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      3,4-二羥基扁桃酸在大腸桿菌中的生物合成

      2017-02-21 08:59:15李曉林周威莊以彬路福平殷華天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院天津300457中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所天津300308
      生物技術(shù)通報(bào) 2017年1期
      關(guān)鍵詞:扁桃酪氨酸羥基

      李曉林周威莊以彬路福平殷華(. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所,天津300308)

      3,4-二羥基扁桃酸在大腸桿菌中的生物合成

      李曉林1,2周威2莊以彬2路福平1殷華2
      (1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;2. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所,天津300308)

      3,4-二羥基扁桃酸是許多藥物和香料合成的重要中間體,具有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的活性。旨在實(shí)現(xiàn)3,4-二羥基扁桃酸在大腸桿菌中的從頭合成。通過(guò)在大腸桿菌MG1655/ΔA中過(guò)表達(dá)來(lái)源于天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)的對(duì)羥基扁桃酸合酶(HmaS)和大腸桿菌的羥化酶(HpaBC)基因,實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖為原料生物合成3,4-二羥基扁桃酸;并經(jīng)IPTG和蛋白誘導(dǎo)溫度初步優(yōu)化后,搖瓶發(fā)酵36 h 3,4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量達(dá)到240 mg/L。

      大腸桿菌;3,4-二羥基扁桃酸;生物合成;對(duì)羥基扁桃酸合酶(HmaS);羥化酶(HpaBC)

      3,4-二羥基扁桃酸,英文名3,4-Dihydroxymandelic acid(DHMA),是多種醫(yī)藥(如磺胺增效劑3,4,5-三甲氧基嘧啶,TMP)、香料(如香草基杏仁酸、香蘭素)合成的重要中間體[1-3],其本身也是一種有效的抗氧化劑和自由基清除劑,如DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其自由基清除活性是維生素C、維生素E、抗氧劑264(butylated hydroxytoluene)的4倍[4]。目前,3,4-二羥基扁桃酸主要通過(guò)化學(xué)方法來(lái)合成,如以鄰苯二酚與乙醛酸為原料,在堿性條件下縮合而實(shí)現(xiàn)合成[2,5]。然而,這種化學(xué)合成的方法收率低,產(chǎn)生大量的堿性廢液,造成環(huán)境污染。利用微生物合成的方法將有效避免化學(xué)合成中復(fù)雜條件的控制以及環(huán)境污染等問(wèn)題,因而受到越來(lái)越多研究人員的關(guān)注。大腸桿菌由于其遺傳背景清晰,遺傳操作技術(shù)簡(jiǎn)單,易于大規(guī)?;后w發(fā)酵生產(chǎn),作為天然化合物的異源合成宿主越來(lái)越受到重視。近年來(lái),許多來(lái)源于酪氨酸合成途徑的芳香族衍生物,如咖啡酸、沒(méi)食子酸、黑色素、丹參素、羥基酪醇等已實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的生物合成[6-8],3,4-二羥基扁桃酸在微生物中異源生物合成方法尚未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)羥基扁桃酸合酶(HmaS)基因存在于萬(wàn)古霉素類(lèi)抗生素生物合成基因簇中,是一種Fe2+依賴(lài)型的雙加氧酶,能將對(duì)羥基苯丙酮酸芐基脫羧和羥基化生成對(duì)羥基扁桃酸[9-12]。來(lái)源于大腸桿菌的羥化酶(HpaBC)被報(bào)道是一個(gè)雙組份的單氧化酶,具有較大的底物寬泛性,能催化單羥基酚和二羥基酚類(lèi)化合物苯環(huán)發(fā)生羥化反應(yīng),如催化對(duì)羥基苯乙酸、苯酚、酪氨酸(tyrosine)及香豆酸(coumanic acid)等底物[13,14]。本研究以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的酪氨酸高產(chǎn)的大腸桿菌為出發(fā)菌株,引入來(lái)源于天藍(lán)色鏈霉菌M145(Streptomyces coelicolor)的對(duì)羥基扁桃酸合酶(HmaS)和大腸桿菌的羥化酶(HpaBC),催化酪氨酸合成中間體對(duì)羥基苯丙酮酸(4HPP)合成3,4-二羥基扁桃酸,所構(gòu)建的合成途徑如圖1所示。

      圖1 3,4-二羥基扁桃酸合成途徑

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、MG1655,天藍(lán)色鏈霉菌M145(S. coelicolor)和質(zhì)粒pTrcHisB均為本實(shí)驗(yàn)室保存。其中pTrcHisB質(zhì)粒中trc啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lac啟動(dòng)子拼合的強(qiáng)啟動(dòng)子,受lacI阻遏蛋白調(diào)控,需要IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

      1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 Phusion超保真DNA聚合酶購(gòu)自New England Biolabs 公司;限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ購(gòu)自Fermentas公司;T4連接酶購(gòu)自TaKaRa Biotechnology公司;3,4-二羥基扁桃酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自天津希恩思生化科技有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

      LB培養(yǎng)基:酵母粉5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,氯化鈉 10 g/L;M9培養(yǎng)基:磷酸氫二鈉12.8 g/L,磷酸氫二鉀3 g/L,氯化鈉 0.5 g/L,氯化銨1 g/L,葡萄糖2 g/L,硫酸鎂0.24 g/L,氯化鈣11.1 mg/L。

      1.2 方法

      1.2.1 基因擴(kuò)增 hpaBC(GenBank:AM946981.2)擴(kuò)增:以E. coli BL21基因組DNA為模板,hpaBCF-BamHI和hpaBC-R-EcoRI為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。hpaBC-F-BamHI:5'-CGCGGATCCCATGAAACCAGA AGATTTC-3'(下劃線為BamH I酶切位點(diǎn)),hpaBCR-EcoRI:5'-CCGGAATTCTTAAATCGCAGCTTCCAT TTC-3'(下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn));PCR參數(shù):95℃ 3 min;95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 2 min,共30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。凝膠電泳回收目的片段。

      hmaS(GenBank:AJ223998.1)擴(kuò)增:甘油保存的天藍(lán)色鏈霉菌孢子稀釋10-3,取100 μL稀釋液涂于MS固體培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)48 h。收集菌絲于40 μL DMSO中,并放置-80℃冰箱進(jìn)行簡(jiǎn)單凍融,作為PCR模板;PCR引物為hmaS-F-EcoRI:5'-CC GGAATTCaagaggtataggatcccATGCCGCCCAGTGACA TC-3'(下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn),小寫(xiě)字母為核糖體識(shí)別位點(diǎn)RBS區(qū)),hmaS-R-HindIII:5'-CCCA AGCTTTCATCGGCCGGCCACTTC-3'(下劃線為Hind III酶切位點(diǎn));PCR參數(shù):95℃ 3 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。凝膠電泳回收目的片段。

      1.2.2 質(zhì)粒及重組菌構(gòu)建 以限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ對(duì)pTrcHisB質(zhì)粒和hpaBC分別進(jìn)行酶切;通過(guò)凝膠電泳回收載體及基因片段;以載體與基因片段摩爾數(shù)比為1∶3進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,獲得質(zhì)粒pTrcHisB-hpaBC。然后用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶對(duì)pTrcHisB-hpaBC和帶RBS的hmaS PCR片段進(jìn)行酶切、連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,獲得質(zhì)粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS,其中hpaBC與 hmaS在PTrc啟動(dòng)子調(diào)控下共轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS至MG1655/ΔA,獲得重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS。MG1655/ΔA[15]是本實(shí)驗(yàn)室在大腸桿菌E. coli K-12 MG1655的基因組中敲除了tyrR、pykA、pykF及pheA四個(gè)基因的突變株[16,17],以增強(qiáng)前體4HPP的合成。

      1.2.3 重組菌發(fā)酵培養(yǎng) 挑取MG1655/ΔA/pTrc-BCS菌株單克隆于5 mL液體LB中,37℃培養(yǎng)12 h;按體積比為1∶50 轉(zhuǎn)接至50 mL液體LB中,37℃培養(yǎng)至OD600為0.6,加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG于30℃進(jìn)行蛋白誘導(dǎo),蛋白誘導(dǎo)時(shí)間為12 h;4 000 r/min離心10 min,收集菌體,加入50 mL M9發(fā)酵培養(yǎng)基(含葡萄糖2%)進(jìn)行重懸,然后于30℃繼續(xù)培養(yǎng),24 h后取樣測(cè)定3,4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量。

      1.2.4 3,4-二羥基扁桃酸HPLC、LC-MS分析鑒定 取發(fā)酵液1 mL,12 000 r/min離心10 min,收集上清。HPLC檢測(cè)系統(tǒng)是島津液相色譜儀;檢測(cè)條件為:HPLC流動(dòng)相A = 水(含0.1%甲酸),B=甲醇;流速= 1 mL/min,溶液配比為等濃度梯度,洗脫條件:0-15 min 2% B,16-30 min 2% B到100% B;進(jìn)樣量30 μL;液相色譜柱為 Agela Innoval MP C18柱(4.6×250 mm);UV檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

      LC-MS檢測(cè):配有紫外檢測(cè)器的安捷倫1260系統(tǒng)和配有ESI離子源探針的bruker microQ-TOFⅡ質(zhì)譜儀,檢測(cè)條件包括:Agela Innoval MP C18柱(4.6×250 mm);UV檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm;流動(dòng)相A=水(含0.1%甲酸),B=甲醇;流速= 1 mL/min,溶液配比為等濃度梯度,洗脫條件:0-15 min 2 % B,16-30 min 2% B 到100% B;進(jìn)樣量20 μL;ESI負(fù)離子源,分子量掃描范圍50-800。

      1.2.5 3,4-二羥基扁桃酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 配制濃度為10 mg/mL 3,4-二羥基扁桃酸母液,即稱(chēng)取3,4-二羥基扁桃酸10 mg,加入蒸餾水至終體積為1 mL。分別取5、1、15和20 μL 3,4-二羥基扁桃酸母液,加入蒸餾水至終體積為1 mL,配制成濃度為50、 100、150和200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液。取30 μL各濃度標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行HPLC檢測(cè),制作3,4-二羥基扁桃酸濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      1.2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化及液體發(fā)酵產(chǎn)量變化 蛋白誘導(dǎo)溫度優(yōu)化:按上述培養(yǎng)方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),其中蛋白誘導(dǎo)溫度分別設(shè)置16℃、30℃和37℃;IPTG濃度優(yōu)化:按以上培養(yǎng)方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),其中IPTG終濃度分別0.1、0.5和1 mmol/L;以?xún)?yōu)化后的條件進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)過(guò)程中一定時(shí)間取樣,用于測(cè)定菌體生長(zhǎng)量、底物葡萄糖消耗及3,4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的變化。其中菌體生物量測(cè)定發(fā)酵液OD600,葡萄糖濃度用生物傳感分析儀(SBA-40E)測(cè)定,3,4-二羥基扁桃酸濃度測(cè)定通過(guò)HPLC的峰面積及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算。各設(shè)3個(gè)處理。

      2 結(jié)果

      2.1 載體pTrcHisB-hpaBC-hmaS的構(gòu)建及驗(yàn)證

      擴(kuò)增得到hmaS及hpaBC片段大小分別為1.1 kb和2.1 kb(圖2-A)。重組載體pTrcHisB-hpaBC-hmaS用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切驗(yàn)證,得到大小為1.1、2.1和4.4 kb三條帶(圖2-B),與理論大小一致,并送金唯智測(cè)序公司進(jìn)行了DNA測(cè)序驗(yàn)證。質(zhì)粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS如圖2-C所示。

      圖2 載體pTrcHisB-hpaBC-hmaS構(gòu)建

      2.2 3,4-二羥基扁桃酸重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS的構(gòu)建

      MG1655/ΔA是本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的MG1655敲除株,破壞了酪氨酸合成途徑的負(fù)調(diào)基因和競(jìng)爭(zhēng)途徑基因如tyrR、pheA、pykA和pykF。將載體pTrcHisB-hpaBC-hmaS轉(zhuǎn)化至MG1655/ΔA,獲得3,4-二羥基扁桃酸重組菌株MG1655/ΔA/pTrc-BCS。

      2.3 發(fā)酵液中3,4-二羥基扁桃酸HPLC檢測(cè)及LC-MS鑒定

      對(duì)重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng),取24 h的發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測(cè)結(jié)果(圖3)顯示,在7.6 min處有新化合物的產(chǎn)生,與3,4-二羥基扁桃酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰保留時(shí)間(Rt)一致。3,4-二羥基扁桃酸分子量為184,LC-MS檢測(cè)結(jié)果顯示7.6 min 峰的[M-H]-= 183,[2M-H]-= 367,確定該峰對(duì)應(yīng)的化合物為3,4-二羥基扁桃酸。

      圖3 重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS發(fā)酵液HPLC檢測(cè)及LC-MS結(jié)果

      2.4 蛋白誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)產(chǎn)量的影響

      為進(jìn)一步提高3,4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量,本研究對(duì)蛋白誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度進(jìn)行了優(yōu)化篩選。根據(jù)3,4-二羥基扁桃酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算產(chǎn)量,y=0.000 100 696x+33.967 1(r2=0.999 01),其中x為峰面積,y為樣品濃度。結(jié)果(圖4)表明,蛋白誘導(dǎo)溫度為16℃時(shí),3,4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量最高,是30℃的1.3倍,是37℃的2倍;在蛋白誘導(dǎo)溫度為16℃,發(fā)酵時(shí)間為24 h等相同條件下,在IPTG濃度為0.5 mmol/L時(shí),3,4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量最高為207 mg/L。

      HmaS及HpaBC蛋白表達(dá)情況如圖5所示。16℃誘導(dǎo)的菌體進(jìn)行總蛋白和菌體超聲破碎后,取上清蛋白進(jìn)行了SDS-PAGE電泳。目的蛋白HpaBC(HpaB分子量為58.8 kD,HpaC分子量為18.5 kD)和HmaS(分子量為38.6 kD)在總蛋白和上清蛋白中的表達(dá)無(wú)明顯差異,HpaBC的兩個(gè)組分條帶較為明顯,hmaS基因在大腸桿菌中的蛋白表達(dá)量很低,在電泳圖中顯示不明顯,推測(cè)可能其來(lái)源于鏈霉菌,GC含量較高,影響了蛋白表達(dá)量。

      2.5 重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS的發(fā)酵試驗(yàn)

      重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS搖瓶發(fā)酵,蛋白誘導(dǎo)溫度為16℃,IPTG濃度為0.5 mmol/L,在發(fā)酵0、2.5、4.5、6、12、24、36、48和60 h進(jìn)行取樣,測(cè)定菌體生長(zhǎng)密度(OD600)、底物葡萄糖的消耗量及產(chǎn)物3,4-二羥基扁桃酸生成量。結(jié)果(圖6)顯示,發(fā)酵4.5-36 h,菌體快速生長(zhǎng),葡萄糖的消耗逐漸增加,3,4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量快速增加,至36 h時(shí)3,4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量達(dá)到240 mg/L,葡萄糖總消耗量為14.7 g/L。在36 h菌體生長(zhǎng)開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期,葡萄糖消耗速率減慢,3,4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量趨于穩(wěn)定。

      圖4 DHMA發(fā)酵條件初步優(yōu)化

      圖5 蛋白SDS-PAGE電泳圖

      圖6 重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS菌株生長(zhǎng)、底物葡萄糖消耗以及DHMA產(chǎn)量曲線

      3 討論

      本研究在菌株MG1655/ΔA中成功實(shí)現(xiàn)對(duì)羥基扁桃酸合酶(HmaS)和4-羥基苯丙酮酸3-羥化酶(HpaBC)基因的表達(dá),實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中以葡萄糖為原料生物合成3,4-二羥基扁桃酸,并初步確定了合適的蛋白誘導(dǎo)的條件,即蛋白誘導(dǎo)溫度為16℃、IPTG的濃度為0.5 mmol/L,使3,4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量達(dá)到240 mg/L,首次實(shí)現(xiàn)3,4-二羥基扁桃酸在微生物中的異源生物合成。

      本研究中,把表達(dá)質(zhì)粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS轉(zhuǎn)化至MG1655,發(fā)酵結(jié)果顯示,3,4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量?jī)H為10 mg/L左右(數(shù)據(jù)未顯示)。推測(cè)野生株MG1655的4HPP的合成量低可能是影響3,4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量的重要因素。為了增強(qiáng)前體的合成,實(shí)驗(yàn)選用了本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的菌株MG1655/ΔA,在MG655基因組上敲除了4個(gè)基因——tyrR、pykA、pykF及pheA。tyrR是芳香族氨基酸合成的負(fù)調(diào)控基因,敲除后會(huì)解除前體合成途徑的負(fù)調(diào)控。pheA敲除阻斷了競(jìng)爭(zhēng)途徑苯丙氨酸的合成,促使分支酸積累,分支酸在酶促作用下合成4HPP。敲除pykA、pykF基因,可促使PEP生成更多的莽草酸合成前體DAHP(3-脫氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸),增強(qiáng)前體4HPP合成。通過(guò)提高前體的合成,重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS的3,4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量提高到野生株中的20多倍。

      本研究中所用hmaS基因DNA序列為直接從鏈霉菌中PCR獲得,并沒(méi)有進(jìn)行密碼子優(yōu)化,其在大腸桿菌中蛋白表達(dá)量較低,亦可能是影響3,4-二羥基扁桃酸的重要因素之一,進(jìn)一步的工作中可以對(duì)DNA序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,提高3,4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量。另外3,4-二羥基扁桃酸生物合成與酪氨酸的生物合成有共同的前體——對(duì)羥基苯丙酮酸(4HPP),4HPP可以在細(xì)胞內(nèi)酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TyrB)催化下生成酪氨酸[18,19],因而酪氨酸與3,4-二羥基扁桃酸的合成之間存在前體競(jìng)爭(zhēng),敲除酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TyrB)基因阻斷酪氨酸的合成,有可能進(jìn)一步提高3,4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量。

      4 結(jié)論

      本研究在大腸桿菌MG1655/ΔA中構(gòu)建了3,4-二羥基扁桃酸生物合成途徑,實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖為原料生物合成3,4-二羥基扁桃酸。

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      (責(zé)任編輯 馬鑫)

      Biosynthesis of 3,4-dihydroxymandelic Acid in an Engineered Escherichia coli Strain

      LI Xiao-lin1,2ZHOU Wei2ZHUANG Yi-bin2LU Fu-ping1YIN Hua2
      (1. School of Biological Engineering,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457;2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,Chinese Academy of Sciences,Tianjin 300308)

      3,4-dihydroxymandelic acid,an important pharmaceutical and spices intermediate,possesses strong antioxidative and radical scavenging activities. To achieve the de novo biosynthesis of 3,4-dihydroxymandelic acid in Escherichia coli,the genes of hydroxymandelate synthase(HmaS)from Streptomyces coelicolor and 4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase(HpaBC)from E. coli were cloned into pTrcHisB and overexpressed in an engineered E. coli strain MG1655/ΔA. After induction of IPTG and optimization of the inducing temperature,the yield of 3,4-dihydroxymandelic acid reached 240 mg/L in shake flask after 36 hours fermentation,laying a foundation for the large-scale fermentation production of 3,4-dihydroxymandelic acid .

      Escherichia coli;3,4-dihydroxymandelic acid;biosynthesis;HmaS;HpaBC

      10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.015

      2016-03-23

      國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31400026)

      李曉林,女,碩士研究生,研究方向:天然產(chǎn)物合成生物學(xué),E-mail:li_xl@tib.cas.cn;周威為本文并列第一作者

      殷華,女,博士,研究方向:天然產(chǎn)物合成生物學(xué);E-mail:yin_h@tib.cas.cn

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