3，4-二羥基扁桃酸在大腸桿菌中的生物合成

李曉林周威莊以彬路福平殷華（. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308）

3，4-二羥基扁桃酸在大腸桿菌中的生物合成

李曉林1，2周威2莊以彬2路福平1殷華2
（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308）

3，4-二羥基扁桃酸是許多藥物和香料合成的重要中間體，具有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的活性。旨在實(shí)現(xiàn)3，4-二羥基扁桃酸在大腸桿菌中的從頭合成。通過(guò)在大腸桿菌MG1655/ΔA中過(guò)表達(dá)來(lái)源于天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）的對(duì)羥基扁桃酸合酶（HmaS）和大腸桿菌的羥化酶（HpaBC）基因，實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖為原料生物合成3，4-二羥基扁桃酸；并經(jīng)IPTG和蛋白誘導(dǎo)溫度初步優(yōu)化后，搖瓶發(fā)酵36 h 3，4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量達(dá)到240 mg/L。

大腸桿菌；3，4-二羥基扁桃酸；生物合成；對(duì)羥基扁桃酸合酶（HmaS）；羥化酶（HpaBC）

3，4-二羥基扁桃酸，英文名3，4-Dihydroxymandelic acid（DHMA），是多種醫(yī)藥（如磺胺增效劑3，4，5-三甲氧基嘧啶，TMP）、香料（如香草基杏仁酸、香蘭素）合成的重要中間體［1-3］，其本身也是一種有效的抗氧化劑和自由基清除劑，如DPPH（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其自由基清除活性是維生素C、維生素E、抗氧劑264（butylated hydroxytoluene）的4倍［4］。目前，3，4-二羥基扁桃酸主要通過(guò)化學(xué)方法來(lái)合成，如以鄰苯二酚與乙醛酸為原料，在堿性條件下縮合而實(shí)現(xiàn)合成［2，5］。然而，這種化學(xué)合成的方法收率低，產(chǎn)生大量的堿性廢液，造成環(huán)境污染。利用微生物合成的方法將有效避免化學(xué)合成中復(fù)雜條件的控制以及環(huán)境污染等問(wèn)題，因而受到越來(lái)越多研究人員的關(guān)注。大腸桿菌由于其遺傳背景清晰，遺傳操作技術(shù)簡(jiǎn)單，易于大規(guī)?；后w發(fā)酵生產(chǎn)，作為天然化合物的異源合成宿主越來(lái)越受到重視。近年來(lái)，許多來(lái)源于酪氨酸合成途徑的芳香族衍生物，如咖啡酸、沒(méi)食子酸、黑色素、丹參素、羥基酪醇等已實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的生物合成［6-8］，3，4-二羥基扁桃酸在微生物中異源生物合成方法尚未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)羥基扁桃酸合酶（HmaS）基因存在于萬(wàn)古霉素類(lèi)抗生素生物合成基因簇中，是一種Fe2+依賴(lài)型的雙加氧酶，能將對(duì)羥基苯丙酮酸芐基脫羧和羥基化生成對(duì)羥基扁桃酸［9-12］。來(lái)源于大腸桿菌的羥化酶（HpaBC）被報(bào)道是一個(gè)雙組份的單氧化酶，具有較大的底物寬泛性，能催化單羥基酚和二羥基酚類(lèi)化合物苯環(huán)發(fā)生羥化反應(yīng)，如催化對(duì)羥基苯乙酸、苯酚、酪氨酸（tyrosine）及香豆酸（coumanic acid）等底物［13，14］。本研究以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的酪氨酸高產(chǎn)的大腸桿菌為出發(fā)菌株，引入來(lái)源于天藍(lán)色鏈霉菌M145（Streptomyces coelicolor）的對(duì)羥基扁桃酸合酶（HmaS）和大腸桿菌的羥化酶（HpaBC），催化酪氨酸合成中間體對(duì)羥基苯丙酮酸（4HPP）合成3，4-二羥基扁桃酸，所構(gòu)建的合成途徑如圖1所示。

圖1 3，4-二羥基扁桃酸合成途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）、MG1655，天藍(lán)色鏈霉菌M145（S. coelicolor）和質(zhì)粒pTrcHisB均為本實(shí)驗(yàn)室保存。其中pTrcHisB質(zhì)粒中trc啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lac啟動(dòng)子拼合的強(qiáng)啟動(dòng)子，受lacI阻遏蛋白調(diào)控，需要IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 Phusion超保真DNA聚合酶購(gòu)自New England Biolabs 公司；限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ購(gòu)自Fermentas公司；T4連接酶購(gòu)自TaKaRa Biotechnology公司；3，4-二羥基扁桃酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自天津希恩思生化科技有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉 10 g/L；M9培養(yǎng)基：磷酸氫二鈉12.8 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，氯化鈉 0.5 g/L，氯化銨1 g/L，葡萄糖2 g/L，硫酸鎂0.24 g/L，氯化鈣11.1 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 基因擴(kuò)增 hpaBC（GenBank：AM946981.2）擴(kuò)增：以E. coli BL21基因組DNA為模板，hpaBCF-BamHI和hpaBC-R-EcoRI為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。hpaBC-F-BamHI：5'-CGCGGATCCCATGAAACCAGA AGATTTC-3'（下劃線為BamH I酶切位點(diǎn)），hpaBCR-EcoRI：5'-CCGGAATTCTTAAATCGCAGCTTCCAT TTC-3'（下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn)）；PCR參數(shù)：95℃ 3 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。凝膠電泳回收目的片段。

hmaS（GenBank：AJ223998.1）擴(kuò)增：甘油保存的天藍(lán)色鏈霉菌孢子稀釋10-3，取100 μL稀釋液涂于MS固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h。收集菌絲于40 μL DMSO中，并放置-80℃冰箱進(jìn)行簡(jiǎn)單凍融，作為PCR模板；PCR引物為hmaS-F-EcoRI：5'-CC GGAATTCaagaggtataggatcccATGCCGCCCAGTGACA TC-3'（下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn)，小寫(xiě)字母為核糖體識(shí)別位點(diǎn)RBS區(qū)），hmaS-R-HindIII：5'-CCCA AGCTTTCATCGGCCGGCCACTTC-3'（下劃線為Hind III酶切位點(diǎn)）；PCR參數(shù)：95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。凝膠電泳回收目的片段。

1.2.2 質(zhì)粒及重組菌構(gòu)建 以限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ對(duì)pTrcHisB質(zhì)粒和hpaBC分別進(jìn)行酶切；通過(guò)凝膠電泳回收載體及基因片段；以載體與基因片段摩爾數(shù)比為1∶3進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得質(zhì)粒pTrcHisB-hpaBC。然后用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶對(duì)pTrcHisB-hpaBC和帶RBS的hmaS PCR片段進(jìn)行酶切、連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，獲得質(zhì)粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS，其中hpaBC與 hmaS在PTrc啟動(dòng)子調(diào)控下共轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS至MG1655/ΔA，獲得重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS。MG1655/ΔA［15］是本實(shí)驗(yàn)室在大腸桿菌E. coli K-12 MG1655的基因組中敲除了tyrR、pykA、pykF及pheA四個(gè)基因的突變株［16，17］，以增強(qiáng)前體4HPP的合成。

1.2.3 重組菌發(fā)酵培養(yǎng) 挑取MG1655/ΔA/pTrc-BCS菌株單克隆于5 mL液體LB中，37℃培養(yǎng)12 h；按體積比為1∶50 轉(zhuǎn)接至50 mL液體LB中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6，加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG于30℃進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)，蛋白誘導(dǎo)時(shí)間為12 h；4 000 r/min離心10 min，收集菌體，加入50 mL M9發(fā)酵培養(yǎng)基（含葡萄糖2%）進(jìn)行重懸，然后于30℃繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后取樣測(cè)定3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量。

1.2.4 3，4-二羥基扁桃酸HPLC、LC-MS分析鑒定 取發(fā)酵液1 mL，12 000 r/min離心10 min，收集上清。HPLC檢測(cè)系統(tǒng)是島津液相色譜儀；檢測(cè)條件為：HPLC流動(dòng)相A = 水（含0.1%甲酸），B=甲醇；流速= 1 mL/min，溶液配比為等濃度梯度，洗脫條件：0-15 min 2% B，16-30 min 2% B到100% B；進(jìn)樣量30 μL；液相色譜柱為 Agela Innoval MP C18柱（4.6×250 mm）；UV檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

LC-MS檢測(cè)：配有紫外檢測(cè)器的安捷倫1260系統(tǒng)和配有ESI離子源探針的bruker microQ-TOFⅡ質(zhì)譜儀，檢測(cè)條件包括：Agela Innoval MP C18柱（4.6×250 mm）；UV檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；流動(dòng)相A=水（含0.1%甲酸），B=甲醇；流速= 1 mL/min，溶液配比為等濃度梯度，洗脫條件：0-15 min 2 % B，16-30 min 2% B 到100% B；進(jìn)樣量20 μL；ESI負(fù)離子源，分子量掃描范圍50-800。

1.2.5 3，4-二羥基扁桃酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 配制濃度為10 mg/mL 3，4-二羥基扁桃酸母液，即稱(chēng)取3，4-二羥基扁桃酸10 mg，加入蒸餾水至終體積為1 mL。分別取5、1、15和20 μL 3，4-二羥基扁桃酸母液，加入蒸餾水至終體積為1 mL，配制成濃度為50、 100、150和200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液。取30 μL各濃度標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，制作3，4-二羥基扁桃酸濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化及液體發(fā)酵產(chǎn)量變化 蛋白誘導(dǎo)溫度優(yōu)化：按上述培養(yǎng)方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中蛋白誘導(dǎo)溫度分別設(shè)置16℃、30℃和37℃；IPTG濃度優(yōu)化：按以上培養(yǎng)方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中IPTG終濃度分別0.1、0.5和1 mmol/L；以?xún)?yōu)化后的條件進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中一定時(shí)間取樣，用于測(cè)定菌體生長(zhǎng)量、底物葡萄糖消耗及3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的變化。其中菌體生物量測(cè)定發(fā)酵液OD600，葡萄糖濃度用生物傳感分析儀（SBA-40E）測(cè)定，3，4-二羥基扁桃酸濃度測(cè)定通過(guò)HPLC的峰面積及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算。各設(shè)3個(gè)處理。

2 結(jié)果

2.1 載體pTrcHisB-hpaBC-hmaS的構(gòu)建及驗(yàn)證

擴(kuò)增得到hmaS及hpaBC片段大小分別為1.1 kb和2.1 kb（圖2-A）。重組載體pTrcHisB-hpaBC-hmaS用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切驗(yàn)證，得到大小為1.1、2.1和4.4 kb三條帶（圖2-B），與理論大小一致，并送金唯智測(cè)序公司進(jìn)行了DNA測(cè)序驗(yàn)證。質(zhì)粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS如圖2-C所示。

圖2 載體pTrcHisB-hpaBC-hmaS構(gòu)建

2.2 3，4-二羥基扁桃酸重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS的構(gòu)建

MG1655/ΔA是本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的MG1655敲除株，破壞了酪氨酸合成途徑的負(fù)調(diào)基因和競(jìng)爭(zhēng)途徑基因如tyrR、pheA、pykA和pykF。將載體pTrcHisB-hpaBC-hmaS轉(zhuǎn)化至MG1655/ΔA，獲得3，4-二羥基扁桃酸重組菌株MG1655/ΔA/pTrc-BCS。

2.3 發(fā)酵液中3，4-二羥基扁桃酸HPLC檢測(cè)及LC-MS鑒定

對(duì)重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，取24 h的發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，在7.6 min處有新化合物的產(chǎn)生，與3，4-二羥基扁桃酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰保留時(shí)間（Rt）一致。3，4-二羥基扁桃酸分子量為184，LC-MS檢測(cè)結(jié)果顯示7.6 min 峰的［M-H］-= 183，［2M-H］-= 367，確定該峰對(duì)應(yīng)的化合物為3，4-二羥基扁桃酸。

圖3 重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS發(fā)酵液HPLC檢測(cè)及LC-MS結(jié)果

2.4 蛋白誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)產(chǎn)量的影響

為進(jìn)一步提高3，4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量，本研究對(duì)蛋白誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度進(jìn)行了優(yōu)化篩選。根據(jù)3，4-二羥基扁桃酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算產(chǎn)量，y=0.000 100 696x+33.967 1（r2=0.999 01），其中x為峰面積，y為樣品濃度。結(jié)果（圖4）表明，蛋白誘導(dǎo)溫度為16℃時(shí)，3，4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量最高，是30℃的1.3倍，是37℃的2倍；在蛋白誘導(dǎo)溫度為16℃，發(fā)酵時(shí)間為24 h等相同條件下，在IPTG濃度為0.5 mmol/L時(shí)，3，4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量最高為207 mg/L。

HmaS及HpaBC蛋白表達(dá)情況如圖5所示。16℃誘導(dǎo)的菌體進(jìn)行總蛋白和菌體超聲破碎后，取上清蛋白進(jìn)行了SDS-PAGE電泳。目的蛋白HpaBC（HpaB分子量為58.8 kD，HpaC分子量為18.5 kD）和HmaS（分子量為38.6 kD）在總蛋白和上清蛋白中的表達(dá)無(wú)明顯差異，HpaBC的兩個(gè)組分條帶較為明顯，hmaS基因在大腸桿菌中的蛋白表達(dá)量很低，在電泳圖中顯示不明顯，推測(cè)可能其來(lái)源于鏈霉菌，GC含量較高，影響了蛋白表達(dá)量。

2.5 重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS的發(fā)酵試驗(yàn)

重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS搖瓶發(fā)酵，蛋白誘導(dǎo)溫度為16℃，IPTG濃度為0.5 mmol/L，在發(fā)酵0、2.5、4.5、6、12、24、36、48和60 h進(jìn)行取樣，測(cè)定菌體生長(zhǎng)密度（OD600）、底物葡萄糖的消耗量及產(chǎn)物3，4-二羥基扁桃酸生成量。結(jié)果（圖6）顯示，發(fā)酵4.5-36 h，菌體快速生長(zhǎng)，葡萄糖的消耗逐漸增加，3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量快速增加，至36 h時(shí)3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量達(dá)到240 mg/L，葡萄糖總消耗量為14.7 g/L。在36 h菌體生長(zhǎng)開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，葡萄糖消耗速率減慢，3，4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量趨于穩(wěn)定。

圖4 DHMA發(fā)酵條件初步優(yōu)化

圖5 蛋白SDS-PAGE電泳圖

圖6 重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS菌株生長(zhǎng)、底物葡萄糖消耗以及DHMA產(chǎn)量曲線

3 討論

本研究在菌株MG1655/ΔA中成功實(shí)現(xiàn)對(duì)羥基扁桃酸合酶（HmaS）和4-羥基苯丙酮酸3-羥化酶（HpaBC）基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中以葡萄糖為原料生物合成3，4-二羥基扁桃酸，并初步確定了合適的蛋白誘導(dǎo)的條件，即蛋白誘導(dǎo)溫度為16℃、IPTG的濃度為0.5 mmol/L，使3，4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量達(dá)到240 mg/L，首次實(shí)現(xiàn)3，4-二羥基扁桃酸在微生物中的異源生物合成。

本研究中，把表達(dá)質(zhì)粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS轉(zhuǎn)化至MG1655，發(fā)酵結(jié)果顯示，3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量?jī)H為10 mg/L左右（數(shù)據(jù)未顯示）。推測(cè)野生株MG1655的4HPP的合成量低可能是影響3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量的重要因素。為了增強(qiáng)前體的合成，實(shí)驗(yàn)選用了本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的菌株MG1655/ΔA，在MG655基因組上敲除了4個(gè)基因——tyrR、pykA、pykF及pheA。tyrR是芳香族氨基酸合成的負(fù)調(diào)控基因，敲除后會(huì)解除前體合成途徑的負(fù)調(diào)控。pheA敲除阻斷了競(jìng)爭(zhēng)途徑苯丙氨酸的合成，促使分支酸積累，分支酸在酶促作用下合成4HPP。敲除pykA、pykF基因，可促使PEP生成更多的莽草酸合成前體DAHP（3-脫氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸），增強(qiáng)前體4HPP合成。通過(guò)提高前體的合成，重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS的3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量提高到野生株中的20多倍。

本研究中所用hmaS基因DNA序列為直接從鏈霉菌中PCR獲得，并沒(méi)有進(jìn)行密碼子優(yōu)化，其在大腸桿菌中蛋白表達(dá)量較低，亦可能是影響3，4-二羥基扁桃酸的重要因素之一，進(jìn)一步的工作中可以對(duì)DNA序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，提高3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量。另外3，4-二羥基扁桃酸生物合成與酪氨酸的生物合成有共同的前體——對(duì)羥基苯丙酮酸（4HPP），4HPP可以在細(xì)胞內(nèi)酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（TyrB）催化下生成酪氨酸［18，19］，因而酪氨酸與3，4-二羥基扁桃酸的合成之間存在前體競(jìng)爭(zhēng)，敲除酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（TyrB）基因阻斷酪氨酸的合成，有可能進(jìn)一步提高3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本研究在大腸桿菌MG1655/ΔA中構(gòu)建了3，4-二羥基扁桃酸生物合成途徑，實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖為原料生物合成3，4-二羥基扁桃酸。

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［19］Seiki K, Katsura I, Ogawa T, et al. Aromatic amino acid aminotransferase of Escherichia coli：nucleotide sequence of the tyrB gene［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1985, 133：134-139.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Biosynthesis of 3，4-dihydroxymandelic Acid in an Engineered Escherichia coli Strain

LI Xiao-lin1，2ZHOU Wei2ZHUANG Yi-bin2LU Fu-ping1YIN Hua2
（1. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457；2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

3，4-dihydroxymandelic acid，an important pharmaceutical and spices intermediate，possesses strong antioxidative and radical scavenging activities. To achieve the de novo biosynthesis of 3，4-dihydroxymandelic acid in Escherichia coli，the genes of hydroxymandelate synthase（HmaS）from Streptomyces coelicolor and 4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase（HpaBC）from E. coli were cloned into pTrcHisB and overexpressed in an engineered E. coli strain MG1655/ΔA. After induction of IPTG and optimization of the inducing temperature，the yield of 3，4-dihydroxymandelic acid reached 240 mg/L in shake flask after 36 hours fermentation，laying a foundation for the large-scale fermentation production of 3，4-dihydroxymandelic acid .

Escherichia coli；3，4-dihydroxymandelic acid；biosynthesis；HmaS；HpaBC

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.015

2016-03-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31400026）

李曉林，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物合成生物學(xué)，E-mail：li_xl@tib.cas.cn；周威為本文并列第一作者

殷華，女，博士，研究方向：天然產(chǎn)物合成生物學(xué)；E-mail：yin_h@tib.cas.cn