細(xì)胞自噬在D-氨基半乳糖/脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中的保護作用及機制

時紅波，時紅林，張向穎，陳德喜，段鐘平，任 鋒

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京市肝病研究所，北京 100069)

論著/其他

細(xì)胞自噬在D-氨基半乳糖/脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中的保護作用及機制

時紅波，時紅林，張向穎，陳德喜，段鐘平，任 鋒

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京市肝病研究所，北京 100069)

目的 利用D-氨基半乳糖(D-GalN)/脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型研究細(xì)胞自噬在急性肝損傷中的作用及機制。方法 以C57BL/6小鼠為研究對象，腹腔注射D-GalN/LPS建立小鼠急性肝損傷模型。動物實驗分組：對照組、D-GalN/LPS組、雷帕霉素+D-GalN/LPS組、三甲基腺嘌呤(3-MA)+D-GalN/LPS組、Atg7 siRNA+D-GalN/LPS組。觀察不同分組中小鼠的生存情況，觀察肝組織病理變化評價肝損傷情況，全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST水平，實時熒光定量PCR檢測肝組織中TNFα和IL-6基因表達，熒光顯微鏡觀察肝組織中肝細(xì)胞凋亡情況。多樣本組間比較采用One-way ANOVA分析，進一步兩兩比較，方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Games-Howell法。結(jié)果 與D-GalN/LPS組相比，應(yīng)用自噬激活劑雷帕霉素干預(yù)后，小鼠生存率明顯升高(80% vs 40%)，肝臟出血、炎癥和壞死明顯減輕，肝細(xì)胞凋亡明顯減少，血清ALT、AST水平明顯降低[ALT：(427.4±195.5) U/L vs (977.7±247.3) U/L，P=0.002；AST：(378.2±169.7) U/L vs (1100.0±438.0) U/L，P=0.004]，肝組織中炎癥因子TNFα和IL-6 mRNA表達水平明顯降低[TNFα mRNA：0.288±0.010 vs 1.136±0.267，P=0.003；IL-6 mRNA：0.272±0.061 vs 0.869±0.317，P=0.010]；應(yīng)用自噬抑制劑3-MA和Atg7 siRNA干預(yù)后，小鼠生存率明顯降低(0、10% vs 40%)，肝臟出血、炎癥和壞死明顯加重，肝細(xì)胞凋亡明顯增多，血清ALT、AST水平明顯升高[ALT：(1836.0±560.5)、(1654.0±627.6) U/L vs (977.7±247.3) U/L，P值分別為0.006、0.034；AST：(1948.0±645.5)、(1804.0±492.6) U/L vs (1100.0±438.0) U/L，P值分別為0.029、0.033]，肝組織中TNFα表達水平明顯升高[2.026±0.342、1.994±0.286 vs 1.136±0.267，P值分別為0.006、0.005]。結(jié)論 在D-GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷中，細(xì)胞自噬發(fā)揮著重要的保護性作用，其調(diào)控機制可能與自噬抑制炎癥因子和肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。

自噬； 肝功能衰竭,急性； 己糖胺酶類； 脂多糖類； 小鼠,近交C57BL

急性肝損傷是指各種原因引起的肝功能異常，其誘發(fā)因素很多，主要有病毒感染、用藥不當(dāng)、乙醇攝入過多、接觸或食入有毒食物、外傷以及放射性損傷等[1-2]。肝損傷是急性肝衰竭的基礎(chǔ)，嚴(yán)重或持續(xù)的肝損傷將最終導(dǎo)致肝衰竭，因此早期干預(yù)尤為重要[3]。筆者[4]前期研究發(fā)現(xiàn)，在D-氨基半乳糖(D-GalN)/脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肝損傷早中期，自噬表達逐漸增強，而進展至肝衰竭后自噬表達下降。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)在D-GalN/LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷中，自噬表達亦增高，但在該模型中自噬作用及功能尚不明確。因此，本研究通過探討自噬在D-GalN/LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷中的作用及機制，以期為急性肝損傷的致病機制及治療方法提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究室提供8～12周健康雄性C57BL/6小鼠，置于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院動物中心飼養(yǎng)，自由進食及飲水，在無任何病原體的條件下飼養(yǎng)1周后進行實驗。D-GalN、LPS、雷帕霉素、三甲基腺嘌呤(3-MA)購自Sigma公司。自噬相關(guān)蛋白輕鏈3(light chain 3，LC3)抗體(一抗)以及辣根過氧化物酶耦聯(lián)的羊抗兔抗體(二抗)均購自美國Cell Signaling公司；PVDF膜、蛋白定量及ECL發(fā)光試劑盒均購自美國Bio-Rad公司。SuperScript Ⅲ Platinum Two-step 實時熒光定量PCR試劑盒購自Invitrogen公司。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Roche公司。Atg7 siRNA購自蘇州JIMA公司，序列為5′-GCAUCAUCUUCGAAGUGAATT-3′。

1.2 實驗分組 (1)對照組(n=10)：給予與D-GalN/LPS模型組相同劑量的PBS腹腔注射；(2)D-GalN/LPS組(n=10)：通過腹腔注射給予D-GalN 700 mg/kg和LPS 10 μg/kg，在D-GalN/LPS處理前2 h通過尾靜脈注射給予二甲基亞砜；(3)雷帕霉素+D-GalN/LPS組(n=10)：在D-GalN/LPS處理前2 h，通過尾靜脈注射給予雷帕霉素2 mg/kg；(4)3-MA+D-GalN/LPS組(n=10)：在D-GalN/LPS處理前2 h，通過尾靜脈注射給予3-MA 10 mg/kg；(5)Atg7 siRNA+D-GalN/LPS組(n=10)：在D-GalN/LPS處理前48 h，通過尾靜脈高壓注射給予Atg7 siRNA 3 mg/kg。所有實驗組在D-GalN/LPS處理后6 h 處死小鼠(對照組在PBS處理后6 h 處死小鼠)，收集血清和肝組織標(biāo)本。

1.3 檢測指標(biāo) (1)生存率觀察：按照上述方法分組處理后，每組另取10只小鼠，觀察小鼠存活時間。(2)蛋白免疫印跡檢測：取100 mg肝組織，加入100 μl預(yù)冷的組織裂解液，反復(fù)勻漿3次；離心取上清液進行蛋白濃度測定；經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上；加入一抗(1∶1000稀釋)孵育，TBST漂洗3次；二抗(1∶2000稀釋)孵育，TBST漂洗3次后，取等量的ECL發(fā)光試劑A液和B液混勻后孵育PVDF膜，壓片曝光。(3)病理學(xué)檢測：常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察肝組織損傷情況。(4)血清學(xué)檢測：全自動生化分析儀測定小鼠血清中ALT、AST水平。(5)實時熒光定量PCR檢測TNFα和IL-6：TRIzol試劑提取肝臟組織總RNA，具體操作按照說明書進行；測定總RNA濃度并配制等量總RNA的溶液；使用SuperScript Ⅲ Platinum Two-step 實時熒光定量PCR試劑盒合成cDNA第一鏈，隨后進行實時熒光定量PCR檢測，具體操作按試劑盒說明書進行；以次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶做為內(nèi)參。(6)凋亡細(xì)胞原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記試驗(TUNEL)測定肝細(xì)胞凋亡：PBS洗滌2次，加入含0.1% Triton X-100的PBS冰浴孵育2 min。配制TUNEL檢測液，用PBS洗滌2次。在樣品上加50 μl TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 自噬激活和抑制對LC3表達的影響 自噬激活劑雷帕霉素明顯促進LC3Ⅱ的表達，提示自噬被激活；自噬抑制劑3-MA和Atg7 siRNA明顯抑制LC3Ⅱ的表達，提示自噬被抑制(圖1)。

圖1 自噬激活劑和抑制劑對LC3表達的影響

2.2 自噬對肝損傷小鼠生存率的影響 D-GalN/LPS組小鼠7 h開始死亡，在24 h時生存率只有40%(4/10)；雷帕霉素激活自噬后，小鼠的24 h時生存率達到80%(8/10)；應(yīng)用自噬抑制劑3-MA或Atg7 siRNA阻斷自噬表達后，小鼠的24 h時生存率明顯降低，分別為0和10%(1/10)(圖2)。

圖2 實驗組肝損傷小鼠的生存情況

2.3 自噬對肝損傷小鼠肝臟病理的影響 與對照組相比，D-GalN/LPS組小鼠肝臟明顯充血，HE染色顯示肝組織中有出血、炎性細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死。與D-GalN/LPS組相比，應(yīng)用雷帕霉素干預(yù)后，肝臟充血減輕，HE染色顯示肝組織出血減少，炎性細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死也明顯減少；應(yīng)用3-MA或Atg7 siRNA干預(yù)后，HE染色顯示肝組織出血明顯增多，炎性細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死也明顯增多(圖3)。

2.4 自噬對肝損傷小鼠肝功能的影響 5組間肝功能指標(biāo)ALT、AST比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為17.7、19.3，P值均<0.001)。與對照組相比，D-GalN/LPS組小鼠ALT、AST水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均為0.001)。與D-GalN/LPS組相比，雷帕霉素干預(yù)組小鼠ALT、AST水平明顯降低(P值分別為0.002、0.004)；3-MA和Atg7 siRNA干預(yù)組小鼠ALT、AST水平明顯升高(3-MA：P值分別為0.006、0.029；Atg7 siRNA：P值分別為0.034、0.033) (表1)。

圖3 各組小鼠肝組織形態(tài)和病理學(xué)結(jié)果(HE染色，×200)

組別ALT(U/L)AST(U/L)對照組28.7±5.033.7±6.7D-GalN/LPS組977.7±247.31)1100.0±438.01)雷帕霉素+D-GalN/LPS組427.4±195.53)378.2±169.73)3-MA+D-GalN/LPS組1836.0±560.53)1948.0±645.52)Atg7siRNA+D-GalN/LPS組1654.0±627.62)1804.0±492.62)

注：與對照組比較，1)P<0.01；與D-GalN/LPS組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.5 自噬對肝損傷小鼠TNFα、IL-6表達的影響 5組間炎癥因子TNFα和IL-6 mRNA比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為61.890、19.630，P值均<0.001)。與對照組相比，D-GalN/LPS組小鼠TNFα和IL-6 mRNA表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均為0.001)。與D-GalN/LPS組相比，雷帕霉素干預(yù)組小鼠TNFα和IL-6 mRNA表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.003、0.010)；3-MA和Atg7 siRNA干預(yù)組小鼠TNFα mRNA表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.006、0.005)(表2)。

表2 不同組間小鼠肝組織中TNFα、IL-6 mRNA表達的比較

注：與對照組比較，1)P<0.01；與D-GalN/LPS組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.6 自噬對肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的作用 與對照組相比，D-GalN/LPS組小鼠肝組織中肝細(xì)胞凋亡明顯增加。與D-GalN/LPS組相比，雷帕霉素干預(yù)組小鼠肝細(xì)胞凋亡明顯減少；3-MA和Atg7 siRNA干預(yù)組小鼠肝細(xì)胞凋亡明顯增加(圖4)。

3 討論

20世紀(jì)50年代比利時科學(xué)家Christian de Duve通過電鏡觀察到自噬體結(jié)構(gòu)，并在1963年溶酶體國際會議上首次提出“自噬”的概念[6]。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性的細(xì)胞自我降解過程[7-9]。受損或多余的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器被雙層膜的囊泡包裹形成自噬體，隨后與溶酶體融合形成自噬溶酶體降解被包裹的物質(zhì)，而降解產(chǎn)物被釋放到細(xì)胞質(zhì)中重新用于物質(zhì)合成和能量代謝，使細(xì)胞在外界應(yīng)激因素的作用下能夠存活下來，屬于細(xì)胞在不良應(yīng)激情況下的自我保護機制[10-12]。

圖4 自噬對急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的作用(×200)

研究[13-15]表明，細(xì)胞自噬在刀豆素A和對乙酰氨基酚兩種小鼠肝損傷模型中都表現(xiàn)為增高，但是自噬在上述模型中的作用卻不同：在刀豆素A誘導(dǎo)的動物模型中，刀豆素A可能誘導(dǎo)肝細(xì)胞和肝臟內(nèi)皮發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡；在對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷中，自噬激活顯著改善了藥物導(dǎo)致的急性肝損傷[16-18]。由此可見，在不同方式誘導(dǎo)的肝損傷動物模型中，自噬的作用是不同的，其具體的調(diào)控機制更是值得進一步深入研究[19]。

LC3是自噬標(biāo)志物，自噬形成時，胞漿型LC3(即LC3Ⅰ)會降解一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3(即LC3Ⅱ)，LC3Ⅱ/Ⅰ比值的大小可反應(yīng)自噬水平的高低[20]。雷帕霉素、3-MA、Atg7 siRNA經(jīng)常被用于自噬的激活和抑制[21]，本研究首先證明了自噬激活劑雷帕霉素可以促進LC3Ⅱ的表達，提示自噬被激活；自噬抑制劑3-MA和Atg7 siRNA可以抑制LC3Ⅱ的表達，提示自噬被抑制，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)在D-GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷中，激活自噬可以明顯提高小鼠的存活率，減輕小鼠肝臟的出血、炎癥和壞死，改善小鼠的肝功能，提示激活自噬對D-GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護性作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在D-GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷中，激活自噬可以抑制肝組織中炎癥因子TNFα和IL-6 mRNA表達水平，并且可以明顯減少肝細(xì)胞凋亡，提示自噬可能通過抑制炎癥因子TNFα、IL-6的表達和肝細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護性作用。Jiao等[22]發(fā)現(xiàn)，在D-GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型中，過氧化物酶體增殖物激活受體α對肝損傷的保護性作用是通過促進自噬實現(xiàn)的，與本研究結(jié)果一致。

自噬作為一種重要的分子信號通路日益引起人們的關(guān)注，本研究結(jié)果表明自噬對D-GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護性作用，深入研究自噬在肝損傷中的作用機制必將為肝損傷的致病機制和治療方法提供新的線索和依據(jù)。

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引證本文：SHI HB,SHI HL,ZHANG XY,et al.Protective effect of autophagy in mice with acute liver injury induced by D-galactosamine/lipopolysaccharide and related mechanisms[J].J Clin Hepatol,2017,33(2):329-333.(in Chinese)

時紅波,時紅林,張向穎,等.細(xì)胞自噬在D-氨基半乳糖/脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中的保護作用及機制[J].臨床肝膽病雜志,2017,33(2):329-333.

(本文編輯：王 瑩)

Protective effect of autophagy in mice with acute liver injury induced by D-galactosamine/lipopolysaccharide and related mechanisms

SHIHongbo,SHIHonglin,ZHANGXiangying,etal.

(BeijingYouAnHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

Objective To investigate the role and mechanism of autophagy in acute liver injury induced by D-galactosamine/lipopolysaccharide (D-GalN/LPS) in mice.Methods C57BL/6 mice were used to establish a mouse model of acute liver injury using intraperitoneally injected D-GalN/LPS.In this animal experiment,the mice were divided into control group,D-GalN/LPS group,rapamycin+D-GalN/LPS group,3-MA+D-GalN/LPS group,and Atg7 siRNA+D-GalN/LPS group.The survival of the mice was observed,and liver pathological changes were observed to analyze liver injury.An automatic biochemical analyzer was used to measure the serum levels of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST),quantitative real-time PCR was performed to measure the mRNA expression of tumor necrosis factorα (TNFα) and interleukin-6 (IL-6),and a fluorescence microscope was used to observe the apoptosis of hepatocytes.A One-way ANOVA was used for comparison between multiple groups; the least significant differencet-test was used for homogeneity of variance and the Games-Howell method was used for heterogeneity of variance.Results Compared with the D-GalN/LPS group,the rapamycin+D-GalN/LPS group had a significant increase in survival rate (80% vs 40%),significantly reduced liver hemorrhage,inflammation,and necrosis and apoptosis of hepatocytes,and significant reductions in serum levels of ALT (427.4±195.5 U/L vs 977.7±247.3 U/L,P=0.002) and AST (378.2±169.7 U/L vs 1100.0±438.0 U/L,P=0.004),as well as significant reductions in the mRNA expression of TNFα (0.288±0.010 vs 1.136±0.267,P=0.003) and IL-6 (0.272±0.061 vs 0.869±0.317,P=0.010).Compared with the D-GalN/LPS group,the 3-MA+D-GalN/LPS group and Atg7 siRNA+D-GalN/LPS group had significant reductions in survival rate (0%/10% vs 40%),significantly aggravated liver hemorrhage,inflammation,and necrosis and apoptosis of hepatocytes,and significant increases in serum levels of ALT (1836.0±560.5 U/L and 1654.0±627.6 U/L vs 977.7±247.3 U/L,P=0.006 and 0.034) and AST (1948.0±645.5 U/L and 1804.0±492.6 U/L vs 1100.0±438.0 U/L,P=0.029 and 0.033),as well as significant increases in the expression of TNFα in liver tissue (2.026±0.342 and 1.994±0.286 vs 1.136±0.267,P=0.006 and 0.005).Conclusion In the mouse model of acute liver injury induced by D-GalN/LPS,autophagy has an important protective effect,and its regulating mechanism may be associated with the inhibitory effect on inflammatory factors and apoptosis of hepatocytes.

autophagy; liver failure,acute; hexosaminidases; lipopolysaccharides; mice,inbred C57BL

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.02.027

2016-10-17；

2016-11-12。

國家自然科學(xué)基金(81300349，81270532)；北京市自然科學(xué)基金(7162085，7144216)；北京市科技新星計劃(Z131107000413016)；首都臨床特色研究(Z161100000516113)；北京市醫(yī)院管理局臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展專項經(jīng)費資助(XM201308)；國家臨床重點?？平ㄔO(shè)項目(WJWYA-2014-002)；科研基地建設(shè)-重大傳染病防治協(xié)同創(chuàng)新中心(115215)；北京衛(wèi)生系統(tǒng)高技術(shù)人才培養(yǎng)項目資助(2014-3-090，2013-3-075)；北京市醫(yī)院管理局登峰計劃專項經(jīng)費資助(DFL20151601)

時紅波(1978-)，女，副研究員，副教授，博士，主要從事肝損傷再生相關(guān)機制研究。

任鋒，電子信箱：renfeng7512@hotmail.com。

R575

A

1001-5256(2017)02-0329-05