羽毛降解菌的分離鑒定及角蛋白酶基因克隆

陳曉堂, 劉 超, 侯衍英, 張顯忠, 李艷玲, 郭東會, 史仁玖

泰山醫(yī)學(xué)院, 山東省中藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 泰安 271016

羽毛降解菌的分離鑒定及角蛋白酶基因克隆

陳曉堂, 劉 超, 侯衍英, 張顯忠, 李艷玲, 郭東會, 史仁玖*

泰山醫(yī)學(xué)院, 山東省中藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 泰安 271016

為了從廢棄羽毛堆積土壤中分離篩選具有高效降解羽毛角蛋白的細(xì)菌，采用形態(tài)學(xué)觀察、生化測定和16S rDNA序列分析鑒定菌株，測定蛋白水解研究酶活性及酶特性，鑒定該菌為假單胞菌屬的嗜麥芽窄食單胞菌，降解羽毛的最適發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30℃，最適pH 7.0，最適接種量1%，最適發(fā)酵時間48 h，羽毛含量在0.25～0.5 g/50mL時產(chǎn)酶酶活性最高且較穩(wěn)定,適合降解羽毛和頭發(fā)。嗜麥芽窄食單胞菌角蛋白酶的作用溫度和pH寬泛、穩(wěn)定性好，具有良好的開發(fā)價值和應(yīng)用前景。

嗜麥芽窄食單胞菌；角蛋白酶；羽毛降解；基因克隆

近幾年，我國家禽養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，羽毛占肉雞體重的5%～7%，年產(chǎn)量一百多萬噸，羽毛中粗蛋白含量高達(dá)80%，氨基酸達(dá)70%，具有很高的開發(fā)利用價值[1]。羽毛的主要成分是角蛋白質(zhì)，是一類結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不溶于水的硬性蛋白。目前，羽毛處理通常采用高溫高壓、強(qiáng)酸強(qiáng)堿和擠壓膨化等物理化學(xué)方法，工藝復(fù)雜、耗能多，易引起環(huán)境污染[2，3]。因此，如何高效、環(huán)保、低成本降解角蛋白是當(dāng)前面臨的一個重要的資源和環(huán)保問題。角蛋白酶是微生物誘導(dǎo)產(chǎn)生，破壞角蛋白二硫鍵并使其進(jìn)一步降解，是降解角蛋白的關(guān)鍵酶，反應(yīng)條件溫和、環(huán)保，篩選角蛋白降解菌及研究角蛋白酶是目前角蛋白降解的主要研究方向[4]。

目前，研究人員已分離到30多株能降解羽毛的微生物，包括細(xì)菌、真菌和放線菌[4,5]，但是多數(shù)羽毛降解菌降解羽毛效率不高，羽毛需要高溫高壓等處理，因此篩選能高效降解并且直接作用羽毛的微生物菌株具有重要意義。本研究從養(yǎng)雞場堆積腐爛羽毛的土壤中篩選分離了一株降解羽毛的菌株，通過菌株形態(tài)特征觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)測定和16S rDNA 分子鑒定法對該菌株進(jìn)行鑒定，探討其對羽毛的降解特性，并克隆了角蛋白酶基因序列，以期為進(jìn)一步研究角蛋白酶功能及應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

濟(jì)寧養(yǎng)雞場內(nèi)廢棄羽毛堆積處采土樣。家禽市場收集的雞羽毛，自來水洗凈，純水洗滌3次，60℃烘干至恒重。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母浸提膏5 g，NaCl 10 g，pH 7.0；富集培養(yǎng)基(g/L)：碎羽毛7.5 g，酵母浸提膏1 g，K2HPO41 g，MgCl20.1 g，pH 7.0；初篩培養(yǎng)基(g/L)：酪蛋白10 g，K2HPO41.4 g，KH2PO40.7 g，NaCl 0.5 g，MgSO40.1 g，瓊脂20 g，pH 7.0； 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 (g/L)：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH 7.2；羽毛培養(yǎng)基(g/L)：整根羽毛10 g，K2HPO41.4 g，KH2PO40.7 g，NaCl 0.5 g，MgSO40.1g，pH 7.0。

1.2 羽毛降解菌株的分離及篩選

①富集：5 g土樣加入20 mL ddH2O，震蕩靜止后取上清5 mL于200 mL富集培養(yǎng)基，30℃ 120 r/min培養(yǎng)48 h；②初篩：取100 μL上清液稀釋涂布于初篩培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，72 h后觀察，挑選透明圈較大的單菌落多次劃線純化，接斜面培養(yǎng)基保存?zhèn)溆?；③?fù)篩：菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37℃ 180 r/min，24 h。5%的接種量轉(zhuǎn)接至羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h，觀察羽毛降解情況。發(fā)酵液離心，上清液測定角蛋白酶活性和蛋白含量。

1.3 菌種鑒定方法

顯微鏡觀察，革蘭氏染色，生理生化試驗(yàn)參考細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[4]。

16S rDNA鑒定，挑取單菌于10 mL 液體培養(yǎng)基，30℃ 200 r/min培養(yǎng)24 h。提取DNA作為PCR擴(kuò)增模板，引物為細(xì)菌16S rDNA PCR，通用引物：27F： 5′-CGGCTACCTTGTTACGACT-3′，1502F：5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′。1%的瓊脂糖電泳，回收DNA，連接到載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化，華大基因公司測序，BLAST和DNAMAN軟件比對分析。

1.4 角蛋白酶活的測定方法

參照蔡成崗[4]測定角蛋白酶酶活方法，略有改動：4 mL發(fā)酵液，5 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，加2 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，10 mg的酪蛋白，50℃ 180 r/min反應(yīng)1 h，加2 mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，5 000 r/min離心10 min，上清液280 nm處測其吸光度?？瞻捉M在加入酪蛋白前先加2 mL 10%的三氯乙酸提前終止其反應(yīng)。1 酶活單位定義為：實(shí)驗(yàn)組對空白組每增加0.01吸光度所需要的酶量。

1.5 培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶活性的影響

1.5.1 不同接種量對產(chǎn)酶活性的影響 菌種接于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，選擇1%、2%、5%、8%、10%的接種量分別接種于50 mL羽毛培養(yǎng)基中，雞毛含量0.5 g/瓶，初始pH 7.0，37℃ 180 r/min，培養(yǎng)48 h。然后5 000 r/min 4℃離心10 min，取上清液，測定酶活性。

1.5.2 不同蛋白底物對產(chǎn)酶活性的影響 分別稱取0.5 g雞毛、頭發(fā)、脫脂牛奶和酪蛋白作為底物配制50 mL培養(yǎng)基，取24 h種齡的菌液1 mL接種，初始pH 7.0，37℃ 180 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)48 h，測定酶活性。

1.5.3 不同羽毛含量對產(chǎn)酶活性的影響 稱取0.05 g、0.25 g、0.5 g、0.75 g、1 g雞毛分別配制50 mL培養(yǎng)基，接種1 mL 24 h種齡的菌液，初始pH 7.0，37℃ 180 r/min，發(fā)酵48 h，測定酶活性。

1.5.4 不同初始pH對產(chǎn)酶活性的影響 分別調(diào)節(jié)50 mL培養(yǎng)基初始pH為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，雞毛含量0.5 g/瓶，接種1 mL 24 h種齡的菌液，37℃ 180 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)48 h，測定酶活性。

1.5.5 不同培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶活性的影響 培養(yǎng)溫度分別為18℃、23℃、28℃、30℃、33℃、37℃、40℃，雞毛含量0.5 g/瓶，接種1 mL 24 h種齡的菌液，初始pH 7.0，180 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)48 h，測定酶活性。

1.5.6 不同發(fā)酵培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶活性的影響

雞毛含量0.5 g/瓶，初始pH 7.0，接種1 mL 24 h種齡的菌液， 37℃ 180 r/min，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，測定酶活性。

1.6 角蛋白酶基因克隆

根據(jù)細(xì)菌DNA保守序列設(shè)計(jì)引物：P1：5′-GAACGAACATTTCATCTTGCT-3′，P2：5′-GGTCTGAGGAACAGCGTG-3′，CTAB法提取嗜麥芽窄食單胞菌DNA作模板，PCR擴(kuò)增基因序列：94℃，4 min；94℃ 75 s，52℃ 1 min，72℃ 2 min，32循環(huán)；72℃ 10 min。1%瓊脂糖電泳回收，連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化，華大基因公司測序，BLAST和DNAMAN軟件比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效降解羽毛菌株的分離

挑選出透明圈較大的單菌落進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)酵培養(yǎng)48 h后挑選羽毛降解情況較好的6支菌株(圖1)，菌株B降解羽毛速度最快且酶活性最高，羽毛發(fā)酵液中的降解蛋白質(zhì)量最高，表明菌株B降解羽毛角蛋白的能力最強(qiáng)(圖1)，且差異顯著(P<0.05)，因此選用菌株B進(jìn)行下一步的研究。

圖1 6支菌株發(fā)酵液中酶活性和蛋白含量的比較Fig.1 Comparison of enzyme activity and protein content in the fermentation broth of 6 strain.

2.2 菌種鑒定

菌株B革蘭氏染色呈陰性，菌落形態(tài)為圓形、白色、凸起，表面濕潤、粘稠、有光澤，邊緣無缺刻，顏色一致(圖2，彩圖見圖版三)。生化反應(yīng)見表1，初步鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)。

對該菌的16S rDNA序列進(jìn)行測序，核苷酸序列為1 405 bp，BLAST軟件比對分析，與Stenotrophomonasmaltophilia的相似性為99%，MEGA 6.0構(gòu)建以16S rDNA全序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖3) 與假單胞菌屬細(xì)菌聚成一族，與StenotrophomonasmaltophiliaCRR1-48相似性最高，結(jié)果表明該菌株為嗜麥芽窄食單胞菌，命名為StenotrophomonasmaltophiliaTSMC-99。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶活性的影響

2.3.1 接種量對產(chǎn)酶活性的影響 圖4表明嗜麥芽窄食單胞菌1%接種量產(chǎn)酶活性最高，隨著接種量的升高產(chǎn)酶活性下降并趨于穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異顯著(P<0.05)。這說明接種量影響菌的生長，進(jìn)一步影響細(xì)菌產(chǎn)酶的活性。

2.3.2 蛋白底物對產(chǎn)酶活性的影響 圖5表明羽毛為底物發(fā)酵培養(yǎng)的產(chǎn)酶活性最高，該酶是誘導(dǎo)酶，羽毛作為唯一的碳源和氮源時誘導(dǎo)產(chǎn)生角蛋白酶的活性最高。底物為頭發(fā)時產(chǎn)酶活性僅次于羽毛，而當(dāng)?shù)鞍椎孜餅槔业鞍缀兔撝Ｄ虝r產(chǎn)酶活性明顯降低，表明該細(xì)菌所產(chǎn)角蛋白酶適合降解羽毛和頭發(fā)，不同發(fā)酵底物差異顯著(P<0.05)。

2.3.3 羽毛含量對產(chǎn)酶活性的影響 由圖6可知羽毛含量在0.25～0.5 g/50mL時產(chǎn)酶酶活性最高且較穩(wěn)定，高于或低于這個區(qū)間范圍產(chǎn)酶活性均顯著降低，表明不同羽毛含量對酶活性影響差異顯著(P<0.05)。

圖2 菌株B形態(tài)圖Fig.2 Colony morphology of strain B.(彩圖見圖版三)

項(xiàng)目結(jié)果葡萄糖O/F試驗(yàn)+/+動力試驗(yàn)+氧化酶酶試驗(yàn)-賴氨酸脫羧酶+DNA酶試驗(yàn)+七葉苷試驗(yàn)+明膠液化試驗(yàn)+葡萄糖試驗(yàn)+乳糖試驗(yàn)+麥芽糖試驗(yàn)+蔗糖試驗(yàn)+葡萄糖酸鹽試驗(yàn)-

圖3 菌株TSMC-99的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain TSMC-99.

圖4 接種量對產(chǎn)酶活性的影響Fig.4 Effect of inoculation size on enzyme activity.注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

圖5 不同蛋白底物對產(chǎn)酶活性的影響Fig.5 Effects of different protein substrates on the activity of enzyme production.注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

圖6 不同羽毛含量對產(chǎn)酶活性的影響Fig.6 Effect of feather content on the activity of enzyme production.注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.3.4 初始pH對產(chǎn)酶活性的影響 圖7表明該菌在堿性發(fā)酵培養(yǎng)條件下具有較高產(chǎn)酶活性，在初始pH為7.0時產(chǎn)酶活性最高，但不同pH組別之間酶活性沒有顯著差異(P>0.05)。

2.3.5 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶活性的影響 如圖8，在室溫條件下該菌產(chǎn)酶活性較高，在30℃時產(chǎn)酶活性最高(圖8)，不同溫度培養(yǎng)的酶活性差異顯著(P<0.05)；23～37℃之間沒有顯著差異(P>0.05)，說明該菌為嗜溫型產(chǎn)酶菌株。很多菌降解羽毛都需要較高的溫度，這為工業(yè)化處理帶來困難，常溫條件高酶活性的菌株更適合大規(guī)模處理羽毛。

圖7 不同初始pH對產(chǎn)酶活性的影響Fig.7 Effect of different initial pH on the activity of enzyme production.注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

圖8 不同培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶活性的影響Fig.8 Effects of different culture temperatures on the activity of enzyme.注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶活性的影響 發(fā)酵48 h，菌產(chǎn)酶活性最高，發(fā)酵培養(yǎng)基中的雞羽毛全部被降解。隨著時間的增加，酶活逐漸降低(圖9)，不同培養(yǎng)培養(yǎng)時間的酶活性差異顯著(P<0.05)。

2.4 角蛋白酶基因克隆

PCR 擴(kuò)增獲得2 000 bp左右大小的基因片段(圖10)，測序獲得2 157 bp序列，ORF Finder分析其中包含1個1 743 bp的開放閱讀框，起始密碼ATG,終止密碼TGA。

基于角蛋白酶基因核酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖11)，基因序列與GenBank中來源嗜麥芽窄食單胞菌的角蛋白酶、膜外蛋白酶、類枯草桿菌蛋白酶、絲氨酸蛋白酶基因同源性高達(dá)93%、93%、89%、91%，該基因序列分析與菌種鑒定具有一致性，表明酶可能是一個胞外分泌酶，功能與角蛋白酶相似，確定該基因?yàn)榻堑鞍酌富颉?/p>

角蛋白酶核酸序列翻譯獲得1個570氨基酸的蛋白質(zhì)序列，NCBI Blast分析，推測角蛋白酶包含3個超家族結(jié)構(gòu)(圖12)：肽酶抑制劑超家族(Inhibitor_I9 superfamily)、肽酶(Peptidases-S8-S53superfamily)超家族和前肽C-末端超家族結(jié)構(gòu)(PPC superfamily)，推測蛋白功能可能與這3個家族相關(guān)。

3 討論

大量廢棄羽毛不合理處置會污染環(huán)境，生物降解是最合理的處理方式，角蛋白酶是生物降解羽毛的關(guān)鍵酶，目前羽毛角蛋白降解菌的研究主要集中在細(xì)菌、真菌和放線菌[6]。篩選的角蛋白降解細(xì)菌以芽胞桿菌為主, 如BacilluspseudofirmusAL-89[7]、B.licheniformisPWD-1[8]和Bacillussp. FK 46[9]。

圖9 不同發(fā)酵培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶活性的影響Fig.9 Effect of different fermentation time on enzyme activity.注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

圖10 PCR擴(kuò)增角蛋白酶基因基因電泳圖Fig.10 Amplification of KerF gene.M:DL5 000; G:角蛋白酶基因

圖11 基因同源性的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.11 Phylogenetic tree of keratinase gene.

圖12 嗜麥芽窄食單胞菌角蛋白酶結(jié)構(gòu)域Fig.12 The domain of the keratinase gene from Stenotrophomonas maltophilia.

本研究從養(yǎng)雞場廢棄羽毛的土壤中分離到1株高效降解羽毛的細(xì)菌，經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征研究和16S rDNA序列比對結(jié)果分析, 鑒定為嗜麥芽窄食假單胞菌，命名Microbacteriumsp. TSMC-99。嗜麥芽窄食假單胞菌是廣泛存在于自然環(huán)境中的好氧、革蘭氏陰性原核微生物，具有條件致病性，目前對S.maltophilia的生物學(xué)研究主要集中在其耐抗生素機(jī)制和分解有毒物質(zhì)、修復(fù)環(huán)境等功能[10]。

基于16S rDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析同源性，表明TSMC-99與假單胞菌屬細(xì)菌聚成一族。發(fā)酵條件對菌株所產(chǎn)酶有著不同影響，接種量、底物種類和含量、發(fā)酵pH、溫度和時間對酶活性有著不同的影響，最佳發(fā)酵接種量小、溫度低、pH[7～9]近中性的特性有利于工業(yè)化生產(chǎn)。篩選菌株酶活性達(dá)137.95U，與已篩選得到的菌株[7～9,11]相比，其他菌株酶活性多數(shù)集中在30～90 U，酶活性及降解能力較強(qiáng)，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用價值。

克隆得到該菌的角蛋白酶基因全長，與其他角蛋白酶基因最高相似度達(dá)93%[12～14]，表明本研究獲得的角蛋白酶基因具有不同的起源和催化能力，基因序列的差異也許和該菌的催化條件有密切關(guān)系，如平和的反應(yīng)條件，初始pH為7.0、30℃時產(chǎn)酶活性最高等?；蛉L的獲得為下一步構(gòu)建角蛋白酶高產(chǎn)工程菌做好了準(zhǔn)備，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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Isolation and Characterization of a Feather-degrading Bacterium and Cloning of Keratinase Gene

CHEN Xiaotang, LIU Chao, HOU Yanying, ZHANG Xianzhong, LI Yanling, GUO Donghui, SHI Renjiu*

ShandongProvinceKeyLaboratoryofBio-technologyofTraditionalChineseMedicine,TaishanMedicalUniversity,ShandongTaian271016,China

This study was aimed to isolate and characterize feather-degrading bacteria from soil of discarded feathers. Morphological observation, biochemical analysis and 16S rDNA sequence analysis were used for identifying bacteria, and the enzyme activity and enzyme properties was studied by mensurating protein hydrolysis. The strain was identified as genusPseudomonas,Stenotrophomonasmaltophilia. The optimal pH and temperature for growth were 7.0 and 30℃, optimal inoculum size is 1%, optimal fermentation time is 48 h. The enzyme activity was highest and stable when the feather content was 0.25～0.5 g/50mL. The keratinase gene was cloned which included complete sequence of 2 157 bp and a 1 734 bp open reading frame encoded 580 amino acids fromStenotrophomonasmaltophilia. Keratinase ofStenotrophomonasmaltophiliahas the potential for the application of feather keratin sources for the functional temperature and pH is broad and stable.

Stenotrophomonasmaltophilia; keratinase; feather-degrading; gene cloning

2016-07-31; 接受日期：2016-10-10

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015-247)資助。

陳曉堂,碩士研究生,研究方向?yàn)槲⑸锼幬?。E-mail:376416460@qq.com。*通信作者：史仁玖,教授,研究方向?yàn)槲⑸锱c生化藥學(xué)。E-mail:rjshi@tsmc.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2017.01.10