心痛方對急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表達及心律失常的影響*

歐陽過范金茹周斐然陳 彤謝榮苑王建湘廖建萍

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

·研究報告·

心痛方對急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表達及心律失常的影響*

歐陽過1范金茹2△周斐然2陳 彤2謝榮苑1王建湘2廖建萍2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

目的 通過觀察心痛方對急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表達及心律失常的影響，探討心痛方防治急性心肌梗死后心律失常的療效機制。方法 40只SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、心痛方組、硫氮 酮組。采用結(jié)扎法制備心肌梗死模型，運用RT-PCR法測定SERCA2a mRNA表達，結(jié)扎后心電圖檢測心律失常。結(jié)果 心痛方組能顯著增加SERCA2a mRNA表達（P＜0.05），降低心律失常發(fā)生率（P＜0.05）。結(jié)論 心痛方對急性心肌梗死大鼠具有保護作用，其作用機制可能與增加SERCA2a mRNA的表達，從而降低心律失常發(fā)生有關(guān)。

心痛方 急性心肌梗死 并發(fā)癥 鈣穩(wěn)態(tài) SERCA2a mRNA

最新報告，2014年中國急性心肌梗死死亡率：城市55.32/10萬，農(nóng)村68.60/10萬［1］，嚴(yán)重危害人類健康。其中，急性心肌梗死后發(fā)生的惡性心律失常是致死的重要并發(fā)癥之一［2］。因此，尋求能防治心肌梗死后心律失常的有效藥物，成為科研工作者面臨的重要課題。心痛方的前期臨床及實驗研究證實對冠心病療效確切，為進一步揭示其防治急性心肌梗死后心律失常的療效機制，本課題從鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)著手，對Ca2+通道相關(guān)基因SERCA2a mRNA進行了研究?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量200～250 g，鼠齡8~10周，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2011-003。

1.2 儀器與試劑 生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司，BL-420F）；動物人工呼吸機（浙江醫(yī)科大學(xué)儀器實驗廠，DH-140）；熒光定量PCR儀（廠家ABI，Step One Plus）；臺式高速冷凍離心機（Heal Force，Neofuge 15R）；PCR試劑盒、PCR引物 （武漢谷歌生物試劑有限公司提供）。

1.3 實驗藥物 心痛方中藥超微顆粒（柴胡、瓜蔞、川芎、桃仁、蒲黃、白芥子、郁金、九香蟲、甘草）購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，批號：681211。硫氮酮，湖南中達騖馬制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字號：H20065734。

1.4 分組與造模 SD大鼠40只按體質(zhì)量分層后，再按隨機表隨機分組，分為假手術(shù)組、模型組、心痛方組、硫氮 酮組，每組10只。以結(jié)扎冠狀動脈前降支建立大鼠急性心肌梗死模型［3-4］。穿線或結(jié)扎后即刻記錄心電圖，以左室前壁呈紫紺或Ⅱ?qū)?lián)S-T段弓背向上抬高大于0.1 mV并持續(xù)0.5 h以上，并于結(jié)扎點下心肌顏色改變?yōu)榻Y(jié)扎成功標(biāo)志（S-T段無改變者淘汰）。假手術(shù)組僅開胸，不結(jié)扎。40只大鼠，手術(shù)中模型組死亡1只，造模后用藥前假手術(shù)組、硫氮 酮組、心痛方組各死亡1只，每組納入實驗大鼠為9只。造模用藥后假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)心律失常及死亡；模型組7只發(fā)生心律失常（其中5例室性早搏，1例室速，1例室顫），3只大鼠死亡；硫氮 酮組6只發(fā)生心律失常（其中2例室性早搏，2例房性心律失常，1例傳導(dǎo)阻滯，1例室速），2只大鼠死亡；心痛方組1只發(fā)生心律失常 （室速），1只大鼠死亡，其中死亡大鼠均發(fā)生了心律失常。1.5 給藥方法 手術(shù)后給藥7 d（前3 d給藥同時予青霉素鈉肌注抗感染），均采用灌胃法給藥，以60 kg人為標(biāo)準(zhǔn)，參照劑量－體表面積換算方法計算大鼠給藥量，藥物劑量按大鼠1 mL/100 g灌胃容量配制，心痛方組采用中藥超微顆粒沖調(diào)成湯劑，濃縮后以1.08 g/kg的劑量給藥，硫氮 酮組以2.61 mg/kg的劑量配好藥液灌胃，模型組和假手術(shù)組均予以等量生理鹽水灌服，每天1次，連續(xù)7 d，于第7天灌胃30 min后處死大鼠。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）RT-PCR法測定SERCA2a mRNA表達。取左心室心?。ńY(jié)扎缺血及壞死區(qū)域）約50 mg，將其剪碎，放入1 mL的Trizo液中，用1‰DEPC水浸泡過的電動勻漿器勻漿，Trizo法提取RNA，參考AMV逆轉(zhuǎn)錄酶說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)基因庫基因序列，以Primer5軟件進行設(shè)計SERCA2a mRNA和β-actin引物：SERCA2a引物，上游5′-AGATAGCGGG CATACTG-3′，下游5′-TCTATCGCCCGTATGAC-3′，擴增片段長592 bps；β-actin引物，上游5′-CACTATC GGCAATGAGCG-3′，下游5′-GTGATAGCCGTTACTC GC-3′，擴增片段長223 bps。通過凝膠圖像分析儀實行吸光度掃描來觀察條帶的灰度強弱，SERCA2a mRNA吸光度值同GAPDH吸光度的比值來表示結(jié)果。2）大鼠心律失常、死亡的觀察。觀察大鼠心律失常、死亡的發(fā)生：常規(guī)記錄在第1次在造模（或假手術(shù)）成功后給藥前；第2次在給藥后第7天，大鼠處死前。并根據(jù)實際情況隨時記錄。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。所有實驗數(shù)據(jù)以（）表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，率的比較采用χ2檢驗，兩者相關(guān)關(guān)系分析采用秩相關(guān)Kendall法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心痛方對急性心肌梗死大鼠心肌內(nèi) SERCA2a mRNA表達的影響 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組、硫氮 酮組、心痛方組ERCA2a mRNA表達均減少（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，硫氮 酮組、心痛方組ERCA2a mRNA表達增加（P＜0.01），與硫氮 酮組比較，心痛方組ERCA2a mRNA表達增高（P＜0.05）。30只大鼠SERCA2a mRNA PCR擴增曲線見圖1。

表1 心痛方對大鼠急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表達的影響（）

表1 心痛方對大鼠急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表達的影響（）

與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與硫氮 酮組比較，#P＜0.05。下同。

組別 n SERCA2a mRNA假手術(shù)組 9模型組 6硫氮酮組 7 1.56±0.23 0.69±0.14△△1.07±0.16△△**心痛方組 81.32±0.17△**#

圖1 各組大鼠SERCA2a mRNA PCR擴增曲線

2.2 心痛方對急性心肌梗死大鼠并發(fā)心律失常、死亡的影響 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組及硫氮 酮組心律失常發(fā)生率明顯增高（P＜0.01），心痛方組心律失常發(fā)生率無明顯差異（P＞0.05）。與模型組比較，心痛方組心律失常發(fā)生率明顯降低（P＜0.05），硫氮 酮組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與硫氮 酮組比較，心痛方組心律失常發(fā)生率明顯降低（P＜0.05）。各組死亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 心痛方對大鼠急性心肌梗死大鼠并發(fā)死亡、心律失常的影響n（%）

2.3 急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表達與心律失常相關(guān)性分析 未發(fā)生心律失常大鼠SERCA2a mRNA基因表達為（1.37±0.28）高于心律失常組的（0.79± 0.20）（P＜0.05），心律失常與SERCA2a mRNA基因表達呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。

3 討 論

冠心病屬中醫(yī)“胸痹心痛”范疇，病機為本虛標(biāo)實，虛實夾雜。急性心肌梗死時以邪盛標(biāo)實（痰瘀）為主，后期發(fā)展多因?qū)嵵绿?，虛實夾雜，痰飲瘀血交阻常常引發(fā)心悸。研究發(fā)現(xiàn)［5-7］，中藥能有效防治急性心肌梗死后心律失常發(fā)生。

心律失常是急性心肌梗死常見的并發(fā)癥之一［8-9］，具有較高的死亡率。研究提示，其發(fā)病的過程可能是鈣穩(wěn)態(tài)失衡，Na2+-Ca2+交換誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生動作電位，從而引起心臟的異常電信號傳導(dǎo)或收縮［10］。心肌Ca2+濃度增加可能是急性心肌缺血早期室性心律失常的主要機制［11］。SERCA是心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶，主要保持細胞內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)定，當(dāng)SERCA2a表達增強時，鈣超載減少，因而對心肌具有明顯的保護作用［12］。本研究提示，大鼠心肌梗死后發(fā)生了SERCA2a活性變化，硫氮 酮組及心痛方組可增加SERCA2a活性。心律失常組大鼠SERCA2a mRNA表達明顯低于未發(fā)生心律失常組，提示心律失常發(fā)生與SERCA2a活性密切相關(guān)，兩者關(guān)系呈負(fù)直線相關(guān)。此外，與模型組比較，心痛方組能減少大鼠心律失常發(fā)生率。綜上可知，心痛方組能通過增加SERCA2a活性，從而減少心律失常發(fā)生。

心痛方是臨床上治療不穩(wěn)定型心絞痛的有效驗方，臨床療效確切，前期動物實驗從炎癥反應(yīng)通路證實心痛方能縮小大鼠心肌梗死面積，抑制PLT-WBC相互反應(yīng)，從而對受損心肌有保護作用［13-15］。方中以柴胡、栝蔞為君藥，柴胡遵“木郁達之”之旨，疏肝解郁，栝蔞清熱化痰，寬胸散結(jié)，二藥相合，一以治肝兼治痰瘀，一以治痰散結(jié)兼以疏肝，共奏肝心并治之功；川芎、桃仁、蒲黃為臣，川芎搜肝氣、補肝血、潤肝燥；桃仁活血，生血，緩肝也；蒲黃導(dǎo)瘀結(jié)而治氣血凝滯之痛，三者并用活血化瘀通絡(luò)止痛；白芥子、郁金為佐藥輔佐君藥及臣藥，白芥子能利氣豁痰、除寒暖中，郁金能行氣解郁、泄血破瘀；九香蟲為使藥，一者取其引經(jīng)搜剔之功，二者取其活血不礙脾胃之妙；甘草調(diào)和諸藥。全方共奏理氣化瘀、豁痰通絡(luò)止痛之功效。綜上所述，心痛方的疏肝豁痰祛瘀法可能改變了心肌梗死后冠脈的微環(huán)境，通過提高SERCA2a活性，調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)，從而降低心肌梗死后心律失常發(fā)生，減少死亡。

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Effect of Xintongfang on the Expression of SERCA2a mRNA and Arrhythmia in Acute Myocardial Infarction Rats

OUYANG Guo，F(xiàn)AN Jinru，ZHOU Feiran，et al.
Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China.

Objective：To observe the effect of Xintongfang on the expression of SERCA2a mRNA and arrhythmia in acute myocardial infarction rats to explore the therapeutic mechanism of Xintongfang on arrhythmia after acute myocardial infarction.Methods：40 SD rats were randomly divided into sham operation group，model group，Xintongfang group and diltiazem control group.Acute myocardial infarction model was established by coronary artery ligation method.Expression of SERCA2a mRNA was observed by RT-PCR method and arrhythmia was detected by ECG.Results：The expression of SERCA2a mRNA was obviously increased in Xintongfang group（P＜0.05）；and also the incidence of arrhythmia was decreased（P＜0.05）.Conclusion：Xintongfang has a protective effect on acute myocardial infarction in rats.The mechanism of the effect may be related to its increasing of expression of SERCA2a mRNA in rat，which can help decrease the incidence of arrhythmia.

Xintongfang；Acute myocardial infarction；Complication；Calcium homeostasis；SERCA2a mRNA

R285.5

A

1004-745X（2017）01-0030-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.01.009

2016-10-17）

湖南省自然科學(xué)基金項目（13jj5031）；湖南省教育廳科學(xué)研究項目（16A159）

△通信作者（電子郵箱：fanjr218@sina.com）