基于UPLC-Q-TOF MS技術(shù)的三七中皂苷類成分質(zhì)譜裂解規(guī)律研究

趙 靜，秦振嫻，彭 冰，劉永剛，劉 勇

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102；2.國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作四川中心，四川 成都 610203；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京市中醫(yī)研究所，北京 100010)

基于UPLC-Q-TOF MS技術(shù)的三七中皂苷類成分質(zhì)譜裂解規(guī)律研究

趙 靜1,2，秦振嫻1，彭 冰3，劉永剛1，劉 勇1

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102；2.國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作四川中心，四川 成都 610203；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京市中醫(yī)研究所，北京 100010)

采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)法快速分析三七中17種化合物，包括4對(duì)人參皂苷同分異構(gòu)體，即三七皂苷R1、R2，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rg3、Rb1、Rb2、Rb3、Re、Rf、Rc、Ro、Rd、Rk1、Rh1和擬人參皂苷F11。采用Waters Acquity UPLCTMBEH C18色譜柱(2.1 mm ×150 mm×1.7 μm)，以乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在電噴霧負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，17種常見的三七皂苷和人參皂苷化合物對(duì)照品(包含多種同分異構(gòu)體皂苷)可被液相色譜完全分離，通過歸納總結(jié)質(zhì)譜全裂解信息，探討了其裂解規(guī)律和特征離子。該方法可為快速鑒定和分析含有三七皂苷和人參皂苷類成分的化合物提供參考，并為全面表征三七指紋圖譜提供依據(jù)。

超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)；人參皂苷；裂解途徑；三七

三七為五加科植物(Araliaceae)三七Panaxnotoginseng的干燥根和根莖，是臨床常用貴重中藥材之一，具有散瘀止血、消腫定痛之功效。三七在血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等方面具有生理活性，尤其對(duì)心、腦血管系統(tǒng)疾病具有明顯療效，可以降低心肌耗氧量、改善心肌缺血、抗心律失常、降血脂、降血壓、抗休克等，同時(shí)還能改善腦血循環(huán)和保護(hù)實(shí)驗(yàn)性腦缺血[1-4]。達(dá)瑪烷型三萜皂苷是三七的主要活性成分，分為原人參二醇型和原人參三醇型兩大類[5-6]。在三七中未發(fā)現(xiàn)齊墩果烷型皂苷，而此類皂苷在人參、西洋參中可見，這是三七與人參的顯著差異。目前，對(duì)三七植物的不同部位進(jìn)行分離提取，已確定了70多種單體皂苷成分[7-9]，且隨著研究進(jìn)展，不斷有新單體化合物被鑒別。

傳統(tǒng)的中藥分析方法主要基于一種藥材分離純化，將得到的純化合物進(jìn)行四大光譜分析，耗時(shí)耗材，且常常因成分含量低不能純化而難以鑒別。除了系統(tǒng)分離外，液相色譜-質(zhì)譜法可鑒定出三七中可能存在的多種皂苷類成分，其中以原人參二醇型三萜皂苷和原人參三醇型三萜皂苷最多。然而，以往研究[12-14]使用的液相色譜-質(zhì)譜儀多為低分辨率，所提供的裂解信息有限，而三七、人參中的皂苷存在大量的同分異構(gòu)體，它們具有相同的相對(duì)分子質(zhì)量，相似的特征峰，甚至相似的碎片信息，這給分析帶來了困難。超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)法集UPLC快速有效的色譜分離能力和Q-TOF高分辨質(zhì)譜的高靈敏度于一體，在迅速識(shí)別和表征化合物方面得到廣泛應(yīng)用。如，孫靖輝等[15]采用ESI-Q-TOF-MS/MS法成功地區(qū)分了同分異構(gòu)體人參皂苷Rh2和CK；郝穎等[16]采用RPLC-Q-TOF-MS/MS法分析了生曬參和大力參中的皂苷類成分。

本研究擬采用UPLC-Q-TOF MS法分析鑒定17種常見的三七皂苷、人參皂苷化合物的對(duì)照品，并探討其裂解特征離子，希望為快速鑒定含有三七皂苷、人參皂苷類成分化合物提供參考，也為全面表征三七指紋圖譜成分提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Acquity超高效液相色譜分析系統(tǒng)、Q-TOF MS高分辨四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品，配有Masslynx4.1數(shù)據(jù)軟件處理系統(tǒng)、Acquity UPLCTMBEH C18色譜柱(2.1 mm×150 mm×1.7 μm)、電噴霧離子源(ESI)。

三七皂苷R1、R2，人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Rb3、Re、Rf、Rc、Ro、Rd、Rk1、Rh1、Rh2，擬人參皂苷F11(HPLC面積歸一化法計(jì)算含量≥98%)：均為成都曼斯特生物科技有限公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)：美國Fisher公司產(chǎn)品；甲酸(質(zhì)譜純)：美國Fisher公司產(chǎn)品；超純水：由南京權(quán)坤生物科技有限公司超純水器制得。

1.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取2 mg三七皂苷R1、R2，人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Rb3、Re、Rf、Rc、Ro、Rd、Rk1、Rh1、Rh2，擬人參皂苷F11對(duì)照品粉末于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLCTMBEH C18柱(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)；柱溫35 ℃；流動(dòng)相：乙腈(A)，含0.1%甲酸水溶液(B)；梯度洗脫程序：0～3 min(19%A)，3～10 min(19%～22%A)，10～11 min(22%～24%A)，11～41 min(24%A)，41～43 min(24%～29%A)，43～44 min(29%～30%A)，44～50 min(30%～35%A)，50～52 min(35%～50%A)，52～60 min(50%～64%A)，60～61 min(64%～100%A)；進(jìn)樣量1 μL；流速0.45 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓2 500 V，裂解電壓60～70 V，離子源溫度300 ℃，干燥氣(N2)流速800 L/h。采用Lock Mass通路對(duì)采集的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 負(fù)離子模式下的總離子流圖

三七皂苷中存在多種同分異構(gòu)體，尤其此17種皂苷對(duì)照品中包含4組10個(gè)同分異構(gòu)體。在ESI負(fù)離子模式下，17種對(duì)照品得到了完全分離，其總離子流圖示于圖1。17種對(duì)照品對(duì)應(yīng)的5種皂苷類結(jié)構(gòu)類型示于圖2，各化合物的結(jié)構(gòu)列于表1。

圖1 17種對(duì)照品的總離子流圖Fig.1 TIC of 17 saponins

2.2 各化合物的一、二級(jí)質(zhì)譜

皂苷類成分因苷元四環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在較大的裂解壓力下也僅能產(chǎn)生糖碎片。本實(shí)驗(yàn)在1.3節(jié)條件下能夠得到清晰的一、二級(jí)裂解峰，精確分子質(zhì)量信息與理論分子質(zhì)量值相吻合，質(zhì)譜碎片信息全面穩(wěn)定，且能觀察到苷元的裂解信息，各成分的母離子及碎片離子數(shù)據(jù)信息列于表2。

2.3 糖鏈的斷裂及裂解特征

多數(shù)皂苷至少含有1個(gè)糖鏈結(jié)構(gòu)，由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖等構(gòu)成單糖或多糖，因此需要對(duì)糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究以確定皂苷結(jié)構(gòu)。在負(fù)離子模式下，這些糖苷鍵斷裂分別失去162、146、132、132 u。17種皂苷的糖類裂解均發(fā)現(xiàn)了m/z101.02、113.02、119.03、161.04、179.05碎片離子，提示為葡萄糖的裂解碎片離子。通過比較苷元和糖鏈位置相同但數(shù)目不同的皂苷發(fā)現(xiàn)，皂苷所連接的糖越多，其糖的碎片離子豐度越大。人參皂苷Rb1、Rg3、Rh2的苷元結(jié)構(gòu)一致，但含有的葡萄糖數(shù)量不同，分別為4、2、1個(gè)，其離子豐度依次降低，示于圖3。

此外，不同的糖組成的糖鏈會(huì)出現(xiàn)不同的離子峰。如2個(gè)六碳醛糖(如葡萄糖)相連的糖鏈會(huì)出現(xiàn)m/z221.07碎片離子峰，在擬人參皂苷F11，人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rg3、Rk1中可看到；六碳醛糖與甲基五碳醛糖(如葡萄糖與鼠李糖)相連的糖鏈會(huì)出現(xiàn)m/z205.07碎片離子峰，在人參皂苷Re、Rg2，擬人參皂苷F11中可看到；六碳醛糖與五碳醛糖(如葡萄糖與阿拉伯糖或木糖)相連會(huì)出現(xiàn)m/z191.05碎片離子，在三七皂苷R1、R2，人參皂苷Rc、Rb2、Rb3中可看到，其裂解方式示于圖4。

圖2 皂苷類結(jié)構(gòu)骨架類型Fig.2 Aglycone skeleton structures of five types

編號(hào)No.化合物Compound類型Type取代基SubstituentgroupR1R21三七皂苷R1II-Glc2→1Xyl-Glc2人參皂苷Rg1Ⅱ-Glc-Glc3人參皂苷ReⅡ-Glc2→1Rha-Glc4人參皂苷RfⅡ-Glc2→1Glc-H5擬人參皂苷F11Ⅲ-Glc2→1Rha—6人參皂苷Rh1Ⅱ-Glc-H7三七皂苷R2Ⅱ-Glc2→1Xyl-H8人參皂苷Rg2Ⅱ-Glc2→1Rha-H9人參皂苷Rb1Ⅰ-Glc2→1Glc-Glc6→1Glc10人參皂苷RoⅣ-GlcuA2→1Glc-Glc11人參皂苷RcⅠ-Glc2→1Glc-Glc6→1Ara(f)12人參皂苷Rb2Ⅰ-Glc2→1Glc-Glc6→1Ara(p)13人參皂苷Rb3Ⅰ-Glc2→1Glc-Glc6→1Xyl14人參皂苷RdⅠ-Glc2→1Glc-Glc15人參皂苷Rg3Ⅰ-Glc2→1Glc-H16人參皂苷Rk1Ⅵ-Glc4→1Glc—17人參皂苷Rh2Ⅰ-Glc-H

注：葡萄糖(Glc)：β-D-葡萄糖；木糖(Xyl)：β-D-木糖；鼠李糖(Rha)：α-l-鼠李糖；阿拉伯糖(Ara(f))：α-l-阿拉伯糖(呋喃型)；阿拉伯糖(Ara(p))：α-l-阿拉伯糖(吡喃型)；葡萄糖醛酸(GlcuA)：β-D-葡萄糖醛酸

表2 各成分的母離子及主要碎片離子Table 2 Parent ions and major fragment ions of components

圖3 人參皂苷Rb1(a)，Rg3(b)，Rh2(c)的離子豐度Fig.3 Ion abundance of ginsenoside Rb1 (a), Rg3 (b), Rh2 (c)

2.4 I型皂苷的裂解規(guī)律

人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rg3、Rh2均為I型皂苷，即原人參二醇型皂苷。I型皂苷最顯著的特點(diǎn)是糖鏈部分通常取代苷元C-3位和C-20位，而C-6位無取代，在一級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生較強(qiáng)的[M+HCOO]-和[M—H]-離子。

圖4 不同糖鏈的裂解方式Fig.4 Fragmentation pathway of different disaccharide sugars

Ⅰ型皂苷的特征碎片離子為豐度較大的苷元碎片離子m/z459.38和苷元失去C-17支鏈形成的碎片離子m/z375.29。據(jù)報(bào)道[17]，在多數(shù)的人參皂苷裂解規(guī)律研究中僅發(fā)現(xiàn)皂苷上糖的斷裂，而未發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下苷元的進(jìn)一步裂解，這是因?yàn)樗沫h(huán)三萜皂苷具有較穩(wěn)定的，難以破壞的皂苷元結(jié)構(gòu)。本研究通過提高裂解電壓等方法，幾乎使得所有皂苷都能產(chǎn)生苷元裂解。在I型皂苷中，四環(huán)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)上鏈有C-17支鏈，因此在強(qiáng)烈的裂解電壓下能夠失去烷基取代基，從而形成豐度較大的m/z375.29碎片離子。

以人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd為例，人參皂苷Rb1二級(jí)質(zhì)譜中出現(xiàn)m/z1 107.595 8，即[M—H]-，與標(biāo)準(zhǔn)精確分子質(zhì)量1 107.595 1僅相差0.7×10-6，該分子離子峰相繼失去四分子葡萄糖，得到m/z945.541 8、783.487 9、621.434 0、459.381 8主要碎片離子，m/z459.381 8為其苷元。人參皂苷Rd的一級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)[M+HCOO]-m/z991.550 7和[M—H]-m/z945.543 3離子，與標(biāo)準(zhǔn)精確分子質(zhì)量相差10-6，其主要碎片離子為脫去一分子葡萄糖產(chǎn)生的[M—H—glc]-m/z783.488 6，脫去二分子葡萄糖產(chǎn)生的[M—H—glc—glc]-m/z621.438 3，人參二醇型皂苷苷元碎片m/z459.383 1和苷元去掉C-20 鏈的碎片離子m/z375.290 5。

三七中存在多種同分異構(gòu)體，當(dāng)不同的異構(gòu)體分屬不同的皂苷類型時(shí)，可根據(jù)裂解碎片特征離子進(jìn)行區(qū)分；當(dāng)屬于同種類型皂苷時(shí)，異構(gòu)體很難得以區(qū)分。人參皂苷Rc、Rb2、Rb3均屬于I型皂苷，且相對(duì)分子質(zhì)量相同，區(qū)別在于C-20糖鏈末端糖異構(gòu)；人參皂苷Rc為呋喃型阿拉伯糖，人參皂苷Rb2為吡喃型阿拉伯糖，人參皂苷Rb3為木糖。在一、二級(jí)質(zhì)譜圖中，二者所有裂解碎片均一致，將糖碎片部分裂解放大仍完全一致。但是，在一級(jí)質(zhì)譜中，人參皂苷Rc的碎片離子m/z561與人參皂苷Rb2的碎片離子m/z538的豐度比不同；人參皂苷Rc中，m/z561與m/z538碎片離子豐度比大于1，而人參皂苷Rb2與Rb3中，其豐度比小于1，豐度比差異示于圖5，其原因有待進(jìn)一步研究，但僅憑質(zhì)譜裂解難以有效區(qū)分人參皂苷Rb2和人參皂苷Rb3。

此外，人參皂苷Rc、Rb2、Rb3均產(chǎn)生m/z945.54和m/z783.49離子，即[M—H—Ara]-和[M—H—Ara—glc]-，或[M—H—xyl]-和[M—H—Ara—glc]-，表明C-20位糖鏈末端阿拉伯糖或木糖在裂解中比C-3位糖鏈更容易失去。這可能是C-20由于空間阻礙更容易脫去糖鏈而獲得較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，由此可用于判斷糖的位置。

2.5 Ⅱ型皂苷的裂解規(guī)律

三七皂苷R1，人參皂苷Rg1、Re、Rf、R2、Rh1和Rg2均為Ⅱ型人參皂苷，即原人參三醇型三萜皂苷。與Ⅰ型皂苷結(jié)構(gòu)母核不同的是，Ⅱ型人參皂苷C-6位有羥基且由糖鏈取代，而C-3無取代。盡管二者結(jié)構(gòu)上的差別不大，但在裂解碎片離子上的差別較大。Ⅱ型皂苷特征碎片離子為m/z475.37和m/z391.28。其中，苷元碎片離子m/z475.37同I型皂苷相同，四環(huán)上的烷基取代C-17支鏈容易失去，從而得到去掉C-17支鏈84 u的豐度較大的m/z391.28碎片離子。

以三七皂苷R1為例，三七皂苷R1的C-6位羥基和C-20位羥基分別有2個(gè)糖鏈，C-6位R1為二糖，由一分子葡萄糖與一分子木糖2→1位相連，C-20位為一分子葡萄糖。在一級(jí)質(zhì)譜中，基峰為[M—H+HCOO]-m/z977.533 6和[M—H]-m/z931.527 1，其質(zhì)譜圖示于圖6。在二級(jí)質(zhì)譜中，m/z799.483 0，m/z637.433 6，m/z475.379 9以及m/z391.286 1分別為[M—H—xyl]-、[M—H—xyl—glc]-、[M—H—xyl—glc—glc]-苷元。其他碎片離子，如m/z101.023 9、113.023 7、161.045 3等為三七皂苷R1的葡萄糖糖鏈碎片。三七皂苷R1可能的裂解途徑示于圖7。

圖5 一級(jí)質(zhì)譜中，人參皂苷Rc(a)與人參皂苷Rb2(b)、Rb3(c)的豐度比差異Fig.5 Abundance ratios of ginsenosides Rc (a)，ginsenosides Rb2 (b) and ginsenosides Rb3 (c) in MS

Ⅱ型皂苷人參皂苷Rg1與人參皂苷Rf為同分異構(gòu)體，分子式均為C42H72O14。在一級(jí)質(zhì)譜中均產(chǎn)生[M+HCOOH]-m/z845.490 7和[M—H]-m/z799.484 4碎片離子；在二級(jí)質(zhì)譜中均產(chǎn)生[M—H—glc]-m/z637.43和[M—H—glc—glc]-m/z457.38，以及[M—H—glc—glc—84]-m/z391.28碎片離子。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，二者的質(zhì)譜裂解存在兩種差異。第一，二者的二級(jí)質(zhì)譜中m/z637.43碎片離子，即[M—H—glc]-豐度差異很大。人參皂苷Rg1的[M—H—glc]-m/z637.43離子豐度明顯高于其他碎片離子，而在人參皂苷Rf中，該離子豐度明顯低于其他碎片離子。這是因?yàn)樵谌藚⒃碥誖g1中2個(gè)糖為2個(gè)單糖鏈，分別位于C-6和C-20位，在低能量下很容易失去1個(gè)糖，形成[M—H—glc]-m/z637.43離子，因此豐度較高；而C-20位糖苷鍵斷裂所需的碰撞能較低，大約為0.4～0.6 V，此外，C-20位為季碳，斷裂后更易形成較穩(wěn)定的雙鍵或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)C-12位有羥基取代，距離C-20位較近，使得C-20位受到較大的空間位阻，因此C-20糖苷鍵較易斷裂，離子豐度較高；而人參皂苷Rf的2個(gè)葡萄糖形成的糖鏈位于C-6位，在糖鏈中失去1個(gè)糖不如四環(huán)上失去二糖穩(wěn)定，因此[M—H—glc]-m/z637.43離子豐度較低。第二，二者的質(zhì)譜裂解信息在m/z50～400之間存在差異，人參皂苷Rf的2個(gè)葡萄糖相連的二糖形成了m/z221.07碎片離子，而人參皂苷Rg1中因無雙糖鏈未發(fā)現(xiàn)該碎片。

圖6 負(fù)離子模式下，三七皂苷R1的一級(jí)(a)和二級(jí)(b)質(zhì)譜圖Fig.6 MS (a) and MS/MS (b) spectrum of notoginsenoside R1 in negative ion mode

人參皂苷Re，三七皂苷R2和人參皂苷Rh1符合上述Ⅱ型皂苷裂解的普遍規(guī)律。人參皂苷Rg2與Ⅰ型皂苷Rg3互為同分異構(gòu)體，但屬于不同類型的皂苷，其裂解特征碎片離子明顯不同，因此可以被有效區(qū)分，示于圖8。

此外，I型皂苷與Ⅱ型皂苷在保留時(shí)間上有明顯區(qū)別，在17種皂苷中，Ⅱ型皂苷的保留時(shí)間均少于I型皂苷，其原因可能為Ⅱ型皂苷比I型皂苷多1個(gè)羥基，極性更大，因而更容易在反相色譜柱C18柱中洗脫。

2.6 Ⅲ型、Ⅳ型與Ⅴ型皂苷裂解規(guī)律

Ⅲ型皂苷在Ⅱ型皂苷的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上發(fā)生了少許變化，其C-20位與C-24位形成1個(gè)五元呋喃環(huán)。擬人參皂苷F11為Ⅲ型人參皂苷，是西洋參的特征成分，其與Ⅱ型皂苷人參皂苷Rf互為同分異構(gòu)體，具有相同的相對(duì)分子質(zhì)量和相似的結(jié)構(gòu)和色譜行為，擬人參皂苷F11的質(zhì)譜圖示于圖9。由于它們很難分離，因此有文獻(xiàn)[18]報(bào)道稱存在兩種皂苷的分析混淆狀況。

但擬人參皂苷F11與人參皂苷Rf不僅在液相色譜條件下能夠完全分離，在質(zhì)譜中也能得到完全區(qū)分。盡管二者的[M—H]-離子均為m/z799.485 0，但特征離子不同。Ⅲ型人參皂苷可以產(chǎn)生m/z491.373 6苷元及m/z415.36苷元碎片，推斷該苷元碎片可能的裂解途徑示于圖10。

人參皂苷Ro為Ⅳ型人參皂苷，也稱為齊墩果烷型皂苷，該型皂苷在植物中較為常見，尤其常見于人參和西洋參中，但在三七中未發(fā)現(xiàn)，是目前較為公認(rèn)的區(qū)分三七與人參和西洋參的主要依據(jù)[19]。

人參皂苷Ro的一級(jí)質(zhì)譜中存在[M—H]-m/z955.490 0離子峰，但不存在[M+HCOO—]-離子峰。在二級(jí)質(zhì)譜中，主要的離子峰有m/z955.490 0、793.436 1、569.384 0，分別為皂苷依次脫去一分子葡萄糖、兩分子葡萄糖、三分子葡萄糖，即皂苷元離子峰，裂解途徑示于圖11。此外，還可以觀察到苷元進(jìn)一步裂解的碎片離子m/z523.377 7，由于豐度較低，其結(jié)構(gòu)尚未確定。Ⅳ型皂苷最特征的離子為m/z569.384 0苷元離子。

圖7 負(fù)離子模式下，三七皂苷R1可能的裂解途徑Fig.7 Proposed fragmentation pathways of notoginsenoside R1 in negative ion mode

Ⅴ型皂苷可以看作是I型皂苷的變形，二者的區(qū)別在于支鏈的少許變化，即C-20為雙鍵。人參皂苷Rk1的一級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生m/z811.485 0[M+HCOO]-和m/z765.479 6[M—H]-碎片離子；二級(jí)質(zhì)譜主要產(chǎn)生m/z765.479 6[M—H]-、m/z603.426 0[M—H—glc]-、m/z439.358 1[M—H—glc—glc]-、m/z311.166 6等碎片離子。因此，Ⅴ型皂苷的特征離子為苷元m/z439.538 1及其碎片離子m/z311.166 6。

3 結(jié)論

本研究采用UPLC-Q-TOF MS法分析17種皂苷類成分，在1 h內(nèi)完全分離了含有多種同分異構(gòu)體的17種皂苷類成分，產(chǎn)生了較好的裂解碎片，并進(jìn)一步研究了其可能的裂解途徑。將17種皂苷類成分劃分為5種類型，Ⅰ型皂苷(原人參二醇型)、Ⅱ型皂苷(原人參三醇型)、Ⅲ型皂苷(擬人參皂苷F11)、Ⅳ型皂苷(齊墩果烷型，人參皂苷Ro)和Ⅴ型皂苷(人參皂苷Rk1)，并研究各種類型皂苷的特征離子，從而根據(jù)裂解碎片確定皂苷類型，同時(shí)對(duì)多種難以區(qū)分的同分異構(gòu)體(如人參皂苷Rc、Rb2、Rg3、擬人參皂苷 F11等)進(jìn)行有效區(qū)分。此外，研究了常見的糖及糖的裂解方式，確定了糖鏈位置和糖的類型，這可為皂苷樣品的推斷、鑒定提供較好的依據(jù)。

圖8 同分異構(gòu)體人參皂苷 Rg3(a)與 Rg2(b)的裂解特征離子Fig.8 Characteristic ions of isomers ginsenosides Rg3 (a) and Rg2 (b)

圖9 負(fù)離子模式下，擬人參皂苷F11的一級(jí)(a)和二級(jí)(b)質(zhì)譜圖Fig.9 MS (a) and MS/MS (b) spectrums of pseudoginsenoside F11 in negative ion mode

圖10 負(fù)離子模式下，Ⅲ型皂苷可能的裂解途徑Fig.10 Proposed fragmentation pathways of type Ⅲ in negative ion mode

圖11 負(fù)離子模式下，人參皂苷Ro可能的裂解途徑Fig.11 Proposed fragmentation pathways of ginsenoside Ro in negative ion mode

[1] LAM S K, NG T B. A xylanase from roots of sanchi ginseng (Panaxnotoginseng) with inhibitory effects on human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase[J]. Life Sciences, 2002, 70(25): 3 049-3 058 .

[2] CHEN S X, LIU J L, LIU X Y, et al.Panaxnotoginsengsaponins inhibit ischemia-induced apoptosis by activating PI3K/Akt pathway in cardiomyocytes[J]. Journal of Ethno-Pharmacology, 2011, 137(1): 263-270.

[3] LIU Y, XIE M X, KANG J, et al. Studies on the interaction of total saponins ofPanaxnotoginsengand human serum albumin by Fourier transform infrared spectroscopy[J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2003, 59(12): 2 747-2 758.

[4] MAO Q, LI Y, LI S L, et al. Chemical profiles and anticancer effects of saponin fractions of different polarity from the leaves ofPanaxnotoginseng[J]. Chinese Journal of Natural Medicines, 2014, 12(1): 30-37.

[5] DU Q, JERZ G, WAIBEL R, et al. Isolation of dammaranesaponins fromPanaxnotoginsengby high-speed counter-current chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2003, 1 008(2): 173-180.

[6] LAU A J, WOO S O, KOH H L. Analysis of saponins in raw and steamedPanaxnotoginsengusing high-performance liquid chromatography with diode array detection[J]. Journal of Chromatography A, 2003, 1 011(1): 77-87.

[7] KIM D H. Chemical diversity ofPanaxginseng,Panaxquinquifolium, andPanaxnotoginseng[J]. J Ginseng Res, 2012, 36(1): 1-15.

[8] HAN L F, SAKAH K J, LIU L L, et al. Saponins from roots ofPanaxnotoginseng[J]. Chinese Herbal Medicines, 2014, 6(2): 159-163.

[9] SAKAH K J, WANG T, LIU L L, et al. Eight darmarane-type saponins isolated from the roots ofPanaxnotoginseng[J]. Journal of Functional Foods, 2013, 5(8): 1 159-1 169.

[10]ZHU X J, GUO S P, FU X L, et al. Characterization of steroidal saponins in crude extracts fromDioscoreazingiberensisC.H. Wright by ultra-performance liquid chromatography/electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry[J]. J Pharm Biomed Anal, 2010, 53(3): 462-474.

[11]KANG L P, ZHAO Y, PANG X. Characterization and identification of steroidal saponins from the seeds of Trigonellafoenum-graecum by ultra high-performance liquid chromatography and hybrid time-of-flight mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2013, 74 (74): 257-267.

[12]QI L W, WANG H Y, ZHANG H. Diagnostic ion filtering to characterize ginseng saponins by rapid liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2012, 1 230(6): 93-99.

[13]LIU Y Y, LI J B, HE J M, et al. Identification of new trace triterpenoid saponins from the roots ofPanaxnotoginsengby high-performance liquidchromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2009, 23(5): 667-679.

[14]TOH D F, NEW L S, KOH H L, et al. Ultra-high performance liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry (UHPLC/TOF MS) for time-dependent profiling of raw and steamedPanaxnotoginseng[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010, 52(1): 43-50.

[15]孫靖輝，吳巍，郭迎迎，等. 利用ESI-Q-TOF-MS/MS區(qū)分人參皂苷Rh2和CK[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)， 2014,35(2):158-162.

SUN Jinghui, WU Wei, GUO Yingying, et al. Differentiation of ginsenosideisomers Rh2and CK using ESI-Q-TOF-MS/MS[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2014, 35(2): 158-162(in Chinese).

[16]郝穎，于珊珊，戴雨霖，等. RRLC-Q-TOF MS/MS法分析生曬參和大力參中的皂苷類成分[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2014,35(4):311-316.

HAO Ying, YU Shanshan, DAI Yulin, et al. Study on ginsenosidesin white ginseng and Dali ginseng by RRLC-Q-TOF MS/MS[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2014, 35(4): 311-316(in Chinese).

[17]CHANG-JIANG-SHENG L, TING T, SU-LING Z, et al. An integrated high resolution mass spectrometric data acquisition method for rapid screening of saponins inPanaxnotoginseng(Sanqi)[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2015, 109(10): 184-191.

[18]SONG F R, LIU Z Q, LIU S Y, et al. Differentiation and identification of ginsenoside isomers by electrospray ionization tandem mass spectroetry[J]. Analytica Chimica Acta, 2005, 531(1): 69-77.

[19]HAN L F, SAKAH K J, LIU L L. Saponins from roots ofPanaxnotoginseng[J]. Chinese Herbal Medicines, 2014, 6(2): 159-163.

Fragmentation Pathway of Ginsenosides inPanaxnotoginsengUsing Electrospray Ionization-Quadrupole/Time-of-Flight Mass Spectrometer

ZHAO Jing1,2, QIN Zhen-xian1, PENG Bing3, LIU Yong-gang1, LIU Yong1

(1.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China;2.PatentExaminationCooperationCenterofPatentOffice,StateIntellectualPropertyOffice,Chengdu610213,China; 3.BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine,BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalUniversity,Beijing100010,China)

Panaxnotoginseng(Burk.) F.H. Chen or Sanqi in Chinese is a well-known Chinese medicinal herb, which has been used for thousands of years in China due to its good hemostatic effect. The major bioactive compounds ofPanaxnotoginsengare Dammarane triterpenesaponins, especially protopanaxadiol and protopanaxatriol glycosides. While, the normal method of compounds identification in plants mainly based on the NMR spectra of the pure compounds, which obtained by isolation and purification on a scale of crude drugs. Liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC/MS) can identify and characterize the compounds, and has been increasingly developed for the compounds research of crude drugs. In this study, 17 compounds (notoginsenoside R1, R2, ginsenoside Rg1, Rg2, Rg3, Rb1, Rb2, Rb3, Re, Rf, Rc, Ro, Rd, Rk1, Rh1and pseudoginsenoside F11) inPanaxnotoginsengincluding four pairs of ginsenoside isomers were detected using ultra perform liquid chromatogram-electrospray ionization-quadrupole/time-of-flight mass spectrometer (UPLC-Q-TOF MS). Compounds were analyzed on Acquity UPLCTMBEH C18 (2.1 mm×150 mm×1.7 μm) with acetonitrile (A)-0.1% formic acid aqueous solution (B) as mobile phase for gradient elution. The data were collected by negative electrospray ion mode using Q-TOF MS. The parameters of ion source were as follows: capillary voltage of 2 500 V, cracking voltage of 60-70 V, ion source temperature of 300 ℃, dry nitrogen flow rate of 800 L/h. Under this condition, all of 17 saponins were separated neatly within 1 h. The fragmentation behaviors especially the MS fragmentation rules of isomers were compared. According to the structure and the typical fragmentations, these saponins were divided into different typical types, and each type has its special fragments that can be easily identified. Meanwhile, the identification and structure of the 17 ginsenoside could provide essential and important data for the further studies on the multiple constitutions ofPanaxnotoginsengas well as ginseng which also has the same or some similar constitutions. These findings are valuable for the identification of ginsenosides in plants especiallyPanaxnotoginseng.

ultra perform liquid chromatogram-electrospray ionization-quadrupole/time-of-flight mass spectrometer (UPLC-Q-TOF MS); ginsenosides; fragmentation pathway;Panaxnotoginseng

2016-03-04;

2016-03-27

趙 靜(1989—)，女(漢族)，河北人，碩士研究生，從事中藥新藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: zhaojing.0301@163.com

劉 勇(1964—)，男(漢族)，浙江人，教授，從事藥用植物親緣學(xué)、中藥質(zhì)量與開發(fā)。E-mail: yliu0126@aliyun.com

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0097-12

10.7538/zpxb.2017.38.01.0097