耐輻射異常球菌dlp基因缺失突變株構(gòu)建及其生物學(xué)功能研究

劉小利江世杰薛冬劉盈盈吳小麗馮帥韓佳慧汪雨舟平淑珍王勁

（1. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；3. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610065；4. 中國人民大學(xué)附屬中學(xué)，北京 100080）

耐輻射異常球菌dlp基因缺失突變株構(gòu)建及其生物學(xué)功能研究

劉小利1，2江世杰2，3薛冬2劉盈盈2吳小麗1，2馮帥1，2韓佳慧2汪雨舟4平淑珍2王勁1，2

（1. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；3. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610065；4. 中國人民大學(xué)附屬中學(xué)，北京 100080）

耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans，DR）因其具有對非生物脅迫超強(qiáng)的抵抗能力而備受關(guān)注。旨在了解該菌親水蛋白Dlp在細(xì)胞耐受非生物脅迫中的作用，采用融合PCR和基因同源重組技術(shù)，獲得了dlp基因缺失突變株Δdlp，對野生型DR及突變株Δdlp進(jìn)行非生物脅迫。結(jié)果表明，dlp的缺失導(dǎo)致DR細(xì)胞對高鹽和氧化脅迫敏感。體外檢測氧化脅迫條件下Dlp蛋白對蘋果酸脫氫酶（MDH）和乳酸脫氫酶（LDH）活性的保護(hù)，結(jié)果顯示，Dlp蛋白的加入能緩解氧化脅迫條件下MDH、LDH酶活性的損失。由此表明，親水蛋白Dlp增強(qiáng)了耐輻射異常球菌對非生物脅迫的抗性，并能以類似分子伴侶的形式保護(hù)脅迫條件下酶的活性。

耐輻射異常球菌；基因突變；親水蛋白Dlp；非生物脅迫；酶活性

非生物脅迫，如干旱、高鹽、高滲等都會直接或間接引起細(xì)胞水分缺失，導(dǎo)致蛋白聚集、脂質(zhì)過氧化、DNA損傷，最終對生物體的生物學(xué)功能產(chǎn)生造成嚴(yán)重影響［1-4］。研究表明親水蛋白是一類甘氨酸含量大于6%，親水指數(shù)大于1，廣泛存在于植物、真菌、細(xì)菌中的小分子蛋白［5，6］。親水蛋白擁有高比例的親水性氨基酸，能形成無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，更好地結(jié)合水分子，也可作為分子伴侶穩(wěn)定蛋白構(gòu)象，保護(hù)脅迫條件下酶、蛋白的活性［7-12］，LEA蛋白作為親水蛋白的重要成員已成為近年來的研究熱點［5，12-18］。

LEA蛋白是一種逆境響應(yīng)蛋白，低溫、干旱、鹽漬、ABA等均可誘導(dǎo)其表達(dá)。其具有廣泛的生物學(xué)功能，如清除活性氧自由基、穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)、保護(hù)酶活性等。Battaglia等［15］根據(jù)LEA蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及親水系數(shù)等將其分為7個家族，其中，LEA3蛋白擁有由11個氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)域（ΦΦΩXΦΨΩΨΦXΩ）［16，17］，可形成親水的α螺旋［14］，能夠避免非生物脅迫引起的細(xì)胞內(nèi)離子損傷［18］，保護(hù)酶的活性不受抑制，尤其是新陳代謝過程中蘋果酸脫氫酶（MDH）及乳酸脫氫酶（LDH）的活性［19，20］。目前關(guān)于LEA3蛋白功能已有許多報道，如鷹嘴豆PM2基因在大腸桿菌中異源表達(dá)能提高大腸桿菌的耐鹽性［21］；TaLEA2基因能改善轉(zhuǎn)基因酵母在山梨醇脅迫下的生長情況［22］；過表達(dá)蛋白TaLEA2與HVA1均可增強(qiáng)酵母對低溫和高滲脅迫的抗性［23］。

Makarova等［24-26］報道耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）基因dlp（dr0105）、dr1172編碼干燥相關(guān)蛋白，為具有較高親水性的LEA3蛋白。通過生物信息學(xué)分析基因dlp編碼蛋白Dlp氨基酸組成及結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)，此蛋白分子含量小，含有大量α螺旋結(jié)構(gòu)，高度親水，含有與LEA3家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域相似的串聯(lián)重復(fù)基序，推測為LEA3類似蛋白，將其命名為Dlp（Deinococcus radiodurans LEA3 protein）。本研究構(gòu)建dlp缺失突變株，探索非生物脅迫條件下其對細(xì)胞生存的影響，并測定體外氧化脅迫條件下Dlp蛋白對MDH和LDH酶活性的保護(hù)作用，旨在進(jìn)一步研究非生物脅迫條件下Dlp蛋白的抗逆功能及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件 耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans，DR1.633）購自中國科學(xué)院微生物菌種保藏中心；高頻轉(zhuǎn)化受體菌大腸桿菌Escherichia coli trans 109，BL21（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)公司；pKatAPH3質(zhì)粒（攜帶Km抗性基因）、原核表達(dá)載體pET32a為本實驗室保存。大腸桿菌用LB培養(yǎng)基（1% Typtone，0.5% Yeast extract，1% NaCl，pH7.0，固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂）在37℃條件下培養(yǎng)；耐輻射異常球菌使用TGY培養(yǎng)基（1% Typtone，0.5% Yeast extract，0.1% glucose；固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂）于30℃下培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、BSA購自New England Biolabs公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購自北京天根科技有限公司，常規(guī)質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收純化試劑盒購自Magen公司；PrimeStar HS DNA Polymerase購自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒購自Promega公司；MDH（來自豬心臟）、LDH、NADH、草酰乙酸購于Sigma公司；其他生化試劑均為分析純。實驗涉及到的引物合成及測序均由華大生物技術(shù)公司完成。

1.2 方法

1.2.1 Dlp蛋白的生物信息學(xué)分析 從NCBI中獲取耐輻射異常球菌基因dlp序列及其編碼蛋白Dlp的氨基酸序列信息，利用軟件DNAMAN和MEGA6、Blast檢索GenBank進(jìn)行多重序列比較及同源性分析，并構(gòu)建進(jìn)化樹；利用Protparam（http://web.expasy. org/protparam/）在線預(yù)測Dlp蛋白的分子質(zhì)量、等電點、穩(wěn)定系數(shù)等性質(zhì)；結(jié)合Kyte等［6］總結(jié)出的氨基酸疏水指數(shù)，利用Protscale（http://web.expasy. org/protscale/）進(jìn)行Dlp蛋白的親/疏水性分析；利用DNAMAN及GOR Ⅳ程序（https://npsa-prabi.ibcp. fr/）預(yù)測Dlp蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用Radar進(jìn)行蛋白重復(fù)基序查詢（http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/radar/）。

1.2.2 突變株Δdlp、異源表達(dá)菌株E32a-dlp的構(gòu)建 從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取dlp基因及其上、下游同源臂片段U、D序列，從質(zhì)粒pKatAPH3獲得帶有啟動子的卡那抗性基因片段（Km）序列，利用Primer Premier 5.0和DNAMAN軟件進(jìn)行PCR引物設(shè)計（表1）。通過融合PCR反應(yīng)：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性30 s，52℃退火20 s，72℃延伸3 min，13個循環(huán)；72℃終延伸5 min。將從pKatAPH3質(zhì)粒上擴(kuò)增的Km反向插入到dlp基因的上、下游U、D之間，獲得三片段融合產(chǎn)物UKD（2 806 bp），將融合產(chǎn)物通過線性轉(zhuǎn)化至野生型D. radiodurans中，通過50 μg/mL卡那霉素抗性篩選最終獲得缺失突變株Δdlp。使用表1中P3/P4、P7/P8、P9/P10及P1/P6 4對引物對Δdlp進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證，并以野生型D. radiodurans為對照，PCR擴(kuò)增的融合產(chǎn)物全長片段QUKD進(jìn)行測序進(jìn)一步驗證實驗結(jié)果的正確性。從DR基因組上擴(kuò)增帶有酶切位點BamH I/ Hind III的片段dlp（B/H），將其與雙酶切后的pET32a載體片段連接獲得重組質(zhì)粒pET32a-dlp，轉(zhuǎn)化至E. coli BL21獲得重組菌株E32a-dlp。轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pET32a作為對照菌株（E32a）。PCR、BamH I/Hind III雙酶切陽性克隆送至華大生物技術(shù)公司測序。

表1 突變株Δdlp與異源表達(dá)菌株E32a-dlp構(gòu)建所用引物

1.2.3 氧化及高鹽脅迫條件下野生型DR與突變株Δdlp表型分析 從劃線培養(yǎng)的平板上挑取活化的野生型DR與突變株Δdlp單菌落，接種至2 mL TGY液體培養(yǎng)基中（突變株Δdlp培養(yǎng)基中含有10 μg/mL Km抗生素），30℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期，將培養(yǎng)好的種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的20 mL TGY液體培養(yǎng)基中（突變株培養(yǎng)基中含有10 μg/mL Km抗生素），培養(yǎng)至對數(shù)初期（OD600約為0.6-0.8），取1 mL菌液（保證DR、Δdlp菌體量一致）。分別同時向DR、Δdlp加入27% H2O2母液，使其終濃度為60 mmol/L和80 mmol/L，對照組不加H2O2，混勻樣品30℃避光30 min。3 000 r/min離心5 min收集菌體，菌體重懸于1 mL 4 mol/L和5 mol/L NaCl懸液中，對照菌株重懸于1 mL無菌水中，30℃，200 r/min溫育6 h。處理后的菌懸液使用無菌水進(jìn)行梯度稀釋混勻，每個稀釋梯度（10-1-10-5）各取10 μL點接于TGY固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)2-3 d，觀察DR和Δdlp在培養(yǎng)基上的生長情況，實驗進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)。

1.2.4 Dlp蛋白的表達(dá)與純化 過夜培養(yǎng)的重組大腸桿菌E32a-dlp按1%接種至500 mL含Amp（50 μg/mL）的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600≈0.6，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，16℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)。8 000 r/min離心10 min收集菌體，用1/20體積NTA-0 Buffer（20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，10% Glycerol，pH7.9）重懸菌體，超聲破碎細(xì)胞，15 000 r/min、15 min離心收集上清。使用鎳柱親和層析純化Dlp蛋白，使用不同咪唑濃度（10、20、60、80和200 mmol/L）的NTA-0緩沖液梯度洗脫，分別收集各梯度洗脫液，SDS-PAGE電泳檢測蛋白純化情況，確定最終洗脫濃度，收集純度較高的Dlp融合蛋白，并采用Brandford法測定蛋白濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 氧化脅迫下MDH、LDH活性的測定 氧化還原酶MDH能催化“蘋果酸+NAD+草酰乙酸+NADH+H+”反應(yīng)，LDH能催化“乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+”反應(yīng)，NADH、NAD+分別在340 nm和260 nm波長處有最大吸收峰。參照Reyes等［1，19］體外檢測MDH、LDH活性的方法，通過檢測A340變化計算MDH、LDH的活性。酶活性測定所用緩沖液如下：MDH酶溶解液（50 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.2），LDH酶溶解液（25 mmol/L Tris-H Cl，pH7.2），MDH反應(yīng)液（0.2 mmol/L草酰乙酸、0.2 mmol/L NADH、150 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.5），LDH反應(yīng)液（100 mmol/L KCl、2 mmol/L丙酮酸鈉、0.15 mmol/L NADH、25 mmol/L Tris-HCl，pH7.5）。

參照表2，按照MDH、LDH與蛋白1∶5的摩爾比混合樣品，選用BSA作為正對照，不加實驗蛋白作為空白對照。將MDH、LDH混合樣品用100和200 mmol/L H2O2分別遮光處理1 h、2 h，取處理后的樣品10 μL混勻到1 mL對應(yīng)反應(yīng)液中，測定反應(yīng)體系起始1 min內(nèi)A340的變化，根據(jù)A340吸收值的減少計算MDH、LDH酶活性變化。每個實驗重復(fù)3次。

表2 MDH、LDH酶活性測定的樣品混合體系/μL

2 結(jié)果

2.1 Dlp蛋白的生物信息學(xué)分析

基因dlp位于D. radiodurans Ⅰ號染色體上，全長492 bp，編碼蛋白由163個氨基酸組成。氨基酸序列比對（圖1-A）顯示，耐輻射異常球菌中含有兩個LEA3家族蛋白Dlp（DR0105）和DR1172，其氨基酸序列一致性較低，僅為16.11%；Dlp蛋白與來源于D. gobiensis的DGo_CA1631、Cyberlindnera jadinii的ODV76513序列一致性分別為22.09%和22.94%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖2-B）顯示，Dlp蛋白與來自Lachancea lanzarotensis的蛋白親緣關(guān)系最近，而與同一來源的DR1172蛋白進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。通過以上分析，推測Dlp蛋白是耐輻射異常球菌所特有的蛋白。

Dlp蛋白分子量為17.83 kD，理論等電點（pI）為5.25，不穩(wěn)定系數(shù)為30.66（＜40），是一類穩(wěn)定蛋白。親/疏水性分析（圖2-A）顯示，Dlp蛋白疏水氨基酸含量顯著少于親水性氨基酸，平均疏水指數(shù)（GRAVY）為-1.263，屬于親水蛋白。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖2-B）顯示，Dlp蛋白有90.18%（147個）氨基酸殘基可能形成α螺旋；2.45%（4個）氨基酸殘基可能形成延伸鏈；7.36%（12個）氨基酸殘基可能形成無規(guī)卷曲。利用Radar進(jìn)行蛋白重復(fù)基序預(yù)測（表3），Dlp蛋白含有5個由16個氨基酸組成的串聯(lián)重復(fù)，與LEA3家族11個氨基酸組成的串聯(lián)重復(fù)序列類似。

2.2 dlp基因缺失導(dǎo)致DR對氧化、高鹽脅迫敏感

通過融合PCR方法成功構(gòu)建dlp基因缺失突變株Δdlp。對Δdlp進(jìn)行PCR驗證，結(jié)果（圖3）顯示，卡那抗性基因成功替換dlp基因整合到DR基因組中，QUKD測序結(jié)果進(jìn)一步驗證結(jié)果的正確性。

對DR、Δdlp進(jìn)行不同濃度H2O2、NaCl脅迫處理，結(jié)果（圖4）顯示，正常培養(yǎng)條件下（未加H2O2和NaCl），DR與Δdlp生存能力保持一致；而在60 mmol/L H2O2脅迫處理30 min后，Δdlp對H2O2敏感性高于野生型DR，80 mmol/L H2O2處理30 min后，Δdlp的生存能力急劇下降；同時，在經(jīng)4 mol/L或5 mol/L NaCl處理 6 h后也表現(xiàn)出與H2O2沖擊相似的結(jié)果（圖4）。該結(jié)果表明，Dlp蛋白對耐輻射異常球菌抵抗高鹽、氧化脅迫過程中起到了重要作用。

2.3 Dlp蛋白的表達(dá)與純化

異源表達(dá)菌株E32a-dlp的PCR及酶切驗證結(jié)果如圖5-A所示。BamH I / Hind III酶切片段與PCR擴(kuò)增片段大小一致，測序結(jié)果進(jìn)一步證實重組質(zhì)粒pET32a-dlp的正確性。對Dlp蛋白進(jìn)行表達(dá)純化，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果（圖5-B）顯示，以未誘導(dǎo)的E32a為對照，E32a-dlp出現(xiàn)1條與Dlp融合蛋白大小（40.83 kD）吻合的條帶。0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下Dlp蛋白能大量表達(dá)，用含10 mmol/L咪唑的NTA-0洗脫液洗脫能去除大量雜蛋白，含60 mmol/L咪唑的NTA-0洗脫液洗脫能獲得較高純度的目標(biāo)融合蛋白Dlp，收集NTA-60洗脫液，用Brandford法測定其濃度為3.3 mg/mL，-80℃保存。

圖1 Dlp蛋白序列比對（A）及系統(tǒng)發(fā)育分析（B）

2.4 氧化脅迫條件下Dlp蛋白對MDH、LDH活性的保護(hù)

為驗證脅迫條件下Dlp蛋白對MDH與LDH酶活性的保護(hù)作用，分別用100和200 mmol/L H2O2對酶混合樣品進(jìn)行避光處理，測定MDH和LDH酶活性，每個實驗重復(fù)3次，將未脅迫樣品的酶活性視為100%，對實驗結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。MDH樣品進(jìn)行1 h避光處理后其酶活性如圖6-A所示，100 mmol/L H2O2處理后，MDH的酶活性下降為31%，200 mmol/L H2O2處理后，MDH的酶活性下降更為明顯（僅剩9.9%）；而加入Dlp蛋白后，100 mmol/L H2O2處理后MDH酶活性為47.3%，200 mmol/L H2O2處理后MDH的酶活性為14.9%，其保護(hù)作用高于蛋白穩(wěn)定劑BSA。100和200 mmol/L H2O2對LDH樣品進(jìn)行2 h避光處理后LDH酶活性的變化情況與脅迫條件下MDH酶活性的變化類似（圖6-B）。以上結(jié)果表明，在氧化脅迫條件下Dlp蛋白能夠保護(hù)MDH、LDH酶活性，且其保護(hù)作用強(qiáng)于BSA。

圖2 Dlp蛋白的親/疏水性分析（A）及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（B）

表3 Dlp蛋白重復(fù)基序

圖3 突變株Δdlp的PCR驗證

3 討論

LEA3蛋白是相對分子質(zhì)量在10-30 kD的一組小分子親水多肽，其Cys、Trp、Phe、Tyr相對含量低，而Ala、Arg、Glu、Gln、Gly含量較高［14］，包含11個氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)域（ΦΦΩXΦΨΩΨΦXΩ）可形成α螺旋結(jié)構(gòu)，可以使LEA蛋白之間形成二聚體結(jié)構(gòu)［14-17］。本研究對Dlp蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Dlp蛋白Cys、Trp、Phe、Tyr總含量為1.2%，而Ala、Arg、Glu、Gln、Gly 總含量56.4%，擁有90.18% α-螺旋結(jié)構(gòu)，為小分子親水蛋白，這與LEA3蛋白的特征相吻合［24-26］；但Dlp蛋白包含16個氨基酸組成的5個串聯(lián)重復(fù)基序，該序列特征不同于典型的LEA3蛋白保守結(jié)構(gòu)域，故本研究Dlp蛋白為LEA3類似蛋白。

LEA3蛋白高比例的α-螺旋具有高度親水性，這一結(jié)構(gòu)特點能保障其自身具有高度的柔性和流動性，促使分子內(nèi)氫鍵的形成，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)可使其在各個方向上拉伸、彎曲和伸展，從而起到穩(wěn)定蛋白和膜結(jié)構(gòu)、束縛無機(jī)離子、結(jié)合水分子、防止細(xì)胞質(zhì)結(jié)晶等作用，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)［1，27，28］，這預(yù)示著非生物脅迫逆境下LEA3蛋白的積累對細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。高鹽與氧化脅迫均會導(dǎo)致體內(nèi)活性氧的積累，引發(fā)細(xì)胞組分破壞、脂質(zhì)過氧化、蛋白聚集及DNA損傷［19，29］。野生型和突變株的非生物脅迫實驗結(jié)果顯示，在高鹽和氧化脅迫條件下野生型和突變株的生存能力顯著弱于正常培養(yǎng)條件下的菌株，且dlp基因的缺失使得細(xì)胞對高鹽、強(qiáng)氧化脅迫更為敏感，生存能力下降的更為顯著。表明Dlp蛋白的表達(dá)對耐輻射異常球菌耐鹽、抗氧化能力起到了促進(jìn)作用，其抗氧化功能與華躍進(jìn)等的研究結(jié)果一致［30-32］。

圖4 不同濃度H2O2、NaCl脅迫對DR、Δdlp生存能力的影響

圖5 異源表達(dá)菌株E32a-dlp的驗證（A）及Dlp蛋白表達(dá)純化（B）

圖6 H2O2脅迫條件下Dlp對MDH（A）及LDH（B）酶活性的保護(hù)

研究表明，大多數(shù)LEA3蛋白可作為分子伴侶協(xié)助蛋白折疊成有活性的結(jié)構(gòu)，防止蛋白聚集，形成天然復(fù)合物從而保護(hù)蛋白和酶活性［10，30］。氧化脅迫產(chǎn)生大量ROS，它們會攻擊氨基酸側(cè)鏈及肽鏈骨架，導(dǎo)致蛋白發(fā)生聚集及片段化，蛋白溶解性降低、蛋白功能遭到破壞、蛋白酶失活［33-36］。MDH、LDH均是對脫水敏感的酶，經(jīng)脅迫處理后結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，Reyes等［8，19］對MDH、LDH進(jìn)行反復(fù)凍融處理發(fā)現(xiàn)它們的酶活性均有不同程度的下降，保護(hù)蛋白的加入使其活性下降趨勢得到緩解。在本研究中，H2O2脅迫下MDH、LDH酶活性也迅速下降（分別為31%、42.5%），隨著H2O2濃度的加大，MDH、LDH酶活性會持續(xù)下降，Dlp蛋白的添加減緩了MDH、LDH酶活性的下降，表明Dlp蛋白對氧化脅迫條件下MDH、LDH的酶活性具有保護(hù)作用，推測Dlp蛋白可能作為分子伴侶對MDH、LDH酶活性發(fā)揮保護(hù)作用，對于其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步實驗驗證。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了dlp基因缺失突變株Δdlp及其外源表達(dá)菌株E32a-dlp。生物信息學(xué)分析顯示Dlp蛋白為LEA3類似蛋白，是耐輻射異常球菌特有的小分子親水蛋白，非生物脅迫實驗表明該蛋白在耐輻射異常球菌耐鹽、抗氧化過程中發(fā)揮重要作用，體外酶活測定實驗顯示其能夠保護(hù)氧化脅迫條件下MDH和LDH的酶活性。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Construction and Biological Characterization of Gene dlp Deletion Mutant of Deinococcus radiodurans R1

LIU Xiao-li1，2JIANG Shi-jie2，3XUE Dong2LIU Ying-ying2WU Xiao-li1，2FENG Shuai1，2HAN Jia-hui2WANG Yu-zhou4PING Shu-zhen2WANG Jin1，2
（1. College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621000；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081；3. College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610065；4. The High School Affiliated to Renmin University of China，Beijing 100080）

Deinococcus radiodurans（DR）has drawn growing attentions for its superior resistance to abiotic stress. To investigate the effect of the hydrophilic protein Dlp in cell tolerance to abiotic stress，the dlp deletion mutant strain（Δdlp）was obtained by fusion PCR and homologous recombination in vivo. The assays of wild strain DR and mutant Δdlp were analyzed under abiotic stress. The results showed that the deletion of dlp gene in D. radiodurans led cells to be more sensitive to high-salt and oxidative stresses. The in vitro protective effect of Dlp protein on the activities of MDH and LDH was measured under oxidative stress condition；and the data demonstrated that the addition of Dlp protein alleviated the loss of activities of MDH and LDH under oxidative stress. Our findings indicated that hydrophilic protein Dlp enhanced the resistance of D. radiodurans to abiotic stresses，and functioned as chaperone-like protein to protect enzyme activity under abiotic stresses.

Deinococcus radiodurans；gene mutant；hydrophilic protein Dlp；abiotic stress；enzyme activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.023

2016-11-07

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（“973計劃”）（2013CB733903）

劉小利，女，碩士研究生，研究方向：特殊環(huán)境微生物功能基因資源利用；E-mail：lxl615wzy@sina.com

王勁，女，博士，研究員，研究方向：微生物分子遺傳學(xué)；E-mail：wjdsz@vip.sina.com