不同益生菌發(fā)酵中草藥對鯉魚生長性能及抗感染能力的研究

趙 倩，陳玉春，高緒娜，郭婷婷，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

水產(chǎn)養(yǎng)殖

不同益生菌發(fā)酵中草藥對鯉魚生長性能及抗感染能力的研究

趙 倩，陳玉春，高緒娜，郭婷婷，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

為研究不同益生菌發(fā)酵中草藥對鯉魚生長性能及抗感染能力的影響，本試驗選用初始體重為（11.0±1.0）g的鯉魚450尾，隨機分為5組，每組30尾，設(shè)3個重復(fù)。Ⅰ組為對照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；Ⅱ組為中草藥復(fù)方組；Ⅲ組為產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵中草藥組；Ⅳ組為枯草芽孢桿菌發(fā)酵中草藥組；Ⅴ組為鼠李糖乳桿菌發(fā)酵中草藥組。養(yǎng)殖56 d后，測定其生長指標(biāo)，并腹腔注射嗜水氣單胞菌進行感染試驗，統(tǒng)計死亡率。同時采用硫酸-苯酚法測定中草藥發(fā)酵前后多糖含量。結(jié)果表明：（1）與Ⅰ組相比，Ⅲ組、Ⅳ組增重率分別提高22.55%、14.29%（P＜0.05），特定生長率分別提高13.53%、8.8%（P＜0.05），飼料系數(shù)分別降低22.48%、14.59%（P＜0.05），肥滿度分別提高13.53%、9.1%（P＜0.05），腎臟指數(shù)分別提高12.24%、12.24%（P＜0.05）；（2）Ⅲ組脾臟指數(shù)較Ⅰ組提高16.51%（P＜0.05），各組間肝臟指數(shù)、存活率差異均不顯著（P＞0.05）；（3）Ⅳ組死亡率分別較Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組降低56.41%、54.05%、45.16%、45.16%（P＜0.05），Ⅲ組、Ⅴ組死亡率較Ⅰ組、Ⅱ組分別降低20.51%、16.21%（P＜0.05）；（4）發(fā)酵48 h后，Ⅲ組、Ⅳ組多糖含量分別比對照組增加71.88%、46.09%（P＜0.05），分別比Ⅴ組增加78.99%、52.12%（P＜0.05）。由此可見，發(fā)酵中草藥的最佳菌株為枯草芽孢桿菌，發(fā)酵中草藥多糖含量顯著增加，且提高了鯉魚的生長性能及抗感染能力。

發(fā)酵中草藥；多糖含量；鯉魚；生長性能；抗感染

中草藥和益生菌制劑作為飼料添加劑，具有純天然、無毒害、無藥殘、安全方便、功能全面等優(yōu)點，已成為國內(nèi)外研究的熱點。中草藥富含多糖、生物堿、甙類、有機酸、揮發(fā)油等活性物質(zhì)，因此在促進生長，改善魚體品質(zhì)，提高非特異性免疫力和飼料利用率，抵抗病原菌感染等方面均有良好效果（李霞，2011;冷向軍，2008）。益生菌制劑可以提高生產(chǎn)性能、維持腸道菌群平衡、增強免疫力和防治疾?。ㄓ谏彽龋?012）。中草藥益生菌發(fā)酵制劑是中草藥和益生菌兩者的結(jié)合，具有促進動物生長發(fā)育、降低飼料系數(shù)、增強藥效和降低飼養(yǎng)成本等作用（蘭時樂等，2010）。

本試驗旨在研究不同益生菌發(fā)酵對中草藥復(fù)方多糖含量的變化，并探討發(fā)酵中草藥對鯉魚生長性能及對嗜水氣單胞菌抗感染能力的影響，為益生菌發(fā)酵中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗中草藥 黃芪、甘草、板藍根、枸杞等均購自泰安市漱玉平民大藥房。

1.1.2 試驗菌株 產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌由山東寶來利來生物工程股份有限公司菌種保藏中心提供；嗜水氣單胞菌由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 酵母菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%、酵母膏0.5%、蛋白胨1.0%、磷酸二氫鉀0.2%，pH自然。

芽孢菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、酵母膏0.5%，pH 7.0。

乳酸菌液體培養(yǎng)基（MRS）：葡萄糖2.0%、檸檬酸銨0.2%、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.5%、硫酸錳0.02%、硫酸鎂0.05%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、酵母膏0.5%、吐溫-80 0.1%，pH 6.0。

嗜水氣單胞菌液體培養(yǎng)基：蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化鈉0.5%，pH 7.4。

1.1.4 發(fā)酵液的制備 配制酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌液體培養(yǎng)基，斜面挑取3種菌株分別接種于液體培養(yǎng)基中活化，制備新鮮的種子液，采用平板法進行活菌計數(shù)后，于4℃冷藏備用。

稱取中草藥復(fù)方5 g，置于含50 mL蒸餾水的250 mL三角瓶中，121℃滅菌30 min，冷卻至室溫。將3種菌液用冷凍離心機4℃、4000 r/min離心10 min，棄去上清，用滅菌生理鹽水洗滌三次，洗滌后的菌泥用一定比例生理鹽水稀釋后接種至中草藥復(fù)方中（2%接種量，活菌數(shù)為1×108cfu/mL），37℃振蕩發(fā)酵24 h。每組3個平行，分4個組，分別為中草藥復(fù)方組、產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵組、枯草芽孢桿菌發(fā)酵組、鼠李糖乳桿菌發(fā)酵組，依次設(shè)為1、2、3、4組。

1.1.5 發(fā)酵中草藥餌料的制作 將中草藥復(fù)方藥液、產(chǎn)朊假絲酵母中草藥發(fā)酵液、枯草芽孢桿菌中草藥發(fā)酵液、鼠李糖乳桿菌中草藥發(fā)酵液，按0.2%的藥量分別添加到鯉魚基礎(chǔ)日糧中，基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。用小型飼料機制備顆粒飼料，飼料粒徑為1.5 mm。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）%

1.2 試驗動物飼養(yǎng) 試驗用鯉魚購自泰安溫泉魚苗廠，選取健康、初始均重為（11.0±1.0）g的鯉魚450尾，隨機分為5組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾魚，預(yù)飼14 d。Ⅰ組為對照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；Ⅱ組為中草藥復(fù)方組；Ⅲ組為產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵中草藥組；Ⅳ組為枯草芽孢桿菌發(fā)酵中草藥組；Ⅴ組為鼠李糖乳桿菌發(fā)酵中草藥組。試驗用鯉魚飼養(yǎng)于室內(nèi)玻璃水族箱（1 m×0.6 m×0.5 m）中，有效水體積220 L。將充分曝氣除氯自來水作為循環(huán)水源，水溫控制在（24±1）℃，24 h持續(xù)充氧；日投喂量為每組魚總重的1.5%，早、中、晚定時投喂。試驗周期為8周。

1.3 多糖含量測定方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精確稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.30 mg，加蒸餾水定容至100 mL，搖勻，即得0.103 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備 取4組3個平行的12個樣品，每個樣品含中草藥5000 mg（M），水50 mL（V1），4000 r/min離心10 min，吸取上清1.0 mL （V2），分別置于10 mL具塞試管中，加入10 mL無水乙醇，4℃放置12 h沉淀多糖，4000 r/min離心10 min，棄去上清液，多糖用無水乙醇洗滌3次后，加水溶解，定容至50 mL（V3），搖勻，待測。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL，分別置于10 mL具塞試管中，加入蒸餾水至終體積為1.0 mL，然后各加入5%苯酚溶液1.0 mL，振蕩混勻，再加入5.0 mL濃硫酸，混勻后放置10 min，于40℃水浴中保溫15 min，取出后冷卻至室溫，在最大吸收波長490 nm處測定吸光度（A）。

1.3.4 樣品中多糖的測定 樣品溶液根據(jù)濃度摸索稀釋倍數(shù)（B）后，精確吸取1.0 mL（V4）置于10 mL具塞試管中，以下操作同1.3.3，依法測定吸光度，計算多糖含量。

式中：m為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得多糖含量，mg；M為試樣質(zhì)量，mg；V1為樣品制備時定容的體積，mL；V2為樣品處理時吸取體積，mL；V3為樣品處理時定容的體積，mL；V4為樣品測定時吸取的體積，mL；B為樣品溶液稀釋倍數(shù)。

1.4 樣品采集及指標(biāo)測定

1.4.1 樣品采集與制備 飼養(yǎng)試驗結(jié)束24 h后，統(tǒng)計每組存活尾數(shù)，稱量體重和測量體長。每個重復(fù)隨機取3尾，每組取9尾魚，剖開腹部，剝離出脾臟、腎臟、肝臟并稱重。

1.4.2 生長指標(biāo)的測定

增重率 （WGR）/%=[（末均重-初均重）/初均重]×100；

飼料系數(shù)（FCR）=攝食量/（終末總體重-初始總體重）；

肥滿度（CF）/%=（試驗?zāi)~體重/試驗?zāi)~體長3）×100；

特定生長率 （SGR）/%/d=100×（ln終末均重-ln初始均重）/養(yǎng)殖天數(shù)；

肝臟指數(shù)（HSI）/%=肝胰臟重/體重×100；

腎臟指數(shù)（RI）/%=腎臟重/體重×100；

脾臟指數(shù)（SI）/%=脾臟重/全魚重×100。

1.4.3 對嗜水氣單胞菌的抗感染能力試驗 飼喂試驗結(jié)束后采用嗜水氣單胞菌 （1×108cfu/mL）對試驗魚進行攻毒。每組3個平行，每個平行15尾魚，每尾腹腔注射0.1 mL嗜水氣單胞菌菌懸液。飼養(yǎng)觀察1周后，統(tǒng)計各組的死亡率。

死亡率/%=（死亡魚體尾數(shù)／試驗初魚體尾數(shù)）×100。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)作單因素方差分析 （ANOVA），若處理組間差異顯著，再用Duncan’s進行多重比較，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同益生菌發(fā)酵對中草藥復(fù)方多糖含量的影響 由表2可知，發(fā)酵24 h后，2、3組多糖含量比1組增加33.71%、12.69%（P＜0.05），比4組增加40.29%、18.22%（P＜0.05）；發(fā)酵48 h后，2、3組多糖含量比1組增加71.88%、46.09%（P＜0.05），較4組增加78.99%、52.12%（P＜0.05），2組較3組增加17.66%；發(fā)酵72 h后，2、3組多糖含量較1組增加67.13%、57.11%（P＜0.05），比4組增加86.79%、75.59%（P＜0.05）。

表2 不同益生菌發(fā)酵中草藥復(fù)方對多糖含量的影響 %

2.2 不同益生菌發(fā)酵中草藥復(fù)方對鯉魚生長指標(biāo)的影響 由表3可知，Ⅲ組、Ⅳ組增重率分別比Ⅰ組提高22.55%、14.29%（P＜0.05），比Ⅱ組提高21.55%、21.45%（P＜0.05），比Ⅴ組提高18.85%、10.84%（P＜0.05）；Ⅲ組、Ⅳ組飼料系數(shù)分別比Ⅰ組降低22.48%、14.59%（P＜0.05），比Ⅱ組降低21.56%、13.73%（P＜0.05），比Ⅴ組降低17.89%、10.30%（P＜0.05）；Ⅲ組、Ⅳ組特定生長率分別比Ⅰ組提高13.53%、8.8%（P＜0.05），比Ⅱ組提高12.86%、8.19%（P＜0.05），比Ⅴ組提高11.56%、6.93%（P＜0.05）；Ⅲ組、Ⅳ組肥滿度分別比Ⅰ組提高13.53%、9.1%（P＜0.05），比Ⅱ組提高16.97%、14.54%（P＜0.05），比Ⅴ組提高18.77%、16.31%（P＜0.05）；Ⅲ組脾臟指數(shù)比Ⅰ組提高16.51%（P＜0.05）；Ⅲ組、Ⅳ組腎臟指數(shù)分別比Ⅰ組提高12.24%、12.24%（P＜0.05）；各組間肝臟指數(shù)、存活率差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 不同益生菌發(fā)酵中草藥復(fù)方對鯉魚生長指標(biāo)的影響

2.4 不同添加量發(fā)酵中草藥對鯉魚抗感染能力的影響 由表4可知，鯉魚經(jīng)嗜水氣單胞菌感染，觀察一周，Ⅳ組死亡率分別比Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組降低了56.41%、54.05%、45.16%、45.16%（P＜0.05），Ⅲ組、Ⅴ組死亡率相同，比Ⅰ組、Ⅱ組分別降低了20.51%、16.21%（P＜0.05）。

表4 不同添加量發(fā)酵中草藥對鯉魚抗感染能力的影響

3 討論

3.1 不同益生菌發(fā)酵對中草藥復(fù)方多糖含量的影響 本試驗采用產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌分別發(fā)酵中草藥復(fù)方（黃芪、甘草、板藍根、枸杞等），檢測不同發(fā)酵時間多糖含量的變化，結(jié)果表明，產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵物多糖含量最高，發(fā)酵48 h可達15.59%，發(fā)酵72 h可達16.68%；其次是枯草芽孢桿菌發(fā)酵物多糖含量，發(fā)酵48 h可達13.25%，發(fā)酵72 h可達15.68%；鼠李糖乳桿菌發(fā)酵物多糖含量最低，發(fā)酵72 h只有8.93%。分析原因可能是產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵物本身富含多糖類物質(zhì)，如葡聚糖、甘露聚糖等；枯草芽孢桿菌生長代謝過程中可產(chǎn)生纖維素酶、果膠酶等活性酶，會破壞中草藥細胞壁，有利于多糖等活性物質(zhì)的析出；鼠李糖乳桿菌發(fā)酵過程會分解多糖產(chǎn)生乳酸等其他物質(zhì)而使其多糖含量降低。范作良等（2015）將丙冬甘寧中草藥方經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵52 h后，通過液相測定發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后甘草次酸、黃芩素含量升高，而甘草酸和黃芩苷含量降低。焦方文等（2016）采用硫酸-苯酚法測定3種益生菌發(fā)酵麥芽前后多糖的含量，結(jié)果表明，發(fā)酵前后多糖含量有顯著差異，但不同益生菌分解多糖的能力不同，短雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵后多糖含量分別為6.22%、0.71%，差異顯著。趙玉萍等（2005）在鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)基中加入黨參多糖能夠使鼠李糖乳桿菌明顯增殖，縮短發(fā)酵時間，提高其耐酸、耐膽堿鹽及耐高溫的能力。益生菌發(fā)酵可以改變中草藥的成分含量，但不同菌株發(fā)酵影響成分含量的變化不一致，因此提高或降低某種成分還需針對性的篩選菌株。

3.2 不同益生菌發(fā)酵中草藥對鯉魚生長性能的影響 本研究結(jié)果表明，在鯉魚日糧中添加0.2%產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌中草藥發(fā)酵物可以顯著提高鯉魚各項生長指標(biāo)及免疫器官指數(shù)，但中草藥復(fù)方組和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵組均無顯著效果。分析原因可能是中草藥復(fù)方組添加量小，無法達到較好的促生長效果；鼠李糖乳桿菌在飼料制粒和放置過程中，活菌數(shù)會顯著下降，無法達到調(diào)理腸道菌群、促進吸收從而影響生長的作用。譚娟等（2015）研究表明，不同濃度的魚腥草、金銀花等復(fù)方中草藥均能顯著提高草魚生長性能，并且添加3%和投喂30～60 d效果更佳。Gatesoupe等（1999）對大菱鲆仔魚和日本比目仔魚的研究表明，芽孢桿菌能提高仔魚的生長率。向梟等（2011）在基礎(chǔ)日糧中添加黃芪多糖可顯著提高齊口裂腹魚的增重率、特定生長率、飼料蛋白利用效率，最佳黃芪多糖添加水平為0.045%～0.074%。謝炎福等（2015）將益生菌發(fā)酵復(fù)方中草藥添加至黃河鯉飼料中，研究發(fā)現(xiàn)，0.3%添加量對黃河鯉具有明顯的促生長作用，并且可刺激黃河鯉非特異性免疫。中草藥、益生菌及多糖均有提高水產(chǎn)動物生長性能的作用，但添加量差別較大，中草藥發(fā)酵制劑添加量明顯低于中草藥制劑，且效果同樣顯著，其可能的原因是益生菌與中草藥的協(xié)同作用，既能提高多糖等有效成分，又能促進吸收增強藥效。

3.3 不同益生菌發(fā)酵中草藥對鯉魚抗感染能力的影響 本試驗用嗜水氣單胞菌攻毒，結(jié)果表明，發(fā)酵中草藥制劑可增強機體抗感染能力，顯著降低魚體死亡率，以添加枯草芽孢桿菌發(fā)酵中草藥組死亡率最低為37.78%；其次是產(chǎn)朊假絲酵母、鼠李糖乳桿菌發(fā)酵組死亡率為68.89%，均顯著低于對照組。Ramasamy等（2010）對攝食中草藥后的金魚，進行嗜水氣單胞菌攻毒試驗，結(jié)果顯示，中草藥組金魚的死亡率與對照組相比，降低了近3倍。程遠等（2014）研究飼料中添加枯草芽孢桿菌對吉富羅非魚幼魚免疫力和抗氧化功能的影響，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌組累計存活率顯著提高。表明中草藥和益生菌均可增強魚體的免疫保護率從而提高養(yǎng)殖的成活率，兩者協(xié)同作用，效果更佳。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，益生菌發(fā)酵可以改變中草藥有效成分；在鯉魚基礎(chǔ)日糧中添加益生菌發(fā)酵中草藥可顯著提高其生長性能及對嗜水氣單胞菌的抗感染能力，降低死亡率。并且以添加枯草芽孢桿菌發(fā)酵中草藥效果最顯著。

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The paper is to study the effects of different probiotics Fermented Chinese herb on growth performance and anti-infection ability in common carp.A total of 450 tail carp with initial weight of（11.0±1.0）g were randomly divided into 5 groups with 3 repetitions of 30 each.Group I was the control group，basal diet；group II was compound Chinese medicine group；group III was Candida utilis fermentation Chinese medicine group；group IV was Bacillus subtilis fermentation Chinese medicine group；and V group was Lactobacillus rhamnosus fermentation Chinese medicine group.After 56 days，the growth indexes were measured.The infection experiment was carried out by intraperitoneal injection of Aeromonas hydrophila，and calculated the death rate.The results showed that：（1）Compared with group I，the weight gain rate of group III and IV were increased by 22.55%and 14.29%（P＜0.05），specific growth rate increased by 13.53%and 8.8%（P＜0.05），feed coefficient decreased by 22.48%and 14.59%（P＜0.05），fatness increased by 13.53%and 9.1%（P＜0.05），and kidney index were increased by 12.24%and 12.24%respectively（P＜0.05）.（2）The spleen index of group III was increased by 16.51%（P＜0.05），and the difference of liver index and survival rate among the groups was no significant difference（P＞0.05）.（3）Compared with group I，II，III and V，the mortality of group IV was decreased by 56.41%，54.05%，45.16%and 45.16%respectively（P＜0.05）.Compared with group I and II，the mortality of group III and group V were decreased by 20.51%and 16.21%（P＜0.05）.（4）After fermentation for 48 h，Candida utilis and Bacillus subtilis Fermented Chinese herbal can significantly increase the content of polysaccharide.The content of polysaccharide of those were increased by 71.88%and 46.09%more than the control group（P＜0.05），and increased by 78.99%and 52.12%more than Lactobacillus rhamnosus fermentation group（P＜0.05）.Therefore，the optimal bacterial strain for fermentation of traditional Chinese medicine was Bacillus subtilis.The content of polysaccharide in fermented Chinese herbal medicine was significantly increased；the growth performance and anti-infection ability of common carp were also increased.

fermented Chinese herb；polysaccharide content；common carp；growth performance；anti-infection

S963

A

1004-3314（2017）02-0035-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170209