膜、超濾管等購自美國Millipore公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 pET32a-ApAFP-C914原核表達載體的構(gòu)建以合成的pET28a-ApAFP-C914為模板，用上游引物：5'-CGCGGATCCGAGTATTATTGTCAAACATGC-3'（BamH I）及下游引物：5'-CCGCTCGAGTTATGGA CATCCTGTTGAACGAGT-3'（Xho I） 進 行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)雙酶切，用DNA連接酶于16℃過夜連接至pET32a載體上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α進行質(zhì)粒擴增，重組載體經(jīng)BamH I和Xho I酶切鑒定后，送予上海生工測序。

1.2.2 TrxA-ApAFP-914和 TrxA-ApAFP-C914的表達及SDS-PAGE檢測 將測序正確的pET32a-ApAFP-C914及pET32a-ApAFP-914轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21（DE3），將含重組質(zhì)粒的單菌落于37℃培養(yǎng)過夜，以1%比例接種，37℃培養(yǎng)4-5 h，當(dāng)菌液的吸光度（OD600）值達到0.6 時，取1 mL未誘導(dǎo)菌液，加入IPTG 至終濃度0.5 mmol/L，于37℃誘導(dǎo)4 h，將誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后的菌液進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.3 TrxA-ApAFP-914和TrxA-ApAFP-C914的純化及Western bolt鑒定 蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，菌體6 000 r/min離心10 min，用7 mL Ni2+-NTA His 結(jié)合緩 沖 液（50 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L Imidazole，pH7.9）充分懸浮，經(jīng)超聲破碎后12 000 r/min離心10 min取上清，過0.22 mm濾器至蛋白純化柱，4℃下結(jié)合3-4 h，而后用10-70 mmol/L咪唑的洗雜緩沖液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）進行梯度洗雜，及含200 mmol/L和250 mmol/L咪唑洗脫緩沖液對目的蛋白進行洗脫。將洗脫得到的蛋白于4℃下于1×PBS（pH7.4）溶液中進行充分透析，經(jīng)超濾濃縮后用Bradford法測定蛋白含量并4℃下保存。參考蛋白Western bolt鑒定方法［14］：將已表達的TrxAApAFP-914及TrxA-ApAFP-C914經(jīng)SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉于4℃過夜封閉，加入1∶3 000稀釋的鼠抗His（室溫反應(yīng)1.5 h、PBST洗滌3次）及1∶5 000羊抗鼠IgG（室溫反應(yīng)1 h、PBST洗滌3次），DAB避光顯色并拍照。

1.2.4 TrxA-ApAFP-914及TrxA-ApAFP-C914熱 滯活性測定 參考DSC測定蛋白樣品的方法［12］并稍加修改，采用差式掃描量熱儀DSC2000（TA Instruments，USA）對樣品進行THA測定，對照為TrxA蛋白。將融合蛋白TrxA-ApAFP-914及TrxAApAFP-C914溶于1×PBS，實驗前準確稱取參比盤、樣品盤及樣品質(zhì)量，據(jù)此設(shè)定實驗參數(shù)。測定流程：將儀器溫度設(shè)定至4℃平衡3 min，以保證測定樣品時熱流基線穩(wěn)定，以3℃/min從4℃降至-30℃，使得待測樣品溶液進行過冷卻（Super cooling），-30℃保持3 min，再以3℃/min從-30℃升溫至10℃保持3 min，依據(jù)溶液的溶解溫度（Tm）設(shè)定樣品的保持溫度（Th）并保持5 min，以3℃/min降至-30℃，根據(jù)THA的定義計算Th與溶液冰晶爆炸生長溫度（To）間的差值（THA=Th-To）。在降溫過程中，溶液中冰晶比例［Nuclei（%）=［1-（-ΔHr/ΔHm）］×100%，ΔHm及ΔHr分別是溶液的溶解焓和重結(jié)晶時的放熱焓］會影響AFP的THA［12，15］，設(shè)定程序在不同保持溫度之間循環(huán)，測定不同晶核比例下的THA活性。

2 結(jié)果

2.1 pET32a-ApAFP-C914載體構(gòu)建

ApAFP-914結(jié)構(gòu)中具有7個包含TXT基序的重復(fù)序列，在分析ApAFP-914蛋白結(jié)構(gòu)后，選取其中一段規(guī)則重復(fù)序列插入于第3-第4個重復(fù)序列之間（表1），以構(gòu)成具有8個重復(fù)序列的ApAFP-C914。

表1 ApAFP-C914與ApAFP-914序列比較

將ApAFP-C914亞克隆至pET32a載體上，提取6個單克隆的質(zhì)粒經(jīng)BamH I及Xho I酶切得到了大小為312 bp的目的片段（圖1），與預(yù)期合成的ApAFP-C914基因大小一致。

圖1 pET32a-ApAFP-C914雙酶切鑒定

2.2 TrxA-ApAFP-C914、TrxA-ApAFP-914的SDSPAGE檢測

融合蛋白TrxA-ApAFP-C914、TrxA-ApAFP-914條帶經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果（圖2）顯示，TrxA-ApAFP-C914、TrxA-ApAFP-914、TrxA大小分別為34 kD、33 kD和23 kD。

圖2 TrxA-ApAFP-C914、TrxA-ApAFP-914及標簽TrxA的SDS-PAGE檢測

2.3 TrxA-ApAFP-914和TrxA-ApAFP-C914的純化及Western bolt鑒定

TrxA-ApAFP-C914及TrxA-ApAFP-914經(jīng)誘導(dǎo)后進行蛋白純化，TrxA-ApAFP-C914及TrxA-ApAFP-914用含有10-70 mmol/L咪唑進行梯度洗雜，洗至60 mmol/L及70 mmol/L咪唑時雜蛋白已徹底去除（圖3），200 mmol/L及250 mmol/L下洗脫出單一的目的條帶。Western bolt結(jié)果表明，TrxA-ApAFPC914及TrxA-ApAFP-914蛋白大小相近，位于35 kD左右，與預(yù)期蛋白分子量相符。

圖3 TrxA-ApAFP-914（A）和TrxA-ApAFP-C914（B）的蛋白純化及Western bolt（C）鑒定

2.4 TrxA-ApAFP-914、TrxA-ApAFP-C914和TrxA的THA測定

TrxA不具有AFP結(jié)構(gòu)中獨特的冰晶結(jié)合域（IBD），理論上不能與冰晶表面結(jié)合并抑制冰晶生長。TrxA在50 μg/mL濃度下，隨著設(shè)定溫度的不斷升高，溶液中的冰核率逐漸降低（表2），測得的THA分別為0、0.01及0.42℃，并且略微改變了溶液冰晶生長過程中的放熱焓曲線（圖4）。

表2 TrxA不同保持溫度下的晶核率及THA（50 μg/mL）

圖4 TrxA（50 μg/mL）不同晶核率下DSC曲線

AFP結(jié)合在冰晶的基本面和棱柱面上阻止水分子結(jié)合在冰晶的表面［6，16］抑制冰晶的進一步生長，當(dāng)溫度降至某一臨界點時，AFP不能繼續(xù)阻止冰晶從而產(chǎn)生爆炸性生長。TrxA-ApAFP-C914在50 μg/mL濃度下隨著Th向溶液Tm逐漸移動，溶液的冰核比例逐漸降低，TrxA-ApAFP-C914的THA活性從0.92℃提高至1.26℃（表3），在DSC測定的熱流峰曲線表征為：隨著溫度降低溶液的起始結(jié)冰過程產(chǎn)生一個延滯（圖5），而后當(dāng)達到某一臨界點時冰晶進行爆炸生長并釋放大量的熱（表3）。

溶液中的冰晶晶核比例會影響AFP的THA，因此采用最低晶核率下的THA進行相互比較。TrxA-ApAFP-914與多數(shù)AFP一樣，THA活性具有濃度依賴性：即隨著蛋白濃度增加，THA也在逐步提高。作為對照的TrxA不具有THA（表4），TrxAApAFP-914隨著濃度提高其THA活性從0.84℃提高至1.12℃，而TrxA-ApAFP-C914的THA則沒有隨著蛋白濃度的提升而改變，且一直穩(wěn)定在一個較高的水平（1.1-1.2℃）。TrxA-ApAFP-C914在50 μg/mL濃度下THA（1.21±0.056℃）顯著高于同濃度下TrxA-ApAFP-914（0.78±0.04℃），然而隨著濃度逐漸提高，差異不顯著（圖6）。

表3 TrxA-ApAFP-C914在不同保持溫度下的晶核率及其THA（50 μg/mL）

圖5 TrxA-ApAFP-C914（50 μg/mL）在不同停滯溫度下的DSC曲線

表4 在低晶核率下TrxA、TrxA-ApAFP-914及TrxA-ApAFP-C914的THA活性比較

3 討論

在低溫保存中，冰晶的形成和生長會導(dǎo)致細胞組織結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞和功能性損傷。昆蟲AFP具有較高的THA，其與冰晶結(jié)合面廣［7］具有較高的親和性，因此在食品藥品及動物組織細胞的低溫儲存中可發(fā)揮重要作用，研究其蛋白結(jié)構(gòu)和功能有助于解釋昆蟲AFP的低溫抗凍機制及其潛在開發(fā)與應(yīng)用。

AFP結(jié)合在冰晶的基本面和棱柱面上阻止水分子結(jié)合在冰晶的表面［6，16］，抑制冰晶的進一步生長，TrxA對冰晶生長的熱流曲線有影響，卻沒有明顯的抑制作用，因此不具有熱滯活性。AFP的冰晶結(jié)合面大小隨著IBDs改變而改變，TrxA-ApAFP-914增加單個規(guī)則重復(fù)序列后，改變了TrxA-ApAFP-914的IBS大小，從而提高其THA。云杉卷葉蛾CfAFP501相較于CfAFP337多增加的兩個重復(fù)序列結(jié)構(gòu)，使得CfAFP的IBS提高了34%，顯著提高CfAFP的THA［10］。ApAFP-914與黃粉蟲TmAFP具有類似結(jié)構(gòu)，TmAFP的多重復(fù)序列構(gòu)建實驗顯示，增加單個重復(fù)序列的TmAFP在0-0.1 mmol/L時THA活性有顯著提高，并且通過NMR對蛋白結(jié)構(gòu)分析表明IBDs位于同一面上［11］，同樣地，松皮天牛RmAFP增加單個重復(fù)序列后在0-0.1 mmol/L濃度范圍內(nèi)THA活性也有顯著提高［8］。

圖6 不同濃度下TrxA、TrxA-ApAFP-C914及TrxAApAFP-914的THA分析

TrxA-ApAFP-914增加單個規(guī)則重復(fù)序列后，在50 μg/mL和100 μg/mL下THA有顯著提高，然而隨著蛋白濃度的提升，逐漸降低了THA之間的差異。TrxA-ApAFP-C914的THA活性在50-500 μg/mL范圍內(nèi)不具有濃度依賴性，原因可能為：在此濃度范圍內(nèi)到達了其活性的平臺期，RmAFP和TmAFP在增加單個規(guī)則重復(fù)序列后，導(dǎo)致蛋白THA更快的進入平臺期，即隨著蛋白濃度的增加，THA活性保持不變［8，11］。因而，本研究中融合蛋白熱滯活性在達到1.1-1.2之間不再變化，與文獻中所報道的規(guī)律相一致。

影響AFP與冰晶結(jié)合的因素包括：抗凍蛋白結(jié)構(gòu)與冰晶晶體的結(jié)合面［6，16，18］、AFP濃度，無機鹽等小分子物質(zhì)對于AFP和冰晶分子形成及生長的作用［18，19］、冰晶生長速率及冰晶生長形成時的機理和過程［16，20］。雖然增加重復(fù)序列提高了ApAFP-914的THA，然而ApAFP-914結(jié)構(gòu)中重復(fù)序列的增加是否改變了蛋白與冰晶晶體面的結(jié)合作用及結(jié)合速率等因素，有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了增加一個規(guī)則重復(fù)序列的ApAFP-C914并將其進行原核表達和純化，獲得具 有THA活 性 的TrxA-ApAFP-C914， 將TrxAApAFP-C914、TrxA-ApAFP-914及TrxA蛋白進行THA活性測定和比較，結(jié)果表明增加單個重復(fù)序列，在低濃度下能夠顯著提高ApAFP-914的熱滯活性。

［1］Devries AL. Antifreeze glycopeptides and peptides：interactions with ice and water［J］. Methods in Enzymology, 1986, 127（127）：293-303.

［2］Duman JG, Wu DW, Olsen TM, et al. Thermal hysteresis proteins［J］. Adv Low Temp Biol, 1993, 2：131-182.

［3］Bang JK, Lee JH, Murugan RN, et al. Antifreeze peptides and glycopeptides, and their derivatives：potential uses in biotechnology［J］. Marine Drugs, 2013, 11（6）：2013-2041.

［4］Davies PL. Ice-binding proteins：a remarkable diversity of structures for stopping and starting ice growth［J］. Trends in Biochemical Sciences, 2014, 39（11）：548-555.

［5］Graether SP, Kulper MJ, Gagné SM, et al. β-Helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect［J］. Nature, 2000, 406（6793）：325-328.

［6］Olijve LL, Meister K, DeVries AL, et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2016, 113（14）：3740-3745.

［7］Graether SP, Sykes BD. Cold survival in freeze-intolerant insects：the structure and function of beta-helical antifreeze proteins［J］. European Journal of Biochemistry, 2004, 271（16）：3285-3296.

［8］Friis DS, Kristiansen E, Solms NV, et al. Antifreeze activity enhancement by site directed mutagenesis on an antifreeze protein from the beetle Rhagium mordax［J］. Febs Letters, 2014, 588（9）：1767-1772.

［9］Kuiper MJ, Morton CJ, Abraham SE, et al. The biological function ofan insect antifreeze protein simulated by molecular dynamics［J］. Elife Sciences, 2015, 4, doi：10. 7554/eLife. 05142.

［10］Leinala EK, Davies PL, Doucet D, et al. A β-helical antifreeze protein isoform with increased activity［J］. Journal of Biological Chemistry, 2002, 277（36）：33349-33352.

［11］Marshall CB, Daley ME, Sykes BD, et al. Enhancing the activity of a beta-helical antifreeze protein by the engineered addition of coils［J］. Biochemistry, 2004, 43（43）：11637-11646.

［12］Mao XF, Liu ZY, Li H, et al. Calorimetric studies on an insect antifreeze protein ApAFP752 from Anatolica polita［J］. Journal of Thermal Analysis & Calorimetry, 2011, 104（1）：343-349.

［13］Amornwittawat N, Wang S, Duman JG, et al. Polycarboxylates enhance beetle antifreeze protein activity［J］. Biochimica Et Biophysica Acta Proteins & Proteomics, 2008, 1784（12）：1942-1948.

［14］Mao XF, Liu ZY, Ma J, et al. Characterization of a novel β-helix antifreeze protein from the desert beetle Anatolica polita［J］. Cryobiology, 2011, 62（2）：91-99.

［15］Verdu JR, Casas JL, Lobo JM, et al. Dung beetles eat acorns to increase their ovarian development and thermal tolerance［J］. PLoS One, 2012, 5（4）：61.

［16］Drori R, Celik Y, Davies PL, et al. Ice-binding proteins that accumulate on different ice crystal planes produce distinct thermal hysteresis dynamics［J］. Journal of the Royal Society Interface, 2014, 11（98）：20140526.

［17］Pertaya N, Marshall CB, Celik Y, et al. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals：basal plane affinity confers hyperactivity［J］. Biophysical Journal, 2008, 95（1）：333-341.

［18］Wen X, Wang S, Amornwittawat N, et al. Interaction of reduced nicotinamide adenine dinucleotide with an antifreeze protein from Dendroides canadensis：mechanistic implication of antifreeze activity enhancement［J］. J Mol Recognit, 2011, 24：1025-1032.

［19］Kim JS, Yethiraj A. The effect of salt on the melting of ice：A molecular dynamics simulation study［J］. Journal of Chemical Physics, 2008, 129（12）：191-195.

［20］Haji-Akbari A, Debenedetti PG. Direct calculation of ice homogeneous nucleation rate for a molecular model of water［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112（34）：10582-10588.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Effect of Regular Repetitive Sequence on the Thermal Hysteresis Activity of Antifreeze Protein ApAFP914 in Anatolica polita

WANG Jun DU Rong-feng LIU Zhong-yuan MAO Xin-fang
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

This work aims to explore the relationship between protein structure and thermal hysteresis activity of antifreeze protein ApAFP914 in Anatolica polita. A regular repetitive sequence was added in the ApAFP914 by gene synthesis. The synthesized gene was then expressed in prokaryotic cells and the thermal hysteresis activity of the protein was determined. Results showed that the gene ApAFP-C914 with a regular repetitive sequence added was 312 bp. The fusion protein TrxA-ApAFP-C914 was verified by SDS-PAGE and Western bolt，and its molecular weight was 34 kD. The measurement by differential scanning calorimetry showed that the thermal hysteresis activity of ApAFP increased significantly（P＜0.05）by adding a regular repetitive sequence at the concentration of 50 μg/mL. Conclusively，adding repetitive sequence may significantly increase the thermal hysteresis activity of antifreeze protein ApAFP914 in A. polita.

antifreeze protein；differential scanning calorimetry；repetitive sequence；thermal hysteresis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.027

2016-05-19

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項目（2012211A022）

王軍，男，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：496269587@qq.com

毛新芳，女，博士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：lilyxjmm@163.com