微生物系統(tǒng)定向進(jìn)化與合成生物學(xué)應(yīng)用研究進(jìn)展

郭園趙仲麟（. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，包頭 0409；. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，鄭州 45000）

微生物系統(tǒng)定向進(jìn)化與合成生物學(xué)應(yīng)用研究進(jìn)展

郭園1趙仲麟2
（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，包頭 014109；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，鄭州 450002）

當(dāng)前，生物技術(shù)應(yīng)用常常需要對多基因性狀進(jìn)行復(fù)雜的工程化改造，然而復(fù)雜表型的遺傳基礎(chǔ)背景的缺乏限制了人們進(jìn)行理性設(shè)計的能力。人們利用合成生物學(xué)工具可以對復(fù)雜表型在系統(tǒng)水平進(jìn)行工程化改造，通過定向進(jìn)化策略推動整個生物系統(tǒng)的進(jìn)化，在不知道目標(biāo)性狀的遺傳基礎(chǔ)的情況下仍可以獲得人們所期望的表型。合成生物學(xué)的發(fā)展加速了生物的定向進(jìn)化過程，利用其可以對生物系統(tǒng)中復(fù)雜性狀進(jìn)行工程化改造。對當(dāng)前合成生物學(xué)在微生物系統(tǒng)中復(fù)雜性狀定向進(jìn)化的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

合成生物學(xué)；微生物系統(tǒng)；定向進(jìn)化；應(yīng)用

微生物在當(dāng)今人們的生活中扮演著重要的角色，在食品、制藥、醫(yī)療、石化、農(nóng)業(yè)及生物修復(fù)等領(lǐng)域中應(yīng)用十分廣泛。越來越多的復(fù)雜應(yīng)用需要更精巧的設(shè)計，往往需要考慮多種表型的優(yōu)化，耐受性、途徑流量、生長率等受多個基因及其與環(huán)境因子的相互作用的控制。缺少對復(fù)雜性狀遺傳基礎(chǔ)的認(rèn)知，限制了人們進(jìn)行合理設(shè)計微生物的能力。操縱這些復(fù)雜性狀的備選方法是在系統(tǒng)水平進(jìn)行工程化改造［1］，在不知道其機(jī)制的情況下，就可以使生物系統(tǒng)實現(xiàn)人們所期望的表型。

合成生物學(xué)是生命科學(xué)的工程化過程，合成自然界不存在的生物體系，并對現(xiàn)有的生物體系進(jìn)行重新設(shè)計，目標(biāo)是生產(chǎn)新的化學(xué)品、改善人類健康及解決環(huán)境問題等［2］。合成生物學(xué)工具包括生物部件、器件、模塊、系統(tǒng)四部分，通過對這些元件逐級設(shè)計構(gòu)建組合具有特定功能的生物系統(tǒng)。利用這些工具，人們可以構(gòu)建非天然的基因調(diào)控模塊來設(shè)計構(gòu)建細(xì)胞生命活動的分子網(wǎng)絡(luò)，類似于工程學(xué)中的線路設(shè)計，因此也稱為基因線路（genetic circuit）。近些年來，科學(xué)家已構(gòu)建了很多基于微生物轉(zhuǎn)錄和代謝復(fù)雜系統(tǒng)的合成生物學(xué)器件（圖1）。

圖1 基于基因表達(dá)的合成生物學(xué)器件

生物技術(shù)當(dāng)前的發(fā)展趨勢是在系統(tǒng)水平對微生物進(jìn)行工程化改造，研究主要集中在定向進(jìn)化、代謝工程和合成生物學(xué)領(lǐng)域。已成功應(yīng)用于基因、代謝途徑和基因組水平，通過設(shè)置不同階段探索多種復(fù)雜的功能。本文討論了一些通過微生物系統(tǒng)工程化實現(xiàn)復(fù)雜性狀的策略，對當(dāng)前合成生物學(xué)用于微生物系統(tǒng)工程化研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 微生物系統(tǒng)復(fù)雜性狀的定向進(jìn)化

復(fù)雜性狀的工程化可以通過定向進(jìn)化的策略來實現(xiàn)［3］，通過多種控制設(shè)置模擬自然進(jìn)化過程，達(dá)到人們所需的表型。自適應(yīng)實驗室進(jìn)化技術(shù)（Adaptive laboratory evolution，ALE）就是其中一個例子，在特定選擇條件下對微生物進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過數(shù)百代的培養(yǎng)后就可實現(xiàn)表型改進(jìn)的進(jìn)化［4］。例如，溫度耐受是一個典型的復(fù)雜性狀，人們對其遺傳基礎(chǔ)知之甚少，Tenaillon等［5］利用ALE方法進(jìn)行了大腸桿菌的溫度耐受進(jìn)化研究。另外，許多利用ALE方法對大腸桿菌和酵母菌進(jìn)行工程化改造的研究，成功地提高了生物燃料或化學(xué)品的產(chǎn)量和產(chǎn)率［6-8］。

定向進(jìn)化策略通常依賴于人工選擇壓力和多代循環(huán)擴(kuò)增來改進(jìn)突變體，最終得到所需的復(fù)雜表型。其成功與否主要取決于兩點因素，即產(chǎn)生功能多樣化突變體的能力以及鑒定出真正表型改進(jìn)突變體的篩選方法。近些年來，合成生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展迅猛對定向進(jìn)化策略做出了重要貢獻(xiàn)，其領(lǐng)域的目標(biāo)是設(shè)計、構(gòu)建和改進(jìn)自然界不存在的生物組分及系統(tǒng)［9］。合成生物學(xué)已發(fā)展出了很多可以加速定向進(jìn)化的工具，可提高產(chǎn)生多樣性子代的效率，同時也可以擴(kuò)展篩選或選擇范圍。

2 遺傳多樣性的實現(xiàn)策略

多樣性是進(jìn)化的基礎(chǔ)，多樣性程度越復(fù)雜，得到復(fù)雜的表型的可能性就越大。目前有很多種增加遺傳多樣性的方法被用于定向進(jìn)化中。例如，易錯PCR法［10，11］和定點突變法等。易錯PCR法利用低保真性的聚合酶，而定點突變法則需要預(yù)先知道目標(biāo)的結(jié)構(gòu)信息，在特定位點進(jìn)行密碼子突變以改善活性［12］。Bastian［13］利用定點突變的方法開關(guān)異丁醇生產(chǎn)中兩個關(guān)鍵酶的輔因子，通過消除菌株的輔因子失調(diào)，最大限度地提高異丁醇生產(chǎn)理論產(chǎn)量。Firnberg等［14］發(fā)展出一個定點突變的改進(jìn)方法，稱為PFunkel。該方法允許在多個位點同時生成多個自定義文庫。他們利用這個策略構(gòu)建了一個完整的β-內(nèi)酰胺酶基因密碼子取代文庫，用于識別一個與臨床抑制劑抗性相關(guān)的突變。

現(xiàn)代合成生物學(xué)工具可以有效的增加遺傳多樣性，向人們所期望的目標(biāo)實現(xiàn)加速進(jìn)化。使用多重自動基因組改造技術(shù)（Multiplex automated genome engineering，MAGE）可以在大腸桿菌靶位點增加多樣性（圖2）［15］。在單鏈DNA寡核苷酸上進(jìn)行染色體編輯，在系統(tǒng)規(guī)模的多個層面上生成組合多樣性。MAGE技術(shù)已成功用于大腸桿菌基因組的代謝途徑優(yōu)化［15-19］，演化的MAGE方法也已被用于釀酒酵母的研究中［20］。

多樣性也可以通過基因組改組的方法實現(xiàn)［21］，基因組改組與經(jīng)典突變篩選相比，可極大的加快進(jìn)化速度，已被廣泛用于各種生物體的進(jìn)化［22］。合成生物學(xué)工具中最新增加的技術(shù)是成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列系統(tǒng)（CRISPR），該技術(shù)可以對多種生物進(jìn)行基因組編輯［23，24］，能夠通過改變表達(dá)水平來增加多樣性［25，26］，是當(dāng)今研究的熱點。另外，多樣性也可以通過精確基因組編輯，即同源重組方法實現(xiàn)［27］，如同飽和突變研究一樣［28，29］。CRISPR-Cas已被用來進(jìn)行從點突變對整個代謝途徑進(jìn)行理性設(shè)計編輯［30］?，F(xiàn)代合成生物學(xué)工具還可以利用非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸使蛋白質(zhì)進(jìn)化出新的催化功能［31］，或是建立完全正交核糖體-mRNA系統(tǒng)［32］，用于核糖體功能的探索或工程化具有新的功能的核糖體。CRISPRCas技術(shù)還可以從目標(biāo)樣本或宏基因組樣本中高效導(dǎo)入異源功能［33-35］。

圖2 多重自動基因組改造技術(shù)［15］

3 復(fù)雜性狀的篩選與選擇

合成生物學(xué)工具可以使人們得到更多突變體，有效的增加種群多樣性。定向進(jìn)化應(yīng)用的關(guān)鍵是如何在一個群體中篩選或選擇到改進(jìn)的突變體。如果目標(biāo)性狀個體數(shù)量增加則可以通過生長選擇方法得到目標(biāo)，比色法或流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選法可以用于篩選［36］，但篩選方法只能用于有限的一些目標(biāo)性狀。合成生物學(xué)通過開發(fā)新的工具，擴(kuò)大了特征譜，以便進(jìn)行選擇或篩選，從而解決上述問題。

合成生物學(xué)通過開發(fā)生物傳感器，檢測熒光蛋白觸發(fā)表達(dá)或通過抗生素抗性基因進(jìn)行篩選或選擇過程。大多數(shù)生物傳感器是基于轉(zhuǎn)錄因子和同源啟動子對原理［17，37］，也有一些是基于RNA的檢測方法［38］。新型生物傳感器包含RNA傳感器和蛋白質(zhì)的傳感器［39，40］，這些生物傳感器可用于優(yōu)化整個代謝通路和基因簇。例如，Raman等［17］使用MAGE技術(shù)生產(chǎn)全基因組靶向多樣性，采用基于生物傳感器的選擇策略，通過該方法分別將目標(biāo)產(chǎn)物柚皮素和葡糖酸產(chǎn)量增加了36倍和22倍。

生物傳感器還可以與基因線路整合，以擴(kuò)大輸入的復(fù)雜性，同時連接所需輸出［41］。更加復(fù)雜的基因線路可以通過兩種方式提高篩選和選擇能力：第一，一個單一的輸入可以連接到多個輸出（圖3-A），在這種情況下目標(biāo)性狀可能觸發(fā)級聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，重新連接到有目標(biāo)表型的細(xì)胞，最終進(jìn)行篩選或選擇。當(dāng)達(dá)到足夠的細(xì)胞濃度，重組細(xì)胞代謝在一個特定的輸入下可以生產(chǎn)異丙醇［42］；第二，多個輸入可以通過邏輯門連接到一個單一輸出上（圖3-B）［7］，導(dǎo)致增加的特異性表型的篩選。Hoynes-O'connor等［43］用RNA熱敏元件構(gòu)建3輸入的基因線路，構(gòu)建出可觸發(fā)GFP的表達(dá)的熱敏傳感器。

圖3 基因線路

另一種有效的選擇策略是適當(dāng)增加目標(biāo)性狀。噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化技術(shù)（Phage-assisted continuous evolution，PACE）使用修飾的M13噬菌體循環(huán)，使目標(biāo)性狀與感染所需的噬菌體蛋白表達(dá)相關(guān)［44］。通過讓生物分子的實驗室進(jìn)化和噬菌體的生命周期結(jié)合在一起，讓蛋白質(zhì)在每24 h內(nèi)進(jìn)化60輪。PACE的效率是傳統(tǒng)實驗室進(jìn)化方法的100倍左右，整個實驗過程無需人為干預(yù)，大大節(jié)省了人力勞動成本。這個系統(tǒng)使用大腸桿菌的宿主細(xì)胞作為制造噬菌體的細(xì)胞工廠，利用噬菌體基因編碼使生物分子繁殖，生成所需要的蛋白質(zhì)，進(jìn)行持續(xù)多輪的進(jìn)化。最近研究人員還對PACE技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，包括調(diào)整選擇強度、對不需要的突變體進(jìn)行負(fù)向選擇等［45］。

4 合成生物學(xué)在系統(tǒng)水平的應(yīng)用

有了高效的多樣性產(chǎn)生方法和篩選或選擇策略，人們即便不完全了解某些微生物的遺傳背景，仍然可以在系統(tǒng)水平上完成復(fù)雜的性狀定向進(jìn)化研究。新方法的產(chǎn)生使得生物技術(shù)將在不久的將來能夠解決更多的問題。定向進(jìn)化和合成生物學(xué)手段已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于微生物的系統(tǒng)水平上。通過引入非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，蛋白質(zhì)能夠進(jìn)化出自然界沒有的新功能。例如，Xiao等［46］利用非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸得到一個催化效率改進(jìn)的內(nèi)酰胺酶，而如果利用標(biāo)準(zhǔn)氨基酸突變方法則無法實現(xiàn)。利用生物系統(tǒng)還可以探索新的化學(xué)組成和性質(zhì)，而代謝途徑中的新功能則可以實現(xiàn)全新的應(yīng)用，通過如MAGE或CRISPR-Cas等手段結(jié)合高效的篩選或選擇方法進(jìn)行優(yōu)化［27］。另外，新近發(fā)展出的諸如ePathBrick和CasEMBLR等方法則可以進(jìn)行快速通路組裝并測試所期望的功能［47，48］。因此，復(fù)雜的新功能可以使用合成生物學(xué)和定向進(jìn)化工具在代謝途徑水平進(jìn)行工程化改造。

目前，如何處理細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜調(diào)節(jié)是代謝途徑水平工程化的一個難題，而很多情況往往是未知的。如今模塊化的工程概念已被應(yīng)用到合成生物學(xué)中，可以部分解決這個問題［49-51］。例如，Xu等［52］將脂肪酸生物合成分列在3個不同的模塊中，可以有效優(yōu)化大腸桿菌生產(chǎn)水平。通過優(yōu)化每個模塊的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，通過平衡中間體的生產(chǎn)和消耗來消除生產(chǎn)瓶頸，當(dāng)前這些模塊化工程策略已經(jīng)被大規(guī)模應(yīng)用。此外，為克服天然調(diào)控機(jī)制，Temme等［53］在產(chǎn)酸克雷伯菌中重構(gòu)了一個23.5 kb的固氮基因簇，重構(gòu)的基因簇由特征顯著的啟動子和核糖體結(jié)合位點等合成元件所控制，重構(gòu)后人們可以將一些功能基因簇轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中。如萊因衣藻光的系統(tǒng)II 重構(gòu)，證實了種內(nèi)交換的可行性［54］。重構(gòu)策略的另一個十分有前景的應(yīng)用是小分子組合生物合成［55］，這些分子庫可能成為未來新一代療法。

基因組規(guī)模的工程化是合成和系統(tǒng)生物學(xué)的前瞻性應(yīng)用。Ma和Isaacs等［56］開發(fā)出分級結(jié)合組裝基因組工程策略——CAGE，可以將不同大腸桿菌菌株的基因組中的區(qū)域整合組裝形成一個嵌合體基因組（圖4），允許大規(guī)模的特異基因組區(qū)域轉(zhuǎn)移，無需體外操作就能實現(xiàn)體內(nèi)染色體的精確操控 。利用靶點編輯工具改變遺傳密碼，將這些密碼子修飾組合并入到基因組中，通過這種方法能夠測量重組頻率，確認(rèn)活性，并確定相關(guān)的表型［18］。

圖4 分級結(jié)合組裝基因組工程策略［56］

其中一個典型的例子是通過改變遺傳密碼來設(shè)計一種依賴于非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的代謝，利用合成蛋白設(shè)計來進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物控制［57］。另外，有效的DNA的組裝方法加上逐漸降低DNA合成成本，使得科學(xué)家可以從頭合成整個基因組［58］。探索合成重構(gòu)基因組的復(fù)雜性降低將有利于人們進(jìn)一步研究和操縱這些系統(tǒng)。2014年，Annaluru等［59］全合成了一個功能完整的酵母染色體，未來人們可以利用從頭合成技術(shù)和計算機(jī)輔助設(shè)計工具重構(gòu)合成染色體和基因組［60］。而這些進(jìn)展為未來的理性設(shè)計和基因組訂制奠定了基礎(chǔ)，給生物技術(shù)和生物科學(xué)研究帶來革命性的變革。然而，基因組設(shè)計及引導(dǎo)基因組進(jìn)入細(xì)胞的規(guī)則尚未闡明，是目前科研人員遇到的最大障礙。

合成生物學(xué)技術(shù)還可以用于多細(xì)胞水平，工程化的微生物菌群可以通過分工擴(kuò)大代謝能力，減少許多純培養(yǎng)的限制因素，如代謝負(fù)擔(dān)或有毒中間產(chǎn)物的積累等。這些可以通過代謝互養(yǎng)或基于群體感應(yīng)信號分子的基因線路來實現(xiàn)有效的細(xì)胞間的通訊［61，62］。一個標(biāo)志性的研究工作是利用工程真菌細(xì)菌菌群從纖維素生物質(zhì)中直接生產(chǎn)異丁醇［63］，而最近大腸桿菌共培養(yǎng)的方法也被用于從葡萄糖/木糖混合物中生產(chǎn)復(fù)雜的對羥基苯甲酸和黏康酸［64］。一些與人類健康相關(guān)的生物技術(shù)應(yīng)用也證實了預(yù)測和工程化的復(fù)雜生物之間的相互作用是可行的。腸道微生物工程菌群就是一個非常有前途的領(lǐng)域，未來能夠治療大范圍的人類疾病。在這之前，仍然需要科學(xué)家發(fā)展多種非模式生物相關(guān)的合成生物學(xué)工具，并且對腸道微生物的相互作用機(jī)制有更深刻的了解。

5 展望

設(shè)計復(fù)雜的多基因表型的能力是很多生物技術(shù)研究努力的方向，同時也正制約著這個領(lǐng)域的發(fā)展。將現(xiàn)代合成生物學(xué)工具與定向進(jìn)化和代謝工程相結(jié)合，通過操縱越來越復(fù)雜的性狀，可以讓生物系統(tǒng)作為一個整體進(jìn)行工程化改造。通過這些技術(shù)，人們可以對復(fù)雜的系統(tǒng)和性狀進(jìn)行工程化改造，這將會推動新生物技術(shù)在多個工業(yè)部門間的應(yīng)用。利用合成生物學(xué)工具可以快速和有效的產(chǎn)生理性多樣性，加速定向進(jìn)化周期。此外，更多新型生物傳感器和基因線路研發(fā)將大大提高改進(jìn)突變體的篩選和選擇能力，進(jìn)一步加快人們對其他生物進(jìn)行定向進(jìn)化能力，大幅增加生物技術(shù)設(shè)計的復(fù)雜性。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Advances on Applications of Synthetic Biology and Directed Evolution in Microbial Systems

GUO Yuan1ZHAO Zhong-lin2
（1. Vocational and Technical College，Inner Mongolia Agricultural University，Baotou 014109；2. College of Sciences，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002）

Nowadays，there are needs to engineer complex multi-genic traits in modern biotechnology applications；however，our capability to rationally engineer them is limited by the lack of knowledge on the genetic basis of complex phenotypes. Using synthetic biological measures，complex phenotypes can be engineered at the systems level，and via directed evolution strategies the whole biological system may be driven toward desired phenotypes without requiring the knowledge of the genetic basis of the targeted traits. The latest developments in the synthetic biology accelerate the directed evolution cycle，facilitating engineering of increasingly complex traits in biological systems. Herein，the recent advances on synthetic biology in directed evolution of complex traits in microbial systems are reviewed.

synthetic biology；microbial system；directed evolution；application

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.008

2016-10-18

郭園，女，碩士，講師，研究方向：微生物與免疫；E-mail：guoyuan_2003@163.com

趙仲麟，男，博士，副教授，研究方向：化學(xué)生物學(xué)、分子生物學(xué)；E-mail：rayzzl@163.com