基于四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)的葉綠體啟動(dòng)子在大腸桿菌中活性檢測

于曉俊 曹紹玉 董玉梅 畢保良 張應(yīng)華 許俊強(qiáng)

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省滇臺(tái)特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化工程研究中心，昆明 650201）

基于四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)的葉綠體啟動(dòng)子在大腸桿菌中活性檢測

于曉俊 曹紹玉 董玉梅 畢保良 張應(yīng)華 許俊強(qiáng)

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省滇臺(tái)特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化工程研究中心，昆明 650201）

旨在研究四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)在葉綠體基因工程中調(diào)控啟動(dòng)子活性。以四環(huán)素基因及四環(huán)素特異性識(shí)別序列的核心操控區(qū)為基礎(chǔ)，首先合成帶有四環(huán)素核心操控區(qū)的prrnO1O2啟動(dòng)子，通過酶切連接的方法連接到表達(dá)載體Bio3-GFP，并在大腸桿菌中驗(yàn)證該啟動(dòng)子的活性。結(jié)果表明，在該啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下GFP基因表達(dá)使菌落呈明亮綠色；構(gòu)建四環(huán)素誘導(dǎo)下GFP基因的表達(dá)載體Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP，篩選出適應(yīng)大腸桿菌生長的最高四環(huán)素使用濃度為5 μg/mL；然后構(gòu)建四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)下的GFP表達(dá)載體，在未加入四環(huán)素時(shí)，prrnO1O2啟動(dòng)子的功能被抑制，加入四環(huán)素后，GFP基因表達(dá)出綠色熒光蛋白。說明利用四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)可以在大腸桿菌中控制葉綠體啟動(dòng)子prrnO1O2的活性，從而避免了核基因組對質(zhì)體基因組的調(diào)控干擾，為進(jìn)一步利用質(zhì)體基因工程育種提供有效的方法和途徑。

四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)；葉綠體；啟動(dòng)子；prrnO1O2；大腸桿菌

四環(huán)素誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)（tetracycline regulatory system）始于原核細(xì)胞，后應(yīng)用于植物細(xì)胞，是目前研究最多的誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)。在大腸桿菌的四環(huán)素抗性操縱子的啟動(dòng)子區(qū)存在兩個(gè)基本相同的操縱序列（operator）。轉(zhuǎn)座子Tn10編碼的TetR（tet repressor）蛋白可與上述操縱序列緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，從而抑制四環(huán)素基因的表達(dá)。當(dāng)外源的四環(huán)素分子進(jìn)入細(xì)胞后，可特異結(jié)合TetR蛋白，改變其構(gòu)象而從操縱序列脫離，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物可以形成。按四環(huán)素誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)的表達(dá)特點(diǎn)，可分為激活系統(tǒng)Tet-on和抑制系統(tǒng)Tet-off兩類。添加小分子效應(yīng)劑dox后轉(zhuǎn)錄調(diào)控子rtTA介導(dǎo)基因表達(dá)，雖然在迅速啟動(dòng)基因表達(dá)，但是該系統(tǒng)受到dox長半衰期的抑制，所以Schmidt等［1］通過體內(nèi)選擇分離了導(dǎo)致rtTA-介導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)有效快速關(guān)閉的充當(dāng)dox拮抗劑的rtTA-結(jié)合多肽，這個(gè)肽代表了新型的效應(yīng)分子，通過速轉(zhuǎn)換基因表達(dá)開、關(guān)補(bǔ)充“Tet-系統(tǒng)”。

Normanno等［2］利用TetRs模型尋找多陣列位點(diǎn)，并定量分析人類細(xì)胞單分子追蹤和單細(xì)胞蛋白-DNA聯(lián)合測定的搜索過程，發(fā)現(xiàn)TetRs探索細(xì)胞核并零散的通過3D擴(kuò)散與非同源位點(diǎn)瞬態(tài)交互達(dá)到靶目標(biāo)。Huang等［3］分析了藍(lán)藻細(xì)菌中人工TetR調(diào)控啟動(dòng)子的壓制效應(yīng)下滲漏基因表達(dá)，用L09啟動(dòng)子與L10、L11、L12作對比，DNA開放概率間的差異在TetR結(jié)合位點(diǎn)上是很小的，表明了它們結(jié)合到TetR具有相同的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)，L09啟動(dòng)子泄露問題可能是由于下游區(qū)域RNA聚合酶—啟動(dòng)子的相互作用的增強(qiáng)。此外，有報(bào)道分離了一組與細(xì)菌TetR互作來誘導(dǎo)TetR調(diào)控體內(nèi)基因表達(dá)的多肽［4-7］，這些由1-16個(gè)氨基酸組成的多肽可替代Tc的功能，它們通過結(jié)合到TetR的Tc結(jié)合域發(fā)揮功能［8，9］。

葉綠體基因工程是隨著葉綠體基因組研究的深入而出現(xiàn)的。Boynton等［10］利用基因槍法，用帶有atpB野生型基因的葉綠體DNA直接轟擊3個(gè)含atpB突變型基因的衣藻細(xì)胞，使其完全恢復(fù)了光合能力。Svab等［11］利用類似技術(shù)轉(zhuǎn)化煙草，首次獲得了可穩(wěn)定遺傳的葉綠體轉(zhuǎn)基因植物。目前葉綠體基因組轉(zhuǎn)化技術(shù)已在煙草、番茄、馬鈴薯、擬南芥、大豆、胡蘿卜、花椰菜、油菜、水稻和棉花等高等植物中獲得了成功［12］。Iamtham等［13］利用在同一質(zhì)體中可進(jìn)行多次重組的現(xiàn)象，通過短的正向重復(fù)序列的環(huán)出將選擇標(biāo)記基因刪除，這是一個(gè)持續(xù)的過程，刪除過程復(fù)雜而無法控制。而后Hajdukiewicz等［14］建立了噬菌體Cre/loxp重組酶刪除系統(tǒng)，但操作過程復(fù)雜，并產(chǎn)生了一些不可預(yù)測的葉綠體基因組重排［15］，影響植物的正常生長。

四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)已成為分析生物基因功能的有用工具，Tc很容易通過細(xì)胞膜，因此可能在植物細(xì)胞中發(fā)揮作用。由于Tc屬于影響70S核糖體的抗生素，Tc對蛋白合成的影響可能在葉綠體和線粒體中［16］。使用一定濃度的Tc不抑制葉綠體和線粒體蛋白合成，但誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)仍是一個(gè)有效方法。本研究利用四環(huán)素誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)控制葉綠體啟動(dòng)子的活性，避開核基因組對質(zhì)體基因組的調(diào)控干擾，以期為進(jìn)一步四環(huán)素調(diào)控的質(zhì)體基因工程育種提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本式煙草、表達(dá)載體Bio3-GFP（帶有prrn啟動(dòng)子、GFP報(bào)告基因）為本實(shí)驗(yàn)保存；Trans T1、Trans（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、TransStart FastPfu Fly DNA聚合酶購自北京全式金公司；四環(huán)素購自于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中所用到的表達(dá)載體及從NCBI中搜索煙草ppsbA啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)引物（表1）。

表1 本研究中所用的引物

1.2.2 prrnO1O2啟動(dòng)子的合成 根據(jù)已知的葉綠體啟動(dòng)子prrn，將Tet兩個(gè)核心操縱區(qū)嵌入該啟動(dòng)子中（圖2），將該啟動(dòng)子送昆明碩陽生物公司全基因合成，命名該啟動(dòng)子為prrnO1O2。

1.2.3 煙草葉綠體ppsbA啟動(dòng)子的克隆及活性鑒定 根據(jù)NCBI中煙草（Nicotiana tabacum）葉綠體基因組序列（GenBank：Z00044.2）設(shè)計(jì)引物。提取本氏煙草葉片基因組DNA，ppsbA-F/ppsbA-R為引物。RT-PCR擴(kuò)增體系含ddH2O 14 μL，5×PCR 緩沖液（Mg2+）5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL，引物各1 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，稀釋模板DNA 1 μL。PCR 擴(kuò)增參數(shù)為： 95℃ 2 min；95℃ 20 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s；35個(gè)循環(huán)。將回收目的片段分別連接到pEASY-Blunt simple克隆載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，取陽性克隆進(jìn)行鑒定并測序。將克隆得到的ppsbA啟動(dòng)子與Bio3-GFP載體用Hind III/Xba I雙酶切，回收目的條帶后連接，構(gòu)建Bio3-ppsbAGFP載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并觀察菌體的顏色。

1.2.4 四環(huán)素誘導(dǎo)下的GFP基因的表達(dá)載體構(gòu)建 用Tet-Sal/Tet-Kpn引物對擴(kuò)增TetR，并連接到克隆載體構(gòu)建pB-TetR，然后將pB-TetR載體與Bio3-ppsbA-GFP均使用Sal I/ Kpn I雙酶切構(gòu)建Bio3-ppsbA-TetR（圖1-A）；將合成的prrnO1O2啟動(dòng)子與Bio3-GFP載體均使用Hind III/Xba I雙酶切，回收目的片段后，T4連接酶連接，構(gòu)建Bio3-prrnO1O2-GFP（ 圖1-B）；ppsbA-F/psbA-Hind引 物 對 擴(kuò) 增ppsbA+TetR+psbA區(qū)段，后用Hind III單酶切該區(qū)段，構(gòu)建四環(huán)素誘導(dǎo)下的GFP基因的表達(dá)載體Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP（圖1-C）。

圖1 四環(huán)素誘導(dǎo)下的GFP基因的表達(dá)載體示意圖

1.2.5 四環(huán)素誘導(dǎo)基因表達(dá)的濃度篩選 將構(gòu)建正確的Bio3-ppsbA-TetR在60 μg/mL的Amp LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置不同四環(huán)素濃度梯度，分別為0、1、2.5、5、10、15和20 μg/mL，檢測不同Tc濃度下菌體的生長情況，用于篩選誘導(dǎo)大腸桿菌GFP正常生長、表達(dá)四環(huán)素濃度。

1.2.6 四環(huán)素調(diào)控下的葉綠體啟動(dòng)子活性檢測 將構(gòu)建好的Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP表達(dá)載體的菌株在60 μg/mL的Amp培養(yǎng)基平板上劃單線。一個(gè)平板未加入Tc，另一平板加入5 μg/mL的Tc，培養(yǎng)觀察兩平板中菌株的生長情況。

圖2 prrnO1O2啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)

2 結(jié)果

2.1 prrnO1O2啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)分析

第一個(gè)灰色底紋部分為操縱子O1，位于TATA-box（粗下劃線）的上游第2個(gè)堿基處；第一個(gè)灰色底紋部分為操縱子O2，位于prrn啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)A（雙下劃線）下游第3個(gè)堿基處［17，18］。

2.2 煙草葉綠體ppsbA啟動(dòng)子的克隆及活性鑒定

本研究中所構(gòu)建的載體（圖1-C）含有兩個(gè)表達(dá)盒，故選用不同的啟動(dòng)子來啟動(dòng)不同的表達(dá)盒。以本氏煙草DNA為模板，擴(kuò)增得到煙草葉綠體ppsbA啟動(dòng)子，測序結(jié)果（圖3）表明大小為214 bp，含有原核啟動(dòng)子的-35區(qū)（TTGACA）和-10區(qū)（TATACT），與煙草基因序列（GenBank：Z00044.2）的相似度為100%。構(gòu)建Bio3-ppsbA-GFP載體，經(jīng)過PCR和雙酶切鑒定正確（圖4泳道2）后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在加入60 μg/mL的Amp LB固體培養(yǎng)基上，可以明顯的觀察到菌體呈現(xiàn)綠色（圖5-A），ppsbA啟動(dòng)子啟動(dòng)了下游GFP基因的表達(dá)，表明ppsbA啟動(dòng)子在大腸桿菌中具有啟動(dòng)活性。

圖3 煙草葉綠體啟動(dòng)子ppsbA序列

2.3 三種表達(dá)載體的構(gòu)建

如圖4所示，將構(gòu)建四環(huán)素誘導(dǎo)下的GFP基因的表達(dá)載體Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP使用Hind III單酶切，獲得大小約為1 100 bp的ppsbA+TetR+ psbA表達(dá)盒；將Bio3-prrnO1O2-GFP表達(dá)載體用Hind III/Xba I雙酶切，得到約為250 bp的prrnO1O2啟動(dòng)子；將Bio3-ppsbA-TetR使用Sal I/Kpn I雙酶切得到約為700 bp的TetR基因。綜上，構(gòu)建的3個(gè)表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖4 三種表達(dá)載體的酶切檢測

2.4 四環(huán)素誘導(dǎo)基因表達(dá)的濃度篩選

將構(gòu)建Bio3-ppsbA-TetR在60 μg/mL的Amp LB固體培養(yǎng)基上，同時(shí)設(shè)置四環(huán)素濃度梯度，結(jié)果（表2）顯示，在四環(huán)素的濃度為5 μg/mL時(shí)大腸桿菌菌體正常生長，而10 μg/mL時(shí)大腸桿菌沒有生長，更高濃度時(shí)也沒有生長，說明四環(huán)素的使用最高濃度為5 μg/mL。

表2 不同濃度四環(huán)素對菌落生長的篩選

2.5 prrnO1O2啟動(dòng)子活性在大腸桿菌中檢測

將構(gòu)建好的表達(dá)載體Bio3-prrnO1O2-GFP轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transetta（DE3）中，在含60 μg/mL的Amp LB固體培養(yǎng)基上，菌株大量生長，且GFP表達(dá)，菌體呈明亮的綠色（圖5-B）。表明新合成的葉綠體啟動(dòng)子prrnO1O2能夠在大腸桿菌中啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。

2.6 四環(huán)素調(diào)控下的葉綠體啟動(dòng)子活性檢測

構(gòu)建四環(huán)素誘導(dǎo)下的GFP基因表達(dá)載體Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP。在60 μg/mL的Amp培養(yǎng)基上（未添加Tc），含有該表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌能夠正常生長，但是GFP基因沒有表達(dá)出綠色熒光蛋白（圖5-C），說明TetR蛋白表達(dá)后結(jié)合到prrnO1O2啟動(dòng)子的核心操縱區(qū)上，抑制了prrnO1O2啟動(dòng)子的功能；而后加入5 μg/mL的Tc，大腸桿菌能夠正常生長，GFP蛋白表達(dá)，顯示出綠色的菌體（圖5-D）?？梢哉f明，ppsbA+TetR+psbA表達(dá)盒表達(dá)出的TetR蛋白抑制了prrnO1O2啟動(dòng)子，在四環(huán)素存在的情況下重新釋放prrnO1O2啟動(dòng)子活性，啟動(dòng)下游基因表達(dá)。

3 討論

葉綠體基因在進(jìn)化歷程中有許多轉(zhuǎn)移到核基因組中，遺留在葉綠體中的基因是功能必需的基因，且它們都具有原核性的遺傳表達(dá)體系。外源基因定點(diǎn)插入整合到葉綠體基因組，具有原核生物基因的特點(diǎn)［19］，所以在原核細(xì)胞中對葉綠體啟動(dòng)子進(jìn)行檢測，可以說明葉綠體啟動(dòng)子的活性?，F(xiàn)在對四環(huán)素的TetR-tetO的作用分子機(jī)理已經(jīng)明確：TetR結(jié)合大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn10的兩個(gè)核心操縱子tetO序列（圖1）DNA，行使轉(zhuǎn)錄遏制作用，四環(huán)素阻止TetR結(jié)合tetO序列，使TetR解除轉(zhuǎn)錄抑制作用。O1、O2操縱子均有19 bp，一個(gè)核心堿基以及兩個(gè)反向互補(bǔ)的區(qū)域。TetR氨基酸N端的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序與每個(gè)區(qū)域直接作用，且特異性極高［17，18］。因此本研究參考該分子機(jī)理，將tet兩個(gè)核心操縱區(qū)嵌入prrn啟動(dòng)子中，并連接到GFP基因的上游，在大腸桿菌中表達(dá)出綠色熒光蛋白，說明新合成的啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。

圖5 prrnO1O2啟動(dòng)子及四環(huán)素誘導(dǎo)下的GFP在大腸桿菌中表達(dá)情況

植物葉綠體psbA啟動(dòng)子是葉綠體基因工程中常用的啟動(dòng)子，對于該啟動(dòng)子的研究早有報(bào)道。Elhai［20］證明啟動(dòng)子psbA是魚腥藻7120的內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子，成為魚腥藻穿梭表達(dá)載體最常用的啟動(dòng)子之一。張偉等［21］成功地從萊茵衣藻基因組中克隆出葉綠體psbA啟動(dòng)子片段，獲得了氨芐青霉素和壯觀霉素抗性菌落，驗(yàn)證了啟動(dòng)子活性；晁岳恩等［22］對水稻、小麥、玉米、高粱、大豆、番茄和馬鈴薯等11種植物的葉綠體psbA 基因進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，11種植物psbA基因的ENC（effective number condon）值都小于40，顯示出了明顯的密碼子偏好性。由于本研究中的Bio-GFP中的prrn啟動(dòng)子與新合成的prrnO1O2序列基本相同，不便于表達(dá)載體的構(gòu)建與檢測，故本研究從煙草基因組中擴(kuò)增得到葉綠體啟動(dòng)子psbA，并構(gòu)建了該啟動(dòng)子下的Bio3-ppsbA-GFP驗(yàn)證該啟動(dòng)子的活性，并表明該啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)GFP基因的表達(dá)。

已有報(bào)道水培中含有1 mg/L的Tc對植株沒有生理影響［23-26］。對四環(huán)素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行了Tc誘導(dǎo)濃度的篩選，結(jié)果表明低濃度的Tc（0.1、0.2 mg/L）的誘導(dǎo)效果最好。當(dāng)用0.2 mg/L的Tc處理TetR轉(zhuǎn)基因煙草時(shí)，葉綠素含量達(dá)到最高。四環(huán)素作為誘導(dǎo)劑的通常使用濃度為200 mg/L，但在大腸桿菌中Tet調(diào)控的濃度不同［27］。LoVullo等［28］將Tet操縱子序列克隆到土拉熱桿菌ESL啟動(dòng)子中，并帶有可表達(dá)的TetR，CDABE位于雜合四環(huán)素調(diào)控啟動(dòng)子的下游，加入無水四環(huán)素后轉(zhuǎn)錄起始，誘導(dǎo)濃度在達(dá)到500 mg/L時(shí)細(xì)菌無法生長。本研究中適用的E. coli（DE3）誘導(dǎo)表達(dá)的最高濃度為5 μg/mL，高于上述的土拉桿菌最高使用濃度相同。構(gòu)建的Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP表達(dá)載體在無Tc誘導(dǎo)時(shí)，表達(dá)出來的TetR蛋白結(jié)合到prrnO1O2啟動(dòng)子的核心操縱子區(qū)域，使該合成的啟動(dòng)子無法驅(qū)動(dòng)下游GFP基因的表達(dá)；而在加入5 μg/mL的Tc時(shí)，prrnO1O2啟動(dòng)子重新驅(qū)動(dòng)下游GFP基因的表達(dá)，使菌落呈現(xiàn)出綠色，表達(dá)量降低，可能是由于aadA抗性基因被切除，影響了GFP的表達(dá)，具體原因仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

帶有四環(huán)素核心操縱區(qū)的prrnO1O2啟動(dòng)子和葉綠體ppsbA啟動(dòng)子均在大腸桿菌中具有啟動(dòng)活性，在四環(huán)素調(diào)控下葉綠體prrnO1O2啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)下游GFP基因的表達(dá)，在大腸桿菌中表現(xiàn)出綠色菌體。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Activity Detection of Chloroplast Promoter Based on Tetracycline Regulatory System in Escherichia coli

YU Xiao-jun CAO Shao-yu DONG Yu-mei BI Bao-liang ZHANG Ying-hua XU Jun-qiang
（Dian-Tai Engineering Research Center for Characteristic Agriculture Industrialization of Yunnan Province/Yunnan Agricultural University，Kunming 650201）

In order to study tetracycline regulatory system regulating the activity of promoter in chloroplast genetic engineering，having the tetracycline（Tet）gene and the core regulatory area of TetR（Tet repressor）specific recognition sequences as the basis，the promoter prrnO1O2 with tetracycline core regulatory area was synthetized，then ligated to expression vector Bio3-GFP，and the activity of the promoter was validated in Escherichia coli. The expression of the GFP gene driven by the promoter led colonies to be bright green. The expression vector Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP for GFP gene induced by Tet was constructed，and screening experiment confirmed that the highest concentration of tetracycline for the proper growth of E. coli was 5 μg/mL. Finally，GFP expression vector based on tetracycline regulatory system was constructed，the function of prrnO1O2 promoter was suppressed while without adding tetracycline. GFP gene expressed to be green fluorescent protein after adding tetracycline. These results indicated that tetracycline regulatory system controlled the activity of chloroplasts promoter prrnO1O2 in E. coli，thus avoiding the regulation interference of nuclear genome to plastid genome，and which provides effective ways and methods to plastid genetic engineering breeding further.

tetracycline regulatory system；chloroplast；promoter；prrnO1O2；Escherichia coli

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.022

2016-04-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31560560，30972012），云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2015FD019）

于曉俊，男，碩士研究生，研究方向：園藝蔬菜育種；E-mail：1564810854@qq.com

張應(yīng)華，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：蔬菜育種與生物技術(shù)；E-mail：zhangyh9519@163.com許俊強(qiáng)，男，講師，研究方向：蔬菜分子生物學(xué)；E-mail：xujunqiang101@163.com