耐輻射異常球菌σ因子Sig2高溫脅迫的功能分析

田 燁, 王 琳,2, 周正富, 張 維, 陳 明*

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081; 2.西北大學(xué), 西安 710127

耐輻射異常球菌σ因子Sig2高溫脅迫的功能分析

田 燁1, 王 琳1,2, 周正富1, 張 維1, 陳 明1*

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081; 2.西北大學(xué), 西安 710127

σ因子是原核生物RNA聚合酶的一個亞基，能可逆地結(jié)合于RNA聚合酶核心酶的活性催化位點，促進(jìn)RNA聚合酶正確識別轉(zhuǎn)錄起始位點，特異地激活相應(yīng)基因的表達(dá)。耐輻射異常球菌具有極強的抗極端輻射氧化和高溫的能力及環(huán)境適應(yīng)性，它含有3個σ因子，其中Sig2可能在該菌環(huán)境適應(yīng)性上發(fā)揮著重要作用。構(gòu)建了耐輻射異常球菌sig2基因的缺失突變株Δsig2，通過48℃高溫脅迫沖擊實驗發(fā)現(xiàn)Δsig2對熱具有極強的敏感性，相對于對照菌株DR野生型生存能力明顯下降；實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，sig2基因的缺失導(dǎo)致熱脅迫相關(guān)基因發(fā)生不同程度的上調(diào)或下調(diào)，從而推測sig2基因參與了熱脅迫反應(yīng)的調(diào)控。

耐輻射異常球菌；σ因子；Sig2；高溫脅迫

DNA分子是自然界生物細(xì)胞遺傳信息的載體，RNA聚合酶調(diào)控DNA到RNA的轉(zhuǎn)錄是這些基因的主要表達(dá)調(diào)控形式。RNA聚合酶由多個蛋白亞基構(gòu)成，含有若干具有一定差異的多肽，其中就包括σ因子。σ因子可以辨別轉(zhuǎn)錄起始的位點，從而使RNA聚合酶準(zhǔn)確結(jié)合在啟動子的核心部位，起始轉(zhuǎn)錄。多數(shù)σ因子屬于σ70家族，此同源家族的基因序列中含有4個同源區(qū)域(區(qū)域1、區(qū)域2、區(qū)域3和區(qū)域4)。σ因子可以被多數(shù)激活子和抑制子調(diào)控，在基因的轉(zhuǎn)錄中具有重要作用。

細(xì)菌中大部分σ因子都具有相似的序列，因此不同細(xì)菌σ因子具有一定的同源性[1]。大部分原核生物的初級σ因子在功能上具有同源性，它們可以和功能相似的啟動子結(jié)合并發(fā)揮作用?？莶菅挎邨U菌的σ43和大腸桿菌的σ70在功能上可以分別替換對方的σ因子來與彼此的核心酶結(jié)合而行使各自相應(yīng)的識別功能。不同σ因子分子量大小差異很大，細(xì)菌初級σ因子一般分子量較大，可達(dá)到80～90，而次級σ因子則僅為初級σ因子的一半甚至更小。盡管分子量差異巨大，但序列同源性仍達(dá)到20%以上。

耐輻射異常球菌(Deinococcusradiodurans)是地球上已發(fā)現(xiàn)的最具輻射抗性的微生物[2,3]，于1956年被Anderson在輻射滅菌過的腌制牛肉罐頭中發(fā)現(xiàn)并分離[4]。由于其對干燥、寒冷、高溫和低溫等極端環(huán)境極強的適應(yīng)性[5,6]，以及在電離輻射、UV輻射、過氧化氫等多種DNA損傷劑條件下表現(xiàn)出的極強抗性[7]。作為科學(xué)家研究細(xì)菌抗逆性和DNA修復(fù)的模式菌株[8]，耐輻射異常球菌成為生物、環(huán)境和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點[7]。

根據(jù)DeinococcusradioduransR1全基因組基因注釋，R1中存在3個σ因子，分別為Sig1(DR_0180)、Sig2(DR_0804)和SigA(DR_0916)。SigA是細(xì)胞生長必需的σ因子，在細(xì)胞生長中幫助多數(shù)RNA的合成，決定細(xì)胞的死亡；Sig1預(yù)測為ECF亞家族σ因子，屬于σ70亞家族4；而Sig2僅預(yù)測為RNA聚合酶σ因子，具體生理功能未知，且與其他的σ因子并無直接同源性。已有的研究顯示，在熱激脅迫條件下，突變株Δsig2存活率比D.radioduransR1野生型下降了一個數(shù)量級；sig2的缺失導(dǎo)致菌株熱保護(hù)基因(dnaKJ)誘導(dǎo)表達(dá)水平明顯降低[9]。為進(jìn)一步研究sig2參與高溫脅迫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，本研究通過融合PCR技術(shù)和體內(nèi)基因重組方法，構(gòu)建了sig2缺失突變株，并利用高溫脅迫沖擊實驗、熒光實時定量(QRT-PCR)技術(shù)，對D.radioduransR1sig2的功能及其參與高溫脅迫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了分析和探討，以期為極端抗脅迫基因資源的挖掘提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、質(zhì)粒和試劑

供試菌株和質(zhì)粒見表1。耐輻射異常球菌于TGY培養(yǎng)基(蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖1 g，蒸餾水1 000 mL)中30℃培養(yǎng)；大腸桿菌于LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL)中37℃培養(yǎng)；突變株Δsig2于含有10 μg/mL卡那霉素(Km)的TGY培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)。

本實驗用到的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒來自北京天根科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒來自O(shè)mega Biotech公司；限制性內(nèi)切酶、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒來自NEB公司。本實驗所用引物均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)公司合成。

表1 菌株與質(zhì)粒

1.2 突變株Δsig2的構(gòu)建與驗證

根據(jù)NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫的D.radioduransR1的sig2基因(DR_0804)序列及其上下游基因序列，設(shè)計敲除目的基因sig2的同源片段引物，并根據(jù)pKatAPH3載體中卡那抗性表達(dá)盒序列設(shè)計替換掉目的基因sig2的卡那抗性盒引物。突變株Δsig2構(gòu)建引物及驗證引物見表2。

本研究根據(jù)基因在體內(nèi)的線性重組，通過在基因中插入卡那霉素抗性基因，替換掉待敲除目的基因sig2，構(gòu)建sig2功能缺失突變株。以D.radioduransR1野生型基因組為模板，用U-Sig2-F/R和D-Sig2-F/R分別擴(kuò)增sig2基因上下游基因片段sig2-U(665 bp)和sig2-D(518 bp),以pKatAPH3為模板，用Km-Sig2-F/R擴(kuò)增Km抗性基因片段Km(970 bp)。PCR反應(yīng)體系(30 μL)為：5×PrimeSTAR Buffer 6 μL，dNTPs 3 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個循環(huán)；72℃ 10 min。

利用融合PCR技術(shù)將sig2-U、sig2-D和Km進(jìn)行融合擴(kuò)增，構(gòu)建融合片段USig2-Km-DSig2。PCR反應(yīng)體系(20 μL)為：5×PrimeSTAR Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，上下游引物(U-Sig2-F，D-Sig2-R)各0.5 μL，模板DNA(sig2-U、sig2-D和Km)各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃ 5 min；94℃ 1 min，62℃ 1 min，72℃ 5 min，17 個循環(huán)；94℃ 1 min，62℃ 1 min，72℃ 2 min，30 個循環(huán)；72℃ 10 min。

將回收并純化的融合片段與pJET載體連接，熱激轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Trans109，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切回收并測序驗證。將已驗證的酶切片段通過體內(nèi)同源重組方法線性轉(zhuǎn)化到D.radioduransR1野生型中，經(jīng)過不同濃度卡那霉素抗性平板篩選，獲得突變株Δsig2。以Δsig2基因組為模板，用3SY-sig2-F/R擴(kuò)增USig2-Km-DSig2全長，用3SY-Sig2-F和YZ-Km-R、YZ-Km-F和3XY-Sig2-R分別擴(kuò)增USig2-Km片段和Km-DSig2片段，用YZ-Km-F/R擴(kuò)增Km抗性盒，用YZ-Sig2-F/R擴(kuò)增sig2基因缺失片段，對突變株Δsig2進(jìn)行進(jìn)一步篩選驗證，最終獲得完全突變株Δsig2。

1.3 正常培養(yǎng)條件下生長曲線的測定

將D.radioduransR1野生型和突變株Δsig2分別劃線活化，挑取單菌落接種到4～5 mL TGY液體培養(yǎng)基中(Δsig2添加10 μg/mL Km抗生素)，30℃ 200 r/min震蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期作為種子液。將種子液按起始OD600≈0.1分別轉(zhuǎn)接于50 mL新鮮的TGY液體培養(yǎng)基中，每個菌株設(shè)3個重復(fù)，于30℃ 200 r/min震蕩培養(yǎng)，期間每隔6 h取樣一次，測定樣品OD600值，連續(xù)測定至細(xì)菌生長穩(wěn)定后期(約48 h)。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制正常培養(yǎng)條件下的生長曲線。

1.4 48℃熱激對菌株的沖擊實驗

將D.radioduransR1野生型和突變株Δsig2分別劃線活化，挑取單菌落接種到4～5 mL TGY液體培養(yǎng)基中(Δsig2添加10 μg/mL Km抗生素)，30℃ 200 r/min震蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期作為種子液。將種子液按1%分別接種到50 mL新鮮TGY液體培養(yǎng)基中， 30℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600≈2左右，并將各菌液OD600調(diào)整基本一致，轉(zhuǎn)移至48℃ 200 r/min開始熱激培養(yǎng)，分別于0、2 h、4 h取樣，以1×PBS進(jìn)行倍比稀釋(10-1～10-6)，每個梯度取8～10 μL在無抗性的TGY固體平板上點樣，30℃培養(yǎng)2～3 d，觀察各菌株生長情況。

1.5 不同溫度下熱激相關(guān)基因在突變株Δsig2中的表達(dá)

將已活化的D.radioduransR1野生型和突變株Δsig2分別轉(zhuǎn)接至新鮮的TGY培養(yǎng)基中，30℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)至指數(shù)中期。將上述菌液置于30℃和48℃高溫沖擊1 h和3 h離心收集菌體。提取總RNA，消化后反轉(zhuǎn)為cDNA，利用QRT-PCR實時定量檢測分析Sig2對熱激脅迫相關(guān)基因表達(dá)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sig2結(jié)構(gòu)分析

sig2(DR_0804)基因位于耐輻射異常球菌的1號染色體(NC_001263.1)，Gene ID為1800294，堿基全長849 bp。該基因編碼282個氨基酸，預(yù)測蛋白Sig2分子量約為29.92 kDa。使用http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/網(wǎng)站在線預(yù)測Sig2蛋白的二級結(jié)構(gòu)，多以α螺旋和卷曲結(jié)構(gòu)存在(圖1A，彩圖見圖版三)。使用http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2網(wǎng)站對Sig2蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測，以CupriavidusmetalliduransCH34中CnrH蛋白(編號c4cxfA)為模版，三級結(jié)構(gòu)和ChrH蛋白單體結(jié)構(gòu)類似，與ECF亞家族蛋白極度相近(圖1B)。Sig2蛋白質(zhì)的親疏水性預(yù)測結(jié)果顯示，Sig2蛋白具有明顯的親水性，推測為親水性蛋白(圖1C)。

2.2 突變株Δsig2的構(gòu)建與驗證

本研究利用融合PCR技術(shù)和體內(nèi)基因重組技術(shù)將卡那霉素抗性基因替換sig2，分別擴(kuò)增得到sig2-U(665 bp)、Km(970 bp)和sig2-D(518 bp)片段，純化得到的片段進(jìn)行融合得到USig2-Km-DSig2，連接pJET載體，熱激轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞trans109，酶切篩選驗證。經(jīng)驗證后將酶切得到的融合片段通過體內(nèi)同源重組線性轉(zhuǎn)化到D.radioduransR1野生型中，在含卡那霉素(10 μg/mL)的平板篩選菌株，通過PCR擴(kuò)增和序列測定，結(jié)果表明獲得的菌株為sig2缺失突變株。

圖1 Sig2蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 Structure prediction of Sig2 protein.A. Sig2蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；B.Sig2(I)和ChrH(II)蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；C.Sig2蛋白質(zhì)的親水性(I)和疏水性(II)(彩圖見圖版三)

2.3 正常培養(yǎng)條件下sig2突變對細(xì)胞生長的影響

測定了突變株Δsig2在正常培養(yǎng)條件(TGY培養(yǎng)基，30℃ 200 r/min)下的生長曲線(圖2)，以D.radioduransR1野生型作為對照。結(jié)果顯示，將兩株菌在30℃ 200 r/min培養(yǎng)條件下連續(xù)培養(yǎng)48 h，生長量在不同時期沒有明顯差別，相對于D.radioduransR1野生型，sig2的突變幾乎對細(xì)胞生長沒有影響。

圖2 野生型R1與突變株Δsig2在TGY培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)條件下的生長曲線Fig.2 The growth curve of the wild type D. radiodurans and mutant Δsig2 under 30℃ temperature in TGY medium.

2.4 48℃熱激對突變株Δsig2的影響

為了研究sig2基因與熱激的相關(guān)性，測定了突變株Δsig2在48℃熱激2 h和4 h后的菌株生長情況，以D.radioduransR1野生型作為對照組(圖3,彩圖見圖版三)。結(jié)果顯示，48℃熱激2 h后，Δsig2的生長能力呈現(xiàn)出弱于野生型的表現(xiàn)，熱激4 h后，Δsig2的生長能力已經(jīng)明顯低于野生型，相差高達(dá)3個數(shù)量級，表明sig2在熱脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

2.5 突變株Δsig2在48℃熱激脅迫后相關(guān)基因的表達(dá)量

熱激反應(yīng)可以在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)相關(guān)熱激基因的快速表達(dá)[11]。因此，本研究選擇將菌株在正常溫度(30℃)和高溫(48℃)條件下各處理1 h和3 h誘導(dǎo)相關(guān)熱激基因的表達(dá)。

突變株Δsig2在不同溫度條件下處理1 h后熱激相關(guān)基因表達(dá)如圖4和圖5所示。結(jié)果顯示，在30℃培養(yǎng)條件下，相對于D.radioduransR1野生型，sig2基因的敲除導(dǎo)致D.radiodurans中的大部分熱激相關(guān)基因發(fā)生上調(diào)，其中dnaJ1、groEL

圖3 48℃熱激后野生型R1、突變株Δsig2的生長情況Fig.3 The growth of the wild type D. radiodurans and mutant Δsig2 after heat shock(48℃).(彩圖見圖版三)

和groES發(fā)生3倍以上的顯著上調(diào)；而DR_1314發(fā)生了至少5倍的顯著下調(diào)，dnaK和DR_0972幾乎未發(fā)生變化。經(jīng)過48℃熱激處理后，dnaJ1發(fā)生明顯下調(diào)，而dnaK、DR_0326和DR_0972發(fā)生不同程度上調(diào)，DR_1314、groEL和groES則變化不明顯。

在不同溫度下處理3 h后，突變株Δsig2中熱激相關(guān)基因的表達(dá)如圖6和圖7所示。結(jié)果顯示，30℃培養(yǎng)條件下，相對于D.radioduransR1野生型，dnaJ1、DR_0326和groES發(fā)生明顯上調(diào)，其中DR_0326相對于熱激1 h變化最為顯著，DR_1314下調(diào)明顯。經(jīng)過48℃熱激處理，DR_0326顯著上調(diào)達(dá)3倍，dnaJ1則下調(diào)1倍，其余相關(guān)基因則變化不明顯。

圖4 野生型R1與突變株Δsig2正常溫度培養(yǎng)1 h(30℃)熱激相關(guān)基因的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression level of genes involved heat shock response under normal temperature(30℃) of wild type R1 and mutant Δsig2 in 1 hour.

圖5 野生型R1與突變株Δsig2熱激1 h(48℃)熱激相關(guān)基因的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression level of genes involved heat shock response under heat stress (48℃)of wild type R1 and mutant Δsig2 in 1 hour.

圖6 野生型R1與突變株Δsig2正常溫度培養(yǎng)3 h(30℃)熱激相關(guān)基因的相對表達(dá)量Fig.6 Relative expression level of genes involved heat shock response under normal temperature(30℃)of wild type R1 and mutant Δsig2 in 3 hours.

圖7 野生型R1與突變株Δsig2熱激3 h(48℃)熱激相關(guān)基因的相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression level of genes involved heat shock response under heat stress (48℃)of wild type R1 and mutant Δsig2 in 3 hours.

對比不同處理時間的熱激基因表達(dá)情況。30℃處理1 h，Δsig2中dnaJ1、groEL、groES表達(dá)量快速上升，3 h后表達(dá)量則降低至少1倍以上；而DR_0326在30℃處理3 h的表達(dá)量則比處理1 h升高1倍。而48℃熱激處理時，dnaJ1在處理3 h的表達(dá)量比處理1 h升高一倍，而DR_0326則升高10倍以上，其余基因變化不明顯。

3 討論

對細(xì)菌而言，高溫是自然界中主要的逆境脅迫因素[11]。細(xì)胞處于高溫脅迫的環(huán)境下，其細(xì)胞膜流動性會降低，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的活性受到一定的影響，從而導(dǎo)致蛋白難以正確折疊，形成錯誤結(jié)構(gòu)[11～13]。因此基因組DNA的整體結(jié)構(gòu)也受到破壞，細(xì)胞新陳代謝受到影響[12,13]。耐輻射異常球菌應(yīng)答高溫脅迫的過程很復(fù)雜，是一個全面的全局性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并不能只靠單一的某個調(diào)控蛋白或是單獨某條代謝途徑發(fā)揮作用。多個調(diào)控蛋白和多條代謝途徑基因共同作用來保護(hù)細(xì)胞免受高溫脅迫的損傷，使得細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性，保證細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡和正常的生理代謝。本研究發(fā)現(xiàn)sig2的缺失使得耐輻射異常球菌對高溫脅迫的抗性明顯降低，推測sig2基因可能參與了高溫脅迫反應(yīng)的調(diào)控，與其他熱激相關(guān)基因共同合作，參與DNA的損傷修復(fù)過程，保護(hù)細(xì)胞對抗高溫環(huán)境。

在高溫脅迫條件下，D.radiodurans通常會快速誘導(dǎo)熱激相關(guān)基因(如dnaK/J，groES/L和DR_1314等)的表達(dá)，以達(dá)到保護(hù)自身免受損傷的目的。DnaK是Hsp70的分子伴侶，參與許多胞質(zhì)活動，例如蛋白分泌、新生肽鏈的折疊、錯誤折疊蛋白的矯正[14～20]。DnaK行駛分子伴侶的功能主要依靠其自身的ATP水解作用提供能量，同時需要DnaJ和GrpE的幫助。DnaJ是一種Hsp40分子伴侶蛋白，能夠和GrpE共同作用，通過緊密調(diào)節(jié)DnaK與核苷酸或者底物結(jié)合兩種狀態(tài)，促進(jìn)DnaK高溫脅迫相關(guān)的伴侶蛋白循環(huán)[21,22]。熱激相關(guān)伴侶蛋白GroES和GroEL在高溫脅迫下通常是共同作用來行使功能，幫助蛋白正確折疊[17,23]。DR_1314是一種熱激保護(hù)基因，能夠在高溫脅迫時使細(xì)胞免于受損[24]。本研究發(fā)現(xiàn)耐輻射異常球菌中sig2基因的缺失導(dǎo)致細(xì)胞對48℃高溫很敏感，生存能力明顯下降，同時熱激相關(guān)分子伴侶基因dnaKJ和groESL以及熱激保護(hù)基因DR_1314、DR_0972和DR_0326發(fā)生不同程度的顯著變化，相對于D.radioduransR1野生型，熱激脅迫條件下突變株Δsig2中dnaKJ幾乎沒有得到明顯的誘導(dǎo)表達(dá)，反而受到抑制，groESL的表達(dá)水平也較低，可見sig2對dnaKJ和groESL等熱激保護(hù)基因的誘導(dǎo)表達(dá)起重要作用，說明Sig2參與上述基因在高溫脅迫條件下的調(diào)控，但具體參與方式仍有待深入研究。

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Functional Analysis of Factor Sig2 Responding to High Temperature Stress ofDeinococcusradiodurans

TIAN Ye1, WANG Lin1,2, ZHOU Zhengfu1, ZHANG Wei1, CHEN Ming1*

1.BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China; 2.NorthwestUniversity,Xi’an710127,China

σ factor, a subunit of RNA polymerase in prokaryotes, can activate transcriptional initiation through a kind of reversible bind with the active catalytic sites of RNA polymerase core enzyme，promote the accurate identification of RNA polymerase to transcriptional initiation site and eventually activate the expression of corresponding genes specifically. With the strong capacity and environmental adaptability to radiation, oxidation and high temperature，Deinococcusradiodurans(D.radiodurans)contains three σ factors，among which Sig2 may function significantly in its strong environmental suitability. In this study，we developed thesig2 deletion mutant strain，namedΔsig2, results showed thatΔsig2 were more sensitive to heat and had significantly lower survivability than control groupD.radioduranswild type under the condition of high temperature(48℃)stress. We also analyzed the QRT-PCR results and verify that the deletion ofsig2 contributed to positive or negative regulation of heat stress related genes in a degree. As a result，we speculatedsig2 probably involved in the regulation of heat stress response.

Deinococcusradiodurans; σ factor; Sig2; high temperature stress

2016-09-20; 接受日期：2016-10-24

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08003-01B);國家自然科學(xué)基金項目(31370126;31570080)資助。

田燁，碩士研究生，主要從事微生物基因工程研究。E-mail：284840439@qq.com；*通信作者：陳明，研究員，主要從事微生物分子生物學(xué)研究。E-mail：chenming01@caas.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2017.01.11