豨薟草內(nèi)生抗感染細(xì)菌的分離鑒定及生長特性

陳少紅 趙朋超 陳明釗 李洛宜 李悅 賈靖靖

（河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，洛陽 471023）

豨薟草內(nèi)生抗感染細(xì)菌的分離鑒定及生長特性

陳少紅 趙朋超 陳明釗 李洛宜 李悅 賈靖靖

（河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，洛陽 471023）

豨薟草有多種藥用價值，旨在從豨薟草果實(shí)中分離和篩選出高拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌。采用了形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)、16S rRNA 序列比對、系統(tǒng)發(fā)育樹分析以及OD600值、藥敏試驗(yàn)和超濾等方法對該抗感染細(xì)菌C-5-1進(jìn)行了相關(guān)生物學(xué)特性評價。結(jié)果顯示，C-5-1為側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus），對多種病原細(xì)菌均敏感，尤其是對銅綠假單胞菌；低pH和高NaCl鹽度環(huán)境中耐受性有限，在pH≤5.0或鹽度≥15%時其生長受到了完全的抑制甚至是死亡，但在pH范圍7.0-11.0和鹽度范圍0-5%下均能生長良好，說明該菌株為耐堿，但不耐酸和鹽；篩選出了對菌株C-5-1高度敏感而對5種指示病原菌耐藥的抗生素，即氨芐西林；C-5-1發(fā)酵上清液中存在著兩種抗菌物質(zhì)，且它們的相對分子質(zhì)量均小于2 000。因此豨薟草有著優(yōu)良微生物資源，可以成為開發(fā)抗感染細(xì)菌藥物的重要資源。

豨薟草；側(cè)孢短芽孢桿菌；氨芐西林；耐堿；超濾

微生物已經(jīng)成為新型抗感染藥物的重要來源之一。并且隨著分離技術(shù)的不斷進(jìn)步，分離水平的不斷發(fā)展，更多的微生物可能會被人類發(fā)現(xiàn)利用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生菌存在于各種藥用植物中，菌株分布廣種類多，且在與宿主長期進(jìn)化過程中，形成了產(chǎn)生某些與宿主植物有著相同或者相似藥用價值能力的化合物。因此，藥用植物內(nèi)生菌是一類具有重大開發(fā)潛力的微生物資源。

豨薟草為菊科植物的干燥地上部分，味苦、辛，性寒，小毒，歸肝腎經(jīng)，可以祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、清熱解毒，治風(fēng)濕痹痛、筋骨不利、腰膝無力、半身不遂、高血壓、瘧疾、黃疸、癰腫瘡毒、風(fēng)疹濕瘡、蟲獸咬傷［1］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對豨薟草的研究越來越重視［2-4］，但有關(guān)其內(nèi)生菌資源的研究至今未見報道。

本研究以豨薟草中篩選分離得到的具有抗感染活性的內(nèi)生細(xì)菌菌株為研究對象，并闡述其相關(guān)生物學(xué)特性，旨在為進(jìn)一步研究該菌株的抗感染代謝產(chǎn)物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥用植物 所用材料為無病蟲害、剛成熟的豨薟草果實(shí)，采自河南省洛陽市汝陽縣峴山。

1.1.2 指示菌 5種病原細(xì)菌均由河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室提供。

1.1.3 主要試劑 實(shí)驗(yàn)中使用的PCR酶和DNA Marker購自大連寶生物公司；兩性霉素B購自上海生工；7種藥敏片（濃度均為30 μg/片）購自北京賽為思生物技術(shù)開發(fā)中心；微量生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司；其他化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)。

1.1.4 培養(yǎng)基組分 內(nèi)生細(xì)菌分離采用改進(jìn)的LB瓊脂培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉 5，氯化鈉10，葡萄糖5，瓊脂粉20。液體發(fā)酵采用改進(jìn)的LB液體培養(yǎng)基。為抑制真菌生長，以上培養(yǎng)基使用前，均需加入終濃度為50 μg/mL的兩性霉素B（用二甲基亞砜溶解）。

1.2 方法

區(qū)域內(nèi)出露的地層主要為太古界太華群、中元古界長城系熊耳群、薊縣系高山河群、新元古界官道口群、中生界白堊系、新生界古近系、新近系和第四系等，其中太古界太華群在區(qū)域北部出露，構(gòu)成本區(qū)古老的結(jié)晶基底，主要由一套變質(zhì)達(dá)角閃巖相的中深變質(zhì)巖及少量混合巖組成，為本區(qū)金礦物質(zhì)的主要來源之一。

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化 內(nèi)生細(xì)菌的分離是通過組織表面消毒來去除表生菌，具體操作如下［5］：取新鮮豨薟草果實(shí)，用自來水洗凈，消毒紙吸干，滅菌刀片去皮，然后用無菌水再清洗一遍，接著用75%乙醇浸泡3 min后，用0.1%氯化汞漂洗1-2 min，最后用無菌水沖洗 3次并吸干。將消毒后的果實(shí)切成6 mm大小的組織塊，種植于LB瓊脂平板上，于37℃靜置培養(yǎng)24 h，挑取少許劃線接種到新的LB瓊脂培養(yǎng)基上，反復(fù)純化至單一純菌落，置于4℃冰箱保存待用。為檢測試驗(yàn)材料表面是否徹底消毒，取以上最后1次無菌水沖洗液涂布于LB平板上，于同等條件下培養(yǎng)作為對照，如對照平板無菌落長出即表明消毒徹底，后續(xù)試驗(yàn)所分離到的細(xì)菌來自果實(shí)內(nèi)部，即為內(nèi)生菌。

1.2.2 拮抗細(xì)菌的篩選 以病源細(xì)菌——金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌為指示菌，采用平板對峙法，每一種待測純菌落需做3次重復(fù)。無菌條件下，取100 μL指示菌懸液（1×107CFU/mL）均勻涂布于LB平板上，將每個平板均分成4等份，20 min后將直徑約為6 mm的待測菌塊（瓊脂）貼附于指示菌平板中央（每一等份），37℃培養(yǎng)24 h，觀察各培養(yǎng)板指示菌的生長狀況及抑菌圈大?。ò鷫K直徑6 mm，下同），同時作陽性對照（以氯霉素藥片代替菌塊）。各菌株拮抗效果的判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑＞15 mm 為高度敏感，抑菌圈直徑11-15 mm 為中度敏感，抑菌圈直徑7-10 mm 為低度敏感，無抑菌圈者為不敏感［6］。

1.2.3 菌種鑒定 （1）形態(tài)學(xué)鑒定：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，革蘭氏染色和芽孢染色光學(xué)顯微鏡鏡檢，記錄其顯微形態(tài)。（2）生理生化鑒定：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，對待測菌株進(jìn)行相關(guān)生理生化指標(biāo)測定（微量生化鑒定管）。（3）分子鑒定：將待測菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37℃搖床過夜培養(yǎng)，CTAB法提取基因組，細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3'）對提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增［7］。所得PCR產(chǎn)物送至上海生工測序。在NCBI 數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行序列相似性分析，再利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 為了后續(xù)試驗(yàn)的開展，本研究需要對待測菌和5種指示菌做藥敏試驗(yàn)。結(jié)合指示菌的臨床藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選取了6種藥敏片，即頭孢他啶、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明、氨芐西林、青霉素以及四環(huán)素。

1.2.5 生長特性分析 待測菌經(jīng)LB液體活化3次，取活化好的種子液以1%的接種量分別接種到不同pH梯度（3.0、5.0、7.0、9.0、10.0和11.0）和NaCl濃度（1%、2%、5%、10%、15%和20%）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h后，在600 nm 波長下測定OD 值，以上每個梯度分別設(shè)置3個重復(fù)（為了滿足所測得的吸光度值與細(xì)菌濃度成線性比例關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)首先將不同梯度下的培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋至OD600=0.3-0.7，然后將所測得的具體數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)即為該梯度下的OD600值）。

1.2.6 抗菌代謝產(chǎn)物的初步純化 將待測菌株接入LB液體培養(yǎng)基中（50 mL），30℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經(jīng)離心（8 000 r/min，10 min）去除菌體得上清，然后用等體積的乙酸乙酯萃取3次，有機(jī)相和水相分別經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用2 mL無菌水將其溶解，取200 μL測量對指示菌的拮抗活性，重復(fù)操作3次。將有抗菌活性的水溶液依次經(jīng)過截留相對分子質(zhì)量（Mr）為10 kD、5 kD和2 kD的超濾離心管，4℃，12 000 r/min下離心30 min，分別收集相應(yīng)的濾出液及截留液，放入-70℃冰箱凍存，并進(jìn)行冷凍干燥，得到的冷凍干燥粉末-70℃保存?zhèn)溆?。使用前再將干燥粉末加入? mL無菌水，分別獲得濾出液及截留液。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離及抑菌效果

如表1所示，從豨薟草果實(shí)中共分離得到15株內(nèi)生細(xì)菌，其中具有抑菌活性的8株，較明顯的3 株，編號為C-2、C-4、C-5-1，尤以菌株C-5-1的效果最好，對提供的幾種病原細(xì)菌均顯示出一定的抑制作用（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌中度敏感以上），圖1為菌株C-5-1對銅綠假單胞菌的抑菌活性。說明該菌株是一種廣譜的抗感染細(xì)菌且效果顯著，具有較高的研究價值和應(yīng)用前景。因此，本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展就是以C-5-1為實(shí)驗(yàn)菌株。

表1 豨薟草果實(shí)內(nèi)生拮抗細(xì)菌的抑菌篩選

圖1 菌株C-5-1（A、C）和C-6（B、D）對銅綠假單胞菌的抑菌效果

2.2 菌株C-5-1的鑒定分析

光學(xué)顯微鏡染色觀察，菌株C-5-1的細(xì)胞呈桿狀，芽孢側(cè)生。革蘭氏染色結(jié)果可變，對數(shù)期時染色結(jié)果為陽性，穩(wěn)定期時變?yōu)殛幮浴?/p>

通過表2所得的16項(xiàng)生理生化試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，判斷該菌株可能是側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）。

以菌株C-5-1的基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增和測序獲得了16S rRNA 基因的部分片段（1 438 bp），NCBI GenBank登錄號為KX170837。選擇同源性較近的菌株與C-5-1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示（圖2）該菌株與側(cè)孢短芽孢桿菌的同源關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果，確定為側(cè)孢短芽孢桿菌，該菌株被命名為C-5-1。

表2 C-5-1部分生理生化特征

圖2 基于16S rRNA基因序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 藥敏分析

藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，5種指示菌對氨芐西林均完全耐藥，而本研究所分離得到的菌株C-5-1對氨芐西林是高度敏感的。因此，在后續(xù)摸索抗菌代謝物的純化方案中，可以向LB固體培養(yǎng)基中加入適宜濃度的氨芐西林，以抑制發(fā)酵液和純化液中菌株C-5-1的生長，而指示菌（銅綠假單胞菌）正常生長。

表3 五種指示菌與側(cè)孢短芽孢桿菌C-5-1的藥敏分析

2.4 菌株C-5-1的生長特性

分別測定細(xì)菌在不同酸堿度和鹽度的生長特性，從而為該菌株的進(jìn)一步培養(yǎng)和發(fā)酵利用提供依據(jù)。結(jié)果（表4）顯示，側(cè)孢短芽孢桿菌C-5-1在低pH環(huán)境中耐受性有限，在pH≤5.0時幾乎沒有生長，但在pH≥7.0時生長良好，并且隨著pH值的升高，菌體量也一直在增加，這說明該菌株耐堿不耐酸。菌株C-5-1在NaCl鹽度≤5%（相當(dāng)于50 g/L）時正常生長，但隨著鹽度的增加該菌株的生長受到了一定的抑制，當(dāng)鹽度≥15%時，其生長受到了完全抑制甚至死亡。這是因?yàn)椴煌}度能形成不同滲透壓環(huán)境，造成細(xì)胞不同程度的脫水，從而降低生長速率，甚至失活。

表4 側(cè)孢短芽孢桿菌C-5-1生長特性值

2.5 菌株C-5-1抗菌代謝產(chǎn)物的初步純化

由表5可知，側(cè)孢短芽孢桿菌C-5-1發(fā)酵液的乙酸乙酯相和水相都有明顯的抑菌圈，直徑分別為（28.3±0.8）mm和（29.9±0.5）mm，指示菌為銅綠假單胞菌，這說明該菌株不止產(chǎn)生一種抗菌物質(zhì)。后又通過超濾離心管對二者進(jìn)行了純化，研究表明這兩種抗菌代謝產(chǎn)物的分子量均小于2 000。

表5 側(cè)孢短芽孢桿菌C-5-1純化液的抑菌活性

3 討論

內(nèi)生細(xì)菌在適宜生境中能通過發(fā)酵獲得大量目的活性產(chǎn)物，從而可以緩解某些藥用植物資源短缺、生長周期長、生態(tài)系統(tǒng)損害等現(xiàn)象，并能為新藥開發(fā)與瀕危藥用植物保護(hù)等難題提供重要思路［8，9］。由于病原菌耐藥性增加等問題的日益凸顯，使得尋求天然、高效、綠色的替代品更加重要。

側(cè)孢短芽孢桿菌最初是由Laubach［10］于1916年從淡水中分離得到，并根據(jù)它的形態(tài)及生理生化特性將其歸為芽孢桿菌屬，到1996年，Shida等［11］按近代生物分類學(xué)將其重新劃分為短芽孢桿菌屬。據(jù)報道側(cè)孢短芽孢桿菌具有廣譜抗菌活性，尤其是對細(xì)菌和真菌［12］。近期的全基因組測序結(jié)果表明，側(cè)孢短芽孢桿菌還具有產(chǎn)生聚酮化合物和非核糖體肽等多種抗感染藥物的潛力，因此其醫(yī)用功能潛力巨大［13-15］。Barsby等［16］從巴布亞新幾內(nèi)亞海岸熱帶海水中分離得到一株側(cè)孢短芽孢桿菌，能產(chǎn)生聚酮類Basiliskamides等多種化合物，可以有效抑制大腸埃希菌和白色念珠菌。同樣也是從海洋中分離得到的菌株P(guān)NG276能明顯地抑制腸球菌的生長［17］。Yang等［18］從菌株OSY-I1分離到一種能抗革蘭氏陽性菌生長的脂肽抗生素Brevibacillin。本研究從豨薟草果實(shí)中獲得一株具有較強(qiáng)抗感染活性的耐堿側(cè)孢短芽孢桿菌C-5-1，并且結(jié)合其代謝產(chǎn)物的物化性質(zhì)，推測它們可能是新型抗菌物質(zhì)。預(yù)示著該菌株具有非常高的開發(fā)價值，極可能取代部分抗生素進(jìn)行應(yīng)用。

由于后續(xù)對菌株C-5-1抗感染活性的研究是以其代謝產(chǎn)物為主，為了降低成本和縮短時間，本研究開展了實(shí)驗(yàn)菌株C-5-1與5種指示菌的藥敏試驗(yàn)，以期篩選到對C-5-1高度敏感而對指示菌耐藥的抗生素，結(jié)果表明氨芐西林能滿足此要求。在測量抑菌活性時，首先向熔化的固體培養(yǎng)基中加入適宜濃度的氨芐西林，然后指示菌涂布于平板表面，并將待測樣品直接置于平板中央0.8 cm的孔中。如果按傳統(tǒng)做法，樣品需要經(jīng)過孔徑為0.22 μm的濾膜過濾后再加入。

4 結(jié)論

豨薟草可作為優(yōu)良微生物資源的來源，從而為開發(fā)新型天然抗感染藥物提供寶貴的資源。

［1］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典［M］. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2015：348.

［2］Lu Y, Qian RQ, Xiao J, et al. Kirenol attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis by inhibiting differentiation of Th1 and Th17 cells and inducing apoptosis of effect or T cells［J］. Scientific Reports, 2015, 5：9022.

［3］Lu Y, Qian R, Xiao J, et al. Kirenol, a compound from Herba Siegesbeckiae, induces apoptosis in human chronic myeloid leukemia K562 cells［J］. Pharmazie, 2014, 69（2）：148-153.

［4］Hwang JH, Kim JD. Inhibitory effects of Siegesbeckiae herba extract on angiogenesis and adipogenesis［J］. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2011, 1（16）：144-152.

［5］柴明艷. 車前草內(nèi)生真菌的分離及抑菌活性測定［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 44（1）：353-356.

［6］周邦靖. 常用中藥的抗菌作用及其測定方法［M］. 重慶：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社重慶分社, 1987：100-299.

［7］Marchesi JR, Sato T, Weightman AJ, et al. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64（2）：795-799.

［8］史應(yīng)武, 婁愷, 李春. 植物內(nèi)生菌在生物防治中的應(yīng)用［J］.微生物學(xué)雜志, 2009, 11（6）：61-64.

［9］黃午陽. 植物內(nèi)生真菌的抗菌活性研究［J］. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2005, 21（1）：24-26.

［10］Laubach CA. Studies on aerobic spore-bearing non-pathogenic bacteria partⅡ. Spore-bearing organisms in water［J］. Journal of Bacterial, 1916, 1（5）：506-512.

［11］Shida O, Takagi H, Kadowaki K, et al. Proposal for two new genera, Brevibacillus gen. nov. and Aneurinibacillus gen. Nov［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 1996, 46（4）：939-946.

［12］陳潺, 陳升富, 王建宇, 等. 側(cè)孢短芽孢桿菌的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 47（2）：149-156.

［13］ Djukic M, Poehlein A, Thürmer A, et al. Genome sequence of Brevibacillus laterosporus LMG 15441, a pathogen of invertebrates［J］. Journal of Bacterial, 2011, 193（19）：5535-5536.

［14］Sharma V, Singh PK, Midha S, et al. Genome sequence of Brevibacillus laterosporus strain GI-9［J］. Journal of Bacterial, 2012, 194（5）：1279.

［15］Hong HA, Duc LH, Cutting SM. The use of bacterial spore formers as probiotics［J］. FEMS Microbiology Rev, 2005, 29（4）：813-835.

［16］Barsby T, Kelly MT, Andersen RJ. Tupuseleiamides and basiliskamides, new acyldipeptides and antifungal polyketides produced in culture by a Bacillus laterosporus isolate obtained from a tropical marine habitat［J］. Journal of Natural Products, 2002, 65（10）：1447-1451.

［17］Desjardine K, Pereira A, Wright H, et al. Tauramamide, a lipopeptide antibiotic produced in culture by Brevibacillus laterosporus isolated from a marine habitat：Structure elucidation and synthesis［J］. Journal of Natural Products, 2007, 70（12）：1850-1853.

［18］Yang X, Huang E, Yuan CH. Isolation and structural elucidation of Brevibacillin, an antimicrobial lipopeptide from Brevibacillus laterosporus that combats drug-resistant Gram-positive bacteria［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2016, 82（9）：2763-2772.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Species Identification and Growth Characteristics of Endophytic Anti-infective Bacteria from Herba siegesbeckiae

CHEN Shao-hong ZHAO Peng-chao CHEN Ming-zhao LI Luo-yi LI Yue JIA Jing-jing
（College of Medical Technology and Engineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023）

Herba siegesbeckiae has many healing values，and our aim is to isolate and screen highly active antagonistic endophytes from its fruits. The biological characteristics of anti-infective bacterium C-5-1 were determined by antagonistic experiment，morphological observation，physiological and biochemical tests，sequence alignment of 16S rRNA gene，analysis of phylogenetic tree，measuring OD600，drug sensitive tests，and ultra-filtration centrifugation. The results showed that the C-5-1 was identified as Brevibacillus laterosporus and was sensitive to various pathogenic bacteria，especially Pseudomonas aeruginosa. The strain C-5-1 had limited tolerance to low pH and highly saline environments，i.e.，inhibited completely or even died in pH≤5 or more than 15% NaCl，but it grew well in pH≥7 and 0-5% NaCl，suggesting that C-5-1 had good alkali resistance，but not resistant to acid and salt. Screening experiment revealed that the antibiotic ampicillin was highly sensitive to C-5-1，but resistant to 5 pathogenic bacteria. Fermentation supernatant of C-5-1 contained two antibacterial substances and relative molecular mass of both was less than 2 000. Conclusively，H. siegesbeckiae having excellent microbial resources will be a key resource for the development of anti-bacteria drugs.

Herba siegesbeckiae；Brevibacillus laterosporus；ampicillin；alkali-resistant；ultra-filtration centrifugation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.020

2016-06-14

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（15A180038），河南科技大學(xué)博士科研啟動基金項(xiàng)目（4022/13480021），國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項(xiàng)目（201510464048），河南科技大學(xué)大學(xué)生科研訓(xùn)練計劃項(xiàng)目（2015125）

陳少紅，女，本科，研究方向：微生物學(xué)；E- mail：2351538594@qq.com

趙朋超，男，博士，講師，研究方向：微生物資源及分子微生物；E -mail：pengchao_zpc@163.com