擬南芥質(zhì)體定位的葉酰谷氨酸合成酶基因在低氮條件下的功能分析

許博思, 孟紅巖, 張春義*, 姜 凌

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081; 2.福建省亞熱帶植物研究所, 福建 廈門 361006

擬南芥質(zhì)體定位的葉酰谷氨酸合成酶基因在低氮條件下的功能分析

許博思1, 孟紅巖2, 張春義1*, 姜 凌1

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081; 2.福建省亞熱帶植物研究所, 福建 廈門 361006

葉酰聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase, FPGS)在細(xì)胞的不同位置負(fù)責(zé)將多個(gè)谷氨酸殘基逐個(gè)加在單谷氨酸四氫葉酸(tetrahydrofolate, THF)的γ-羧基上，從而形成有活性的多尾形式四氫葉酸。AtDFB是定位在質(zhì)體中的FPGS，利用AtDFB基因的T-DNA插入突變體Atdfb-3，通過比較野生型擬南芥及突變體在不同氮源條件下的生長狀態(tài)以了解AtDFB基因的生物學(xué)功能。結(jié)果表明，低氮條件下AtDFB基因功能的缺失導(dǎo)致Atdfb-3突變體主根的急劇縮短，葉酸含量的明顯下降；而在Atdfb-3突變體中過表達(dá)AtDFB基因后，在低氮條件下的表型恢復(fù)至野生型擬南芥水平，并且葉酸含量有所提高。綜上所述，AtDFB基因在擬南芥葉酸合成代謝途徑中發(fā)揮著重要作用，可能影響低氮環(huán)境下植物主根的發(fā)育。

葉酸；AtDFB基因；低氮脅迫；發(fā)育；擬南芥

葉酸是四氫葉酸(tetrahydrofolate,THF)及其一系列衍生物的總稱，廣泛參與了核苷酸、氨基酸和泛酸的生物合成，是一碳單位的重要供體，在植物中還參與了木質(zhì)素的形成以及光呼吸作用[1]。人體葉酸攝入不足可能會(huì)導(dǎo)致出生缺陷、智力發(fā)育不完全和巨幼紅細(xì)胞貧血等疾病[2]。在植物體中，葉酸缺乏可以導(dǎo)致玉米木質(zhì)素代謝異常[3]、植物胚胎發(fā)育[4]和低氮脅迫反應(yīng)的異常[5]。

葉酸分子由喋啶、對氨基苯甲酸和多聚谷氨酸殘基組成[6]，其中蝶啶在胞質(zhì)中合成，對氨基苯甲酸在葉綠體中合成，而葉酰聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase, FPGS)負(fù)責(zé)將多個(gè)谷氨酸殘基逐個(gè)加在單谷氨酸四氫葉酸(tetrahydrofolate, THF)的γ-羧基上，由此形成多尾形式四氫葉酸。擬南芥的FPGS有AtDFB、AtDFC、AtDFD 3個(gè)同工酶，分別定位于質(zhì)體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，它們在各自的細(xì)胞器中行使功能。Mehrshahi等[7]對擬南芥FPGS的生理功能及多種亞細(xì)胞定位意義的進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，雖然Atdfb、Atdfc、Atdfd3種單突變體在營養(yǎng)生長時(shí)期與野生型擬南芥沒有明顯的表型差異，但葉酸的多聚谷氨酸狀態(tài)卻影響著整個(gè)生物體內(nèi)總?cè)~酸及多尾葉酸的穩(wěn)態(tài)。

擬南芥中AtDFB基因擁有2個(gè)不同長度的轉(zhuǎn)錄本，DFBCDS.1含有1 716個(gè)堿基，可翻譯為含有571個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)；DFBCDS.2含有1 542個(gè)堿基，可翻譯為含有513個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本之間相差174個(gè)堿基、58個(gè)氨基酸。Srivastava 等[8]發(fā)現(xiàn)Atdfb(fpgs1)主根明顯短于野生型。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，突變體根部生長素梯度分布發(fā)生了變化并導(dǎo)致根尖靜止中心(quescent center,QC)細(xì)胞的排列異常。此外，Atdfb分生區(qū)細(xì)胞的分裂及伸長區(qū)細(xì)胞的伸長都出現(xiàn)了障礙。該研究還發(fā)現(xiàn)，AtDFB功能的缺失影響了多尾葉酸的含量，尤其是在根部，進(jìn)而影響了處于代謝旺盛期的根尖細(xì)胞的一碳代謝及分生組織的維持和細(xì)胞伸長[8]。外源添加500 μmol/L 5-F-THF后，突變體根長及QC均恢復(fù)至正常水平。

本文以擬南芥突變體Atdfb-3為研究對象，首先了解不同氮源條件下AtDFB基因功能缺失對擬南芥鮮重和根長的影響，然后分別構(gòu)建了兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Atdfb-3，并對獲得的純合后代在不同氮源條件下的表型及葉酸含量進(jìn)行了分析，以期為深入研究AtDFB基因的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 Columbia野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana,WT)種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所作物基因組及遺傳改良研究室保存；AtDFB基因突變體種子Atdfb-3購自ABRC的SALK庫，編號SALK_015472 ；大腸桿菌DH5α及農(nóng)桿菌LBA4404由實(shí)驗(yàn)室保存；設(shè)計(jì)引物部分均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，測序反應(yīng)由北京博艾永華生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)所用的EasyTaqDNA Polymerase、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100 bp plus DNA Ladder)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNase I(RNase-free)購自TaKaRa公司；Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(PageRulerTM Prestained Protein Ladder) 購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；溴化乙錠(EB)、瓊脂糖購自Sigma公司；Trizol購自Invitrogen公司；DEPC購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；壯觀霉素、潮霉素和利福平購自北京楚和霞光生物技術(shù)有限公司。大鼠血清購自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所?；瘜W(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建AtDFB基因兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的過表達(dá)載體 以野生型擬南芥cDNA為模板，針對兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本分別設(shè)計(jì)引物，長轉(zhuǎn)錄本為DFB CDS.1(引物為DFB.1-F/DFB-R)，較短轉(zhuǎn)錄本為DFB CDS.2(引物為DFB.2-F/DFB-R)，在引物序列兩端添加EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，同時(shí)加入3～5個(gè)保護(hù)堿基。目的片段擴(kuò)增結(jié)束后與中間載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，經(jīng)菌落PCR和測序鑒定正確后，再將目的片段與pENTR3C載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，得到過表達(dá)載體pHZGWT-DFB(圖1)。鑒定正確后，通過Gateway過表達(dá)系統(tǒng)使pENTR3C-DFB.1、pENTR3C-DFB.2和pH2GW7載體進(jìn)行LR重組反應(yīng)，隨后利用花蘸法侵染Atdfb-3突變體，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

圖1 AtDFB基因過表達(dá)載體pH2GW7-DFB示意圖Fig.1 The overexpression vector pH2GW7-DFB of AtDFB gene.

1.2.3 轉(zhuǎn)錄水平鑒定 利用Trizol法提取擬南芥葉片RNA，通過RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體方法見試劑盒操作說明。使用ACTIN2(At3g18780)作為內(nèi)參基因，用各自基因特異性引物(表1)檢測目標(biāo)植株AtDFB、AtDFC、AtDFD基因的轉(zhuǎn)錄水平，以野生型擬南芥作為對照。PCR反應(yīng)體系共20 μL：模板 cDNA 1 μL，EasyTaq(5 U/μL)0.2 μL,10×TaqBuffer(Mg2+plus)2 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2 μL,Primer-F(10 μmol/L)0.5 μL, Primer-F(10 μmol/L)0.5 μL,ddH2O 13.8 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min預(yù)變性;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。 引物退火溫度均為55℃。

1.2.4 葉酸含量測定 在0.3 N和9.4 N培養(yǎng)基上分別種植WT、Atdfb-3、dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)。光照培養(yǎng)9 d進(jìn)行取材，每個(gè)株系每種處理設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品稱取50 mg，放入已加好2 mm無菌玻璃珠的螺帽管中，在液氮中研磨打樣。向螺帽管中加入250 μL葉酸提取緩沖液(1%w/V維生素C，50 mmol/L NaH2PO4，50 mmol/L Na2HPO4·12H2O，0.1% β-巰基乙醇)，充分混勻，沸水煮10 min，取出后立即冰上冷卻10 min。 4℃ 13 000 r/min離心10 min，取出樣品，轉(zhuǎn)移上清至新的螺帽管中。向沉淀中加入250 μL葉酸提取緩沖液，依次重復(fù)如上步驟。最終將上清合并后加入6.25 μL大鼠血清，37℃孵育4 h。處理結(jié)束后將樣品再次沸水煮10 min，冰浴10 min，4℃ 13 300 r/min離心10 min。取200 μL上清至于新的進(jìn)口EP管中，標(biāo)注樣品編號，用HPLC-MS/MS法測定葉酸含量。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 過表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的獲得

通過對2個(gè)轉(zhuǎn)錄本的分析，經(jīng)Gateway過表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建過表達(dá)載體，最終測序確認(rèn)構(gòu)建成功。在獲得了轉(zhuǎn)基因植株后，利用PCR進(jìn)一步確認(rèn)，最終通過統(tǒng)計(jì)分離比篩選出pH2GW7-DFB.1侵染的Atdfb-3突變體純合植株2個(gè)株系；pH2GW7-DFB.2侵染的Atdfb-3突變體選出純合植株2個(gè)株系。AtDFB基因的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本在Atdfb-3突變體背景下進(jìn)行過表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)中稱為互補(bǔ)植株，分別選出2個(gè)純合株系作為研究，命名為dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)。

2.2 野生型擬南芥與Atdfb-3突變體在低氮環(huán)境下的表型

2.2.1 野生型植株和Atdfb-3突變體中編碼FPGS的基因的轉(zhuǎn)錄情況 在9.4 N培養(yǎng)基條件下，選取生長6 d的野生型擬南芥和Atdfb-3突變體提取RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用基因特異性引物檢測葉酰聚谷氨酸合成酶AtDFB、AtDFC、AtDFD的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量。結(jié)果可以看出，Atdfb-3突變體的AtDFC基因表達(dá)量明顯提高、AtDFD基因表達(dá)相對野生型較弱(圖2)。

圖2 野生型擬南芥和Atdfb-3突變體的RT-PCR鑒定結(jié)果Fig.2 RT-PCR results of WT and Atdfb-3.

2.2.2 野生型植株和Atdfb-3突變體在低氮環(huán)境下鮮重、根長變化 在正常光照條件下的WT與Atdfb-3突變體生長在不同氮源濃度的培養(yǎng)基平板上，野生型擬南芥主根長度隨著氮源的減少基本無變化，而Atdfb-3突變體的主根長度隨著培養(yǎng)基氮源濃度的降低而明顯縮短(圖3A,彩圖見圖版一)。同時(shí)，突變體子葉呈紫色，花青素積累增加，真葉發(fā)育受阻。這說明Atdfb-3突變體對于低氮環(huán)境的反應(yīng)不同于野生型擬南芥。

隨著氮源濃度的降低，野生型擬南芥與Atdfb-3突變體鮮重都隨之下降。相比野生型Atdfb-3突變體反應(yīng)更加敏感，在1N濃度時(shí)鮮重即明顯降低，而野生型擬南芥鮮重在0.3N時(shí)才大幅降低；同時(shí)，Atdfb-3突變體從9.4 N時(shí)鮮重為野生型的50%，到0.3 N時(shí)只有野生型的10%，下降幅度更加劇烈(圖3B)。

在主根生長方面，低氮條件對于野生型擬南芥的影響不明顯，而Atdfb-3突變體的主根隨著生長發(fā)育時(shí)期的變化，低氮條件對其影響逐漸加大；在同樣的培養(yǎng)條件下，野生型擬南芥和Atdfb-3突變體的主根長度有極顯著差異(P<0.01)，9.4 N條件下12 d 時(shí)Atdfb-3突變體為野生型的30%，0.3 N條件下12 d 時(shí)Atdfb-3突變體為野生型的6%(圖3C)。從表型、鮮重和根長的結(jié)果可見，AtDFB基因的功能缺失對于擬南芥在低氮環(huán)境上的生長發(fā)育有重要影響。

2.3AtDFB基因的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 互補(bǔ)植株的轉(zhuǎn)錄水平分析 在9.4 N培養(yǎng)基上種植WT、Atdfb-3、dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)4個(gè)株系，光照培養(yǎng)6 d后提取RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用基因特異性引物檢測葉酰聚谷氨酸合成酶(AtDFB、AtDFC、AtDFD)、GTP環(huán)化水解酶(GTP cyclohydrolase I,GTPCHI)、10-甲酰四氫葉酸合成酶(10-formyltetrahydrofolate synthetase,THFS)、氨基脫氧分支酸合成酶(4-aminodeoxychorismate synthase,ADCS)等6種葉酸合成過程中的關(guān)鍵酶。結(jié)果顯示，dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)植株中AtDFB、AtDFD、GTPCHI、THFS、ADCS基因的轉(zhuǎn)錄水平與WT基本一致，DFC基因在dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)植株中表達(dá)量與Atdfb-3相同(圖4)。

2.3.2AtDFB基因功能的互補(bǔ)對Atdfb-3突變體表型的影響 將WT、Atdfb-3、dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)分別在9.4 N、0.3 N上種植，培養(yǎng)條件為正常光照培養(yǎng)(16 h 光照/8 h 黑暗)。選取幼苗培養(yǎng) 6 d 時(shí)的拍照記錄進(jìn)行展示，從圖5A(彩圖見圖版一)中可以看到，互補(bǔ)植株在9.4 N培養(yǎng)基和0.3 N培養(yǎng)基上，1-1、2-1互補(bǔ)植株的主根已恢復(fù)到野生型擬南芥的長度。

圖3 不同低氮條件下野生型擬南芥和Atdfb-3突變體的表型分析結(jié)果Fig.3 The phenotype results of WT and Atdfb-3 under different nitrogen conditions注：A. 不同低氮水平下野生型擬南芥和Atdfb-3突變體的根長表型比較；B. 不同低氮水平下野生型擬南芥和Atdfb-3突變體的鮮重比較；C.不同低氮水平下野生型擬南芥和Atdfb-3突變體的主根長比較。WT：野生型擬南芥；Atdfb-3：AtDFB基因的T-DNA插入突變體；9.4N：含9.4 mmol/的特殊氮源培養(yǎng)基；3N：含3 mmol/的特殊氮源培養(yǎng)基；1N：含1 mmol/的特殊氮源培養(yǎng)基；0.3N：含0.3 mmol/的特殊氮源培養(yǎng)基；AtDFB、AtDFC、AtDFD：葉酰聚谷氨酸合成酶的3個(gè)同工酶；ACTIN2：內(nèi)參基因；**：表示同組數(shù)據(jù)中與對照相比差異極顯著(P<0.01)。(彩圖見圖版一)

圖4 轉(zhuǎn)基因株系在9.4 N培養(yǎng)條件下的RT-PCR鑒定Fig.4 RT-PCR analysis of transgenic plants under 9.4 N condition.注：WT：野生型擬南芥；Atdfb-3：AtDFB基因的T-DNA插入突變體；1-1、1-2、2-1、2-1：Atdfb-3突變體過表達(dá)AtDFB，篩選出2個(gè)純合株系分別命名為dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)；AtDFB、AtDFC、AtDFD：葉酰聚谷氨酸合成酶的3個(gè)同工酶基因； GTPCHI：GTP環(huán)化水解酶基因；THFS：10-甲酰四氫葉酸合成酶基因；ADCS：氨基脫氧分支酸合成酶基因；ACTIN2：內(nèi)參基因。

從圖5B中可以看出，不同的氮源條件對于各個(gè)株系的鮮重都有較大影響，0.3 N條件下的WT、Atdfb-3、dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)的鮮重只有9.4N條件下的33%、14%、30%、27%、24%、23%；無論在9.4N還是0.3N條件下，dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)的鮮重與WT均無顯著性差異，說明其鮮重已恢復(fù)至野生型水平。根長結(jié)果顯示(圖5C、圖5D)，氮源條件對于WT、dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)的根部伸長影響不大，但是培養(yǎng)12 d時(shí)Atdfb-3突變體的根長在0.3 N條件下只有9.4 N的16% ；兩種氮源條件下，dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)的根長與WT均無顯著性差異。

2.3.3 實(shí)驗(yàn)植株的葉酸含量分析 如圖6(彩圖見圖版二)所示，將WT、Atdfb-3、dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)各株系分別在9.4 N、0.3 N條件下培養(yǎng)，光照6 d 時(shí)取材測量葉酸含量。測定結(jié)果顯示：WT、dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)中 5-M-THF的含量均高于5-F-THF，成為葉酸的主要形式。5-M-THF的測定結(jié)果(圖6A)，dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)含量較Atdfb-3都有所提高，與野生型差距縮小，其中低氮條件時(shí)dfb-DFB.2(2-1、2-2)分別是野生型含量的195%和179%。5-F-THF的測定結(jié)果表明(圖6B)，在氮限制條件下WT、Atdfb-3、dfb-DFB.1(1-1、1-2)的含量較9.4 N條件都有所降低，dfb-DFB.2(2-1、2-2)含量升高，其中dfb-DFB.2(2-1)含量為野生型含量的134%。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本對5-M-THF、5-F-THF的合成都起到一定作用，其中DFB CDS.2轉(zhuǎn)錄本對其影響更為顯著。同時(shí)，在氮限制條件下可能觸發(fā)某種機(jī)制，使得Atdfb-3、dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1)株系的5-M-THF含量較9.4 N條件下有所提高。

圖5 轉(zhuǎn)基因株系在不同氮源條件下的表型分析Fig.5 The phenotype analysis of transgenic plants under different nitrogen conditions.注：A.Atdfb-3突變體及AtDFB過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株根長表型比較；B.Atdfb-3突變體及AtDFB過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株在不同氮源條件下鮮重比較；C.Atdfb-3突變體及AtDFB過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株9.4N條件下主根長比較；D.Atdfb-3突變體及AtDFB過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株0.3N條件下主根長比較；WT：野生型擬南芥；Atdfb-3：AtDFB基因的T-DNA插入突變體；1-1、1-2、2-1、2-1：Atdfb-3突變體過表達(dá)AtDFB純合株系dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)；9.4N：含9.4 mmol/的特殊氮源培養(yǎng)基；0.3N：含0.3 mmol/的特殊氮源培養(yǎng)基；**：表示同組數(shù)據(jù)中與WT相比差異極顯著(P<0.01)。(彩圖見圖版一)

圖6 轉(zhuǎn)基因株系在不同氮源條件下的葉酸5-M-THF(A)和5-F-THF(B)含量Fig.6 5-M-THF(A) and 5-F-THF(B) contents of transgenic plants under different nitrogen conditions.注：WT：野生型擬南芥；Atdfb-3：AtDFB基因的T-DNA插入突變體；1-1、1-2、2-1、2-1：Atdfb-3突變體過表達(dá)AtDFB的兩個(gè)純合株系dfb-DFB.1(1-1、1-2)、dfb-DFB.2(2-1、2-2)；5-M-THF：5-甲基-四氫葉酸；5-F-THF：5-甲酰-四氫葉酸；*和**表示同組數(shù)據(jù)與WT相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。(彩圖見圖版二)

3 討論

根的生長發(fā)育是一系列生命活動(dòng)的結(jié)果，包括細(xì)胞分裂、細(xì)胞伸長、細(xì)胞分化等協(xié)調(diào)活動(dòng)，擬南芥中根的生長發(fā)育如分裂的時(shí)間和細(xì)胞伸長程度是由復(fù)雜的發(fā)育機(jī)制來調(diào)控的[10]。同時(shí)，一系列化學(xué)信使包括糖、營養(yǎng)素、氨基酸、植物激素等對調(diào)控根長也起到了重要作用[11～13]。其中，外界氮源的供給對于根的生長發(fā)育有一定程度的影響，同時(shí)低氮條件(0.1～0.6 mmol/L 氮濃度)限制了植物生長[14]。

本研究是通過在不同氮源條件下對WT和Atdfb-3進(jìn)行平板培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在相同氮源培養(yǎng)條件下Atdfb-3與WT在根長及鮮重方面具有極顯著差異；同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著氮源濃度的不斷下降，Atdfb-3突變體的生長發(fā)育被極大地抑制，在表型方面主要體現(xiàn)在：氮源濃度降低時(shí)，主根根長明顯縮短、子葉顏色發(fā)紫、真葉發(fā)育受阻；鮮重和根長下降的幅度比WT大，例如9.4 N條件下12 d時(shí)Atdfb-3突變體為野生型的30%，而0.3 N條件下12 d 時(shí)Atdfb-3突變體只有野生型的6%。以上結(jié)果表明，AtDFB基因的缺失可能導(dǎo)致內(nèi)源性氮缺乏，并且氮源減少對于Atdfb-3突變體的影響更加劇烈，突變體低氮條件的不適應(yīng)可能是由于葉酰聚谷氨酸合成酶AtDFB加尾功能的缺失，從而引起了擬南芥植物體內(nèi)葉酸加尾數(shù)量的減少，使得依賴多尾形式葉酸的酶活性改變，這些酶直接或間接地參與或調(diào)控植物體內(nèi)的氮代謝，因此Atdfb-3突變體表現(xiàn)出低氮條件下不耐受的表型。通過對WT和Atdfb-3突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AtDFB基因缺失時(shí)，AtDFC基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，AtDFD基因有一定幅度的下調(diào)，這表明三個(gè)基因之間可能存在著某種途徑上的關(guān)聯(lián)性。

過表達(dá)AtDFB基因兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的植株在表型、鮮重、根長和葉酸含量方面與WT均無明顯差異，說明這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本對于上述四個(gè)生理指標(biāo)均無明顯作用。生命活動(dòng)是一個(gè)復(fù)雜龐大的系統(tǒng)，有文獻(xiàn)報(bào)道葉酸合成的調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平的前饋調(diào)控(feedforward regulation)及反饋調(diào)控(feedback regulation)[15]。不難理解，植物體內(nèi)的代謝途徑涉及物質(zhì)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、還原、同化、分解等多個(gè)過程，調(diào)控機(jī)制步驟繁多，網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，僅僅依靠過表達(dá)AtDFB基因是否能起到調(diào)節(jié)植株鮮重、根長、葉酸含量的作用尚不確定，但本實(shí)驗(yàn)對在不同氮源下了解AtDFB基因功能做出了積極嘗試。

轉(zhuǎn)pH2GW7-DFB.1/pH2GW7-DFB.2載體植株在不同氮源條件下葉酸代謝和氮代謝之間的關(guān)系及AtDFB基因2個(gè)轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)功能分析顯示，低氮條件明顯減輕了WT的鮮重，但對于WT根長的影響較為微弱；氮源濃度的降低對Atdfb-3的影響幅度明顯大于WT；2個(gè)轉(zhuǎn)錄本的互補(bǔ)植株無論是在表型、鮮重、根長方面都恢復(fù)到了WT水平，表明兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本在擬南芥體內(nèi)都執(zhí)行AtDFB基因的生物學(xué)功能。

在葉酸生物強(qiáng)化的前期研究中，科研工作者更多地關(guān)注了葉酸合成代謝途徑中的初始催化酶[16,17]。隨著研究的不斷深入，葉酰聚谷氨酸合成酶FPGS漸漸進(jìn)入人們的視線，董薇[18]在水稻作物中轉(zhuǎn)入擬南芥的FPGS基因發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻的葉酸含量比野生型水稻提高了10.1%。本實(shí)驗(yàn)中對于Atdfb-3突變體的葉酸含量分析表明AtDFB功能缺失會(huì)導(dǎo)致葉酸含量下降，在9.4 N條件下互補(bǔ)植株的5-M-THF含量有所提高但依然沒有達(dá)到WT水平，而5-F-THF的含量沒有達(dá)到Atdfb-3突變體水平；0.3 N條件下轉(zhuǎn)pH2GW7-DFB.2的互補(bǔ)植株的5-M-THF和5-F-THF含量都超過了WT，其中5-M-THF的含量與Atdfb-3突變體有顯著性差異。分析其產(chǎn)生原因可能有兩點(diǎn)，一是氮脅迫條件下過表達(dá)的DFBCDS.2影響葉酸合成過程中的內(nèi)源基因、酶或者其他代謝途徑；二是AtDFB基因的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本在功能或亞細(xì)胞定位方面存在差異，導(dǎo)致短序列的轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生葉酸的含量提高幅度大。葉酸代謝過程涉及眾多的基因、酶和代謝途徑，目前關(guān)于葉酰聚谷氨酸合成酶如何調(diào)節(jié)葉酸含量的分子機(jī)制尚不清楚，需要在以后的工作中加以研究。

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Functional Analysis of Plastidial Folylpolyglutamate Synthetase inArabidopsisUnder N-limited Conditions

XU Bosi1, MENG Hongyan2, ZHANG Chunyi1*, JIANG Ling1

1.BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China; 2.FujianProvincialKeyLaboratoryofSubtropicalPlantPhysiologyandBiochemistry,FujianInstituteofSubtropicalBotany,FujianXiamen361006,China

Folylpolyglutamatesynthetase(FPGS)catalyzestheadditionofglutamateresiduestotheγ-carboxyloftetrahydrofolateindifferentpositions,toformfolylpolyglutamates.AtDFBistheFPGSthatlocatedinplastidofArabidopsis thaliana.InthisstudytheArabidopsisT-DNAinsertionmutant(Atdfb-3)ofAtDFBgenewasusedtoexplorethefunctionofAtDFBgenebycomparingthephenotypeofwildtypeandatdfb-3undervariousnitrogenconditions.TheresultsshowedthatAtdfb-3mutantdisplayedshorterprimaryrootlengthanddecreasedfolatecontent,comparedwiththewildtypeunderthenitrogen-limitedcondition.ThephenotypeofAtDFBoverexpressionlineunderAtdfb-3backgroundrestoredtothewild-typelevel,andthefolatecontentincreasedunderthenitrogen-limitedcondition.Inconclusion, Arabidopsis AtDFBgeneplaysanimportantroleinfolatebiosynthesispathway,andaffectstheprimaryrootdevelopmentunderthenitrogen-limitedcondition.

folate;AtDFBgene; nitrogen-limited condition; development;Arabidopsis

2016-10-23; 接受日期：2016-12-02

國家973計(jì)劃項(xiàng)目(2013CB127003)資助。

許博思，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锕δ芑蚪M學(xué)。E-mail: xbs2000@126.com。*通信作者：張春義，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事植物發(fā)育與營養(yǎng)代謝的分子生物學(xué)研究。E-mail:chunyi.zhang @163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2017.01.06