α-芋螺毒素GIC與Ac-AChBP共結(jié)晶條件的篩選與優(yōu)化

林波 劉坤 朱明月 李偉 董栩 李孟森

（海南醫(yī)學(xué)院海南省腫瘤發(fā)生與干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571199）

α-芋螺毒素GIC與Ac-AChBP共結(jié)晶條件的篩選與優(yōu)化

林波 劉坤 朱明月 李偉 董栩 李孟森

（海南醫(yī)學(xué)院海南省腫瘤發(fā)生與干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571199）

旨在篩選及優(yōu)化α-芋螺毒素與乙酰膽堿結(jié)合蛋白（AChBPs）共結(jié)晶的條件，得到高分辨率的共結(jié)晶晶體。在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)海兔乙酰膽堿結(jié)合蛋白（Ac-AChBP），并用凝膠色譜進(jìn)行純化，把純化的乙酰膽堿結(jié)合蛋白與α-芋螺毒素GIC共結(jié)晶，利用結(jié)晶機(jī)器人及HAMPTON RESEARCH 結(jié)晶試劑盒進(jìn)行結(jié)晶及結(jié)晶條件的篩選與優(yōu)化。結(jié)果顯示，在0.6 mol/ L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.8的條件下生長的晶體較好，其分辨率可以達(dá)到2.1 ?。篩選與優(yōu)化結(jié)晶條件（Ammonium citrate dibasic的摩爾濃度及0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate的pH值）可以得到高分辨率的α-芋螺毒素GIC與Ac-AChBP共結(jié)晶晶體。

α-芋螺毒素GIC；乙酰膽堿結(jié)合蛋白；共結(jié)晶；結(jié)晶條件優(yōu)化

α-芋螺毒素是煙堿型乙酰膽堿受體（nAChRs）的拮抗劑，而乙酰膽堿結(jié)合蛋白（AChBPs）與nAChRs 的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源性較高，AChBPs與nAChRs的藥理特性和離子通道激活機(jī)制相似，因此AChBPs 通常作為研究nAChRs的結(jié)構(gòu)模板［1，2］。多個(gè)AChBPs的x-ray結(jié)構(gòu)已被解析，通過其晶體結(jié)構(gòu)，我們更清楚了解nAChRs的結(jié)構(gòu)。AChBPs有3種，分別是Lymnaea stagnalis、Aplysiacalifornica、Bulinus truncatus， 簡 稱 為Ls-AChBP、Ac-AChBP、Bt-AChBP，它們結(jié)構(gòu)相類似［3，4］，α-芋螺毒素主要與Ac-AChBP 結(jié)合。α-芋螺毒素與Ac-AChBP共結(jié)晶結(jié)構(gòu)不僅幫助我們剖析 nAChRs的生理和病理功能，而且有助于發(fā)現(xiàn)藥效更好的α-芋螺毒素［4，5］。

目前已有5個(gè)α-芋螺毒素與AChBPs共結(jié)晶結(jié)構(gòu)被解析，它們分別是PnIA（A10L D14K）（PDB：2BR8）［5］、ImI（PDB：2C9T，2BYP）［6，7］、TxIA（A10L）（PDB：2UZ6）［8］、BuIA（PDB：4EZ1）和GIC（PDB：5CO5）［9］與Ac-AChBP共結(jié)晶的結(jié)構(gòu)。其中GIC與Ac-AChBP的復(fù)合物結(jié)構(gòu)是我們報(bào)道的分辨率較高的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)。α-芋螺毒素GIC是從殺手芋螺（Conus geographus）中發(fā)現(xiàn)的作用于α3β2 nAChRs的毒素。α3β2 nAChRs是位于腦部的神經(jīng)受體，與記憶、認(rèn)識(shí)相關(guān)。α-芋螺毒素GIC作用于α3β2 nAChRs的IC50 最低濃度為1.1 nmol/L，是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)作用于α3β2 nAChRs的毒素，這一點(diǎn)使它的結(jié)構(gòu)與功能倍受關(guān)注，另外，它與Ac-AChBP結(jié)合的IC50值也較低（29 nmol/L），它與Ac-AChBP的共結(jié)晶的方法可為其他新型α-芋螺毒素與Ac-AChBP或nAChRs共結(jié)晶提供借鑒，為開發(fā)治療疼痛、成癮、帕金森癥、阿爾茨海默氏癥和癲癇等與nAChRs相關(guān)疾病的藥物提供理論依據(jù)［9］。

蛋白結(jié)構(gòu)的解析關(guān)鍵是要獲得高分辨率的蛋白晶體。要獲得高質(zhì)量的蛋白晶體，必須對蛋白結(jié)晶條件進(jìn)行篩選與優(yōu)化［10-12］。蛋白結(jié)晶過程通常是把沉淀劑（池液）加到蛋白質(zhì)溶液表面，沉淀劑從蛋白質(zhì)溶液中吸走水分而引起蛋白結(jié)晶。結(jié)晶條件是指不同的沉淀劑及其摩爾濃度、pH值等因素。這些條件（因素）有上萬種，因此需要利用機(jī)器人進(jìn)行對結(jié)晶條件的大量篩選和優(yōu)化，才能得到分辨率高的晶體。本研究采用正交實(shí)驗(yàn)，并利用機(jī)器人及HAMPTON RESEARCH試劑盒對α-芋螺毒素GIC與Ac-AChBP共結(jié)晶條件進(jìn)行篩選與優(yōu)化，以期獲得高分辨率的晶體。

1 材料與方法

1.1 材料

Ac-AChBP（AChBP from Aplysia californica） 基因［13］根據(jù)NCBI 提供的序列（NM_001204599）設(shè)計(jì)并由上海生工公司合成，在兩端分別引入BamH I、Xho I酶切位點(diǎn)。大腸桿菌宿主菌DH10Bac，昆蟲表達(dá)載體 pFastBac1，昆蟲細(xì)胞Sf9（Spodoptera frugiperda），HAMPTON RESEARCH結(jié)晶試劑 盒PEG/Ion1，PEG/Ion2，Index，Crystal Screen，SaltRX等由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 蛋白表達(dá)與純化 在昆蟲細(xì)胞中分泌表達(dá)Ac-AChBP，分泌表達(dá)的培養(yǎng)基上清液經(jīng)鎳柱純化后，用凝膠色譜進(jìn)一步純化。本實(shí)驗(yàn)所用凝膠色譜柱是 superdex200（GE Healthcare），利用 AKTA（GE Healthcare）系統(tǒng)分離純化，流動(dòng)相HBS溶液（10 mmol/L Hepes，150 mmol/L NaCl，pH7.2）流速為1 mL/min，將蛋白樣品濃縮到1 mL后上樣，利用AKTA程序過柱，自動(dòng)收集樣品。將收集樣品利用SDS-PAGE檢測，并用液氮速凍后置于 -80℃保存［13-16］。

1.2.2 α-芋螺毒素GIC的合成與純化 α-芋螺毒素GIC由上海吉爾生化公司合成，并用C18柱（Vydac，Hesperia，CA，USA）經(jīng)高效液相色譜純化，收集純化的樣品（與標(biāo)準(zhǔn)品比較達(dá)到99.8%）冷凍干燥備用［9］。

1.2.3 Ac-AChBP蛋白結(jié)晶 將純化的Ac-AChBP濃縮至約20 mg/mL。使用液-液擴(kuò)散法在291 k長晶體。具體如下：在96孔板中，用HAMPTON RESEARCH試劑PEG/Ion1，PEG/Ion2，Index，Cystal Screen，SaltRX當(dāng)池液，用結(jié)晶機(jī)器人CRYSTAL GRYPHON（Art robbins instrusmets）點(diǎn)樣，將濃縮蛋白液與池液按1∶1點(diǎn)坐滴，點(diǎn)樣量為0.15 μL，在顯微鏡下觀察晶體生長［9］。

1.2.4 α-芋螺毒素與Ac-AChBP共結(jié)晶 α-芋螺毒素與 Ac-AChBP 共結(jié)晶前，先把它們混合，然后把混合好的溶液去點(diǎn)晶體。已知1 mol Ac-AChBP亞基與1 mol α-芋螺毒素結(jié)合（雖然理論上它們按摩爾比1∶1結(jié)合，但為了使α-芋螺毒素能充分結(jié)合到Ac-AchBP中，把α-半螺毒素的量增加了10倍）。利用ExPASy Protparam tool分析Ac-AChBP吸光指數(shù)為1.5，其分子量為27 kD，取出Ac-AChBP蛋白儲(chǔ)備液（濃度為1.0 mg/mL）1 mL。按以下公式計(jì)算Ac-AChBP蛋白亞基儲(chǔ)備液的mol數(shù)為：

α-芋螺毒素GIC的C端已酰胺化，其分子量為1 610.4 kD，用純化的α-芋螺毒素GIC重量除以其分子量可得到GIC的摩爾數(shù)。 把α-芋螺毒素GIC按摩爾比為10∶1與Ac-AChBP亞基共混。把混和液在室溫放置2 h使其結(jié)合，然后13 000 r/min離心15 min，再用凝膠色譜純化。收集Ac-AChBP與α-芋螺毒素結(jié)合的凝膠純化色譜峰片段，將其濃縮至約20 mg/mL。使用坐滴蒸氣擴(kuò)散法在291 k長晶體，點(diǎn)完晶體后，在顯微鏡下觀察到晶體生長［13-16］。

2 結(jié)果

2.1 Ac-AChBP的制備

在昆蟲細(xì)胞中分泌表達(dá)Ac-AChBP，并用凝膠色譜純化。Ac-AChBP的凝膠純化色譜（圖1-A）顯示，其出峰位置在12.5 mL，根據(jù)Superdex200柱的說明，峰位置為12.5 mL表示約為135 kD的相對分子量。從不同的峰位置a-d收集組分作進(jìn)一步的SDSPAGE膠分析（圖1-B）。圖1-B中a-d是Ac-AChBP蛋白非變性的SDS-PAGE膠圖，即上樣時(shí)，沒有加還原劑和煮沸樣品。Ra-Rd所示是變性的SDSPAGE膠圖，即上樣時(shí)，加還原劑DDT和煮沸樣品5 min。a-d條帶在SDS-PAGE膠頂部（圖1-B），顯示它們非變性狀態(tài)是五聚體，因?yàn)槠涫乔驙畹鞍?，電泳圖只顯示分子量為116 kD，比實(shí)際線型分子量（135 kD）要小。R a-d所示是變性的Ac-AChBP，其由五聚體變?yōu)閱误w，分子量約為27 kD；正好是表達(dá)出來的重組蛋白五聚體分子量的1/5，這一點(diǎn)也說明變性的Ac-AChBP狀態(tài)為單體?；钚誀顟B(tài)為五聚體。

圖1 凝膠色譜（A）和SDS-PAGE（B）分析Ac-AChBP蛋白

2.2 Ac-AChBP結(jié)晶及優(yōu)化

在研究α-芋螺毒素GIC與Ac-AChBP共結(jié)晶條件之前，先研究Ac-AChBP的結(jié)晶條件。原因是共結(jié)晶中Ac-AChBP是個(gè)五聚體的大蛋白，而α-芋螺毒素GIC只結(jié)合在Ac-AChBP上的小多肽。因此Ac-AChBP結(jié)晶的條件是研究共結(jié)晶的前提。Ac-AChBP結(jié)晶條件可以借鑒在共結(jié)晶中。

利用機(jī)器人初步篩選Ac-AChBP的結(jié)晶，選用結(jié)晶試劑盒PEG/Ion1，PEG/Ion2，Index，Crystal Screen，Wizard 1，SaltRX均能得到晶體，把得到的晶體送往上海同步輻射光源收集數(shù)據(jù)，SaltRX的4個(gè)條件（表1和圖2）得到的晶體分辨率較好。在這4個(gè)條件中，15號(hào)（圖2-A）晶體條件得到的晶體數(shù)據(jù)最好，分辨率為3 ?。

表1 SaltRX試劑盒篩選出來長晶體的條件

接著對15號(hào)晶體條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示，對36個(gè)結(jié)晶條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（兩因素，六水平），并把得到的晶體送去收集數(shù)據(jù)，其中最好的晶體數(shù)據(jù)分辨率為2.4 ?，其生長條件為：0.8 mol/L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.6。

圖2 SaltRX試劑盒初步篩選得到晶體

表2 SaltRX的15號(hào)結(jié)晶條件優(yōu)化因素及水平

2.3 α-芋螺毒素與Ac-AChBP共結(jié)晶

2.3.1 α-芋螺毒素與Ac-AChBP結(jié)合 得到2.4 ?的Ac-AChBP晶體后，進(jìn)一步研究其與α-芋螺毒素共結(jié)晶，共結(jié)晶前，先把它們共結(jié)合，結(jié)合的方法按1.2.4所示，α-芋螺毒素與Ac-AChBP結(jié)合后，用凝膠色譜純化。圖3-A藍(lán)線顯示Ac-AChBP與α-芋螺毒素GIC結(jié)合的凝膠純化色譜，紅線是結(jié)合前的Ac-AChBP。圖中藍(lán)線比紅線分子量大，說明Ac-AChBP已與α-芋螺毒素GIC結(jié)合。圖3-B是收集圖3-A藍(lán)線峰組分進(jìn)行SDS-PAGE 膠分析，條帶1是活性五聚體Ac-AChBP結(jié)合α-芋螺毒素GIC，其分子量顯示為100-130 kD之間。而條帶2是變性的藍(lán)線組分，變性后，五聚體Ac-AChBP變?yōu)閱误w，分子量為27 kD。變性后，α-芋螺毒素GIC也解離出來，顯示在SDS-PAGE膠底部。

圖3 凝膠色譜（A）、SDS-PAGE膠（B）分析α-芋螺毒素和Ac-AChBP結(jié)合

2.3.2 α-芋螺毒素GIC與Ac-AChBP共結(jié)晶 收集以上共結(jié)合的凝膠色譜片段（藍(lán)線峰部分），用機(jī)器人去點(diǎn)樣長晶體，結(jié)晶池液采用優(yōu)化Ac-AChBP晶體所得的的條件：0.8 mol/L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.6，也得到α-芋螺毒素GIC與Ac-AChBP共結(jié)晶的晶體，但由于受α-芋螺毒素GIC的影響，其晶體長得不如Ac-AChBP好，還需進(jìn)一步優(yōu)化。

優(yōu)化采用以上優(yōu)化Ac-AChBP的方法（表2），即改變不同沉淀劑的濃度和pH值，以期獲得高質(zhì)量晶體。表2優(yōu)化條件下長出的共結(jié)晶晶體如圖4所示（遴選），把優(yōu)化條件下長出來的晶體送往上海同步輻射光源收集數(shù)據(jù)，其中最好的共結(jié)晶數(shù)據(jù)分辨率為2.1 ?，晶體如圖5所示，其生長條件為0.6 mol/L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.8。收集一套完整的數(shù)據(jù)，經(jīng)HKL2000 處理后數(shù)據(jù)其他指標(biāo)也較好。

圖4 共結(jié)晶條件優(yōu)化得到的晶體（遴選）

圖5 優(yōu)化的α-芋螺毒素GIC與Ac-AChBP共結(jié)晶2.1 ?晶體

3 討論

目前已發(fā)表的α-芋螺毒素與AChBPs共結(jié)晶結(jié)構(gòu)采用的結(jié)晶條件都有所不同，PnIA（A10L D14K）采用的結(jié)晶條件是：17%-18%（W/V）PEG 3350，170-200 mmol/L Na2SO4，100 mmol/L Bis-Tris propane，pH7.5［5］；TxIA（A10L）采用的結(jié)晶條件是：20% polyethyleneglycol 3350 and bistrispropane at pH8.5［8］；ImI在兩個(gè)條件都得到晶體，它們分別是：11%-14% PEG-4000，0.1 mol/L Tris，pH7.5［6］和100 mmol/L sodium acetate（pH5.5）and polyethylene glycol 5000 monomethylether［7］；我們也在兩個(gè)條件下得到GIC的共結(jié)晶，分別是：1.5 mol/L lithium sulfate monohydrate，0.1 mol/L Tris，pH8.5［9］和0.6 mol/L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.8。以上看出，不同的α-芋螺毒素與AChBPs共結(jié)晶其結(jié)晶條件不同，同一α-芋螺毒素得到高分辨率的結(jié)晶條件也可以是多個(gè)。結(jié)晶條件千變?nèi)f化，這可能與結(jié)晶的方法及蛋白的性質(zhì)、純度、緩沖液等因素有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)采用的結(jié)晶方法是液-液擴(kuò)散法（Liquidliquid diffusion），其原理如圖6所示，當(dāng)把沉淀劑滴加到蛋白質(zhì)溶液表面，它通過與蛋白質(zhì)溶液接觸面擴(kuò)散到蛋白質(zhì)溶液中，沉淀劑從蛋白質(zhì)溶液中吸走水分，從而使蛋白質(zhì)溶液濃度不斷增大。因此在兩溶液接觸面形成濃度梯度，隨著沉淀劑擴(kuò)散進(jìn)入的量越多，蛋白質(zhì)溶液濃度就越大。蛋白質(zhì)由不飽和溶液變成飽和溶液，再變成過飽和溶液，從而開始結(jié)晶［10］。

圖6 液-液擴(kuò)散法結(jié)晶原理

我 們 利 用LtIA、TxIB、LvIA、TxID、RegIA、GIC 等多種α-芋螺毒素與Ac-AChBP共結(jié)晶［9，17-20］，在以上條件下有LtIA、LvIA和GIC得到共結(jié)晶晶體。優(yōu)化后GIC分辨率較高，LtIA和LvIA共結(jié)晶晶體的優(yōu)化條件待進(jìn)一步探討。不同的α-芋螺毒素對Ac-AChBP結(jié)晶影響，需要不同的結(jié)晶條件才能得到分辨率高的晶體。另外，每種α-芋螺毒素的溶解度不同，它們的溶解度對共結(jié)晶也有影響。

共結(jié)晶前采用濃度較稀的Ac-AChBP 蛋白液與濃度較稀的α-芋螺毒素溶液先共混好，這種方法可以使α-芋螺毒素更好溶解，因?yàn)樗鼈兿然旌显谳^稀的溶液中，結(jié)合后還要經(jīng)過凝膠色譜純化，所以這種方法不僅使Ac-AchBP和α-芋螺毒素充分溶解和結(jié)合，還可以除去α-芋螺毒素凍干粉中的雜質(zhì)對結(jié)晶的影響。

我們試用另外一種共結(jié)晶方法，即把得到的Ac-AChBP晶體浸泡在α-芋螺毒素溶液中，浸泡時(shí)間為兩周，觀察α-芋螺毒素能否結(jié)合到晶體內(nèi)部。但晶體送往上海同步光源收集數(shù)據(jù)后，分析結(jié)果顯示α-芋螺毒素沒有結(jié)合上Ac-AChBP，這說明α-芋螺毒素與Ac-AChBP共結(jié)晶的方法最好還是Ac-AChBP與α-芋螺毒素溶液先混合好再結(jié)晶，這樣它們才容易結(jié)合并共結(jié)晶。

我們先研究Ac-AChBP蛋白的結(jié)晶條件，然后在此基礎(chǔ)上再研究共結(jié)晶條件，可以避免浪費(fèi)α-芋螺毒素，而且還可以分析每種α-芋螺毒素對共結(jié)晶條件的影響。

4 結(jié)論

本研究表達(dá)與純化海兔乙酰膽堿結(jié)合蛋白（Ac-AChBP），并把它與α-芋螺毒素GIC共結(jié)晶，采用正交實(shí)驗(yàn)，并利用結(jié)晶機(jī)器人及HAMPTON RESEARCH試劑盒對其結(jié)晶條件進(jìn)行篩選與優(yōu)化，在0.6 mol/L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.8的條件下生長出較好質(zhì)量的晶體，其分辨率達(dá)到2.1 ?。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Screening and Optimization of Co-crystallization Condition of α-Conotoxin GIC Complex with Ac-AchBP

LIN Bo LIU Kun ZHU Ming-yue LI Wei DONG Xu LI Meng-sen
（Hainan Provincial Key Laboratory of Carcinogenesis and Intervention，Hainan Medical College，Haikou 571199）

The aim is to screen and optimize the co-crystallization condition of α-conotoxin complex with acetylcholine binding protein（AChBPs），and to obtain co-crystals with high resolution. AChBP from Aplysia californica（Ac-AChBP）was expressed in insect expression system and purified by gel filtration chromatography. Then，the purified Ac-AChBP was co-crystalized with α-conotoxin GIC，further，the HAMPTON RESEARCH crystal kit and the crystal robot were applied screening and optimization of the growth condition of crystallization. Results showed that crystal grew well under the growth condition of 0.6 mol/L ammonium citrate dibasic and pH4.8 of 0.1 mol/L sodium acetate trihydrate，and the resolution of the crystal reached 2.1 ?. In conclusion，the co-crystal of α-conotoxin GIC complex with Ac-AChBP with a high resolution may be acquired via screening and optimization of crystallization condition（The molar concentration of ammonium citrate dibasic and the pH of 0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate）.

α-conotoxin GIC；acetylcholine-binding proteins；co-crystallization；optimization of crystal condition

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.028

2016-06-02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31560243，81560450），海南醫(yī)學(xué)院科研培育基金項(xiàng)目（HY2013-05）

林波，男，助理研究員，研究方向：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；E-mail：linbo_752@163.com

李孟森，男，研究員，研究方向：肝癌耐藥；E-mail：mengsenli@163.com