CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)及其在RNA編輯中的潛在應(yīng)用

任文琳, 張 俊, 徐桂霞, 牟亞妮, 樓 楊, 吳松青*

1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福州 350002; 2.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院, 福州 350002; 3.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 福州 350002

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)及其在RNA編輯中的潛在應(yīng)用

任文琳1, 張 俊2, 徐桂霞2, 牟亞妮1, 樓 楊3, 吳松青2*

1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福州 350002; 2.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院, 福州 350002; 3.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 福州 350002

化膿鏈球菌里的 CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為基因編輯工具已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)有研究表明這個系統(tǒng)具有作為通用核酸識別技術(shù)的潛在價值，即Cas9系統(tǒng)也能靶向識別活細(xì)胞中的RNA。將RCas9與不同的蛋白因子融合，可能會實現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控、控制RNA的定位、改變RNA的組成和使RNA可視化等。在介紹CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫機(jī)制的基礎(chǔ)上，重點比較了RCas9和先前的RNA研究方法，從轉(zhuǎn)錄動力學(xué)、再生醫(yī)學(xué)以及合成生物學(xué)等方面，綜述了其潛在的應(yīng)用價值，并對該系統(tǒng)在未來生命科學(xué)研究的應(yīng)用進(jìn)行了展望，以期為CRISPR-Cas9系統(tǒng)在RNA編輯方面的研究提供參考。

CRISPR-Cas9;RCas9；RNA生物學(xué)；RNA靶向技術(shù)

從十多年前人類基因組計劃完成后，分子生物學(xué)的研究方向就轉(zhuǎn)向了闡述功能基因的重要性[1]。雖然一個正常生物體的細(xì)胞核DNA是相同的，但是基因轉(zhuǎn)錄活性的高低造成了細(xì)胞的分化，從而使細(xì)胞執(zhí)行不同的功能。于是，以細(xì)胞為單位對RNA的檢測不僅可以區(qū)分不同的細(xì)胞，也可以用來判斷健康或疾病狀態(tài)。例如，自閉癥患者神經(jīng)細(xì)胞的變異程度與轉(zhuǎn)錄過程中一個基因聯(lián)合表達(dá)模板的表達(dá)程度密切相關(guān)[2]。過去認(rèn)為非編碼RNA不能編碼蛋白質(zhì)，只起到調(diào)控基因表達(dá)的作用，但德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的最新研究表明骨骼肌中一種特異性生物長鏈非編碼RNA(lncRNA)編碼了一個包含46個氨基酸的微肽，這種小型蛋白在心臟肌肉收縮中扮演關(guān)鍵角色[3]。這些都表明對RNA的研究將會是疾病模型構(gòu)建、臨床診斷和治療的關(guān)鍵。CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated)系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌長期進(jìn)化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[4]。本文介紹了CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫機(jī)制，綜述了從轉(zhuǎn)錄動力學(xué)到再生醫(yī)學(xué)再到合成生物學(xué)等方面其潛在的應(yīng)用價值，并對該系統(tǒng)在未來生命科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了展望，以期為CRISPR-Cas9系統(tǒng)在RNA編輯方面的研究提供參考。

1 RCas9的研究現(xiàn)狀

1.1 CRISPR/Cas9的作用機(jī)制

目前研究得最深入的CRISPR-Cas系統(tǒng)是Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)，通常由Cas9核酸酶和一對RNA，即反式CRISPR RNA(tracrRNA)和CRIPSR RNA(crRNA)構(gòu)成，細(xì)菌在抵御噬菌體等外源DNA入侵時，tracrRNA和crRNA配對形成RNA二聚體，進(jìn)而和Cas9形成核糖核蛋白復(fù)合物介導(dǎo)外源DNA的切割[5]。通過人工可以將tracrRNA和crRNA組合成單導(dǎo)向RNA(sgRNA)，化膿性鏈球菌的Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)就能通過sgRNA定位哺乳動物的DNA[6]。Cas9靶向定位DNA需要兩個元素：除了與靶向DNA序列互補(bǔ)的sgRNA之外，還需要一個NGG序列(其中n為任何核苷酸)，也被稱為前間區(qū)序列鄰近基序(PAM)[7]。PAM是CRISPR-Cas系統(tǒng)識別外源DNA的必要條件。當(dāng)噬菌體首次入侵細(xì)菌時，對PAM序列進(jìn)行掃描后，其鄰近的序列才能插入宿主菌CRISPR基因座形成間隔序列。并且在外源靶向DNA位點附近存在PAM，而宿主細(xì)胞的這些靶向位點缺乏PAM，這樣就可以避免宿主菌產(chǎn)生自我免疫[8]。由于利用sgRNA和PAM能夠很容易地定位靶DNA序列，使Cas9迅速成為一種通用的編輯基因和調(diào)控轉(zhuǎn)錄的工具。

1.2 RCas9在體內(nèi)應(yīng)用面臨的主要挑戰(zhàn)

近期對RCas9系統(tǒng)的研究表明，在體外條件下Cas9對RNA有很強(qiáng)的特異性結(jié)合能力，且隨后Cas9可以使單鏈RNA裂解[9]。Cas9靶向定位RNA同樣需要sgRNA和PAM這兩個元素，不同的是RCas9系統(tǒng)中的PAM是由雜交的反義寡核苷酸(the PAMmer)提供，與靶RNA雜交后與sgRNA的互補(bǔ)序列相鄰。O′Connell等[9]的實驗表明，要使sgRNA能夠識別特定RNA，需要將PAM序列的5′端延伸。如果在5′-NGG-3′上游添加2～8個核苷酸使5′端延長，將會使sgRNA和RNA的結(jié)合獲得較高的特異性，并且可以避免定位到對應(yīng)的模板DNA上。缺少這種5′端延伸的短PAMmers，無法激活Cas9與sgRNA的結(jié)合。這種機(jī)制可能會抵消PAMmer 與RNA解螺旋帶來的高能量損耗。

Cas9和同源sgRNA的運(yùn)輸已通過各種方法實現(xiàn)，包括利用可以編碼Cas9和sgRNA的病毒，利用藥物誘導(dǎo)使Cas9在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)[10]，以及通過陽離子脂質(zhì)體實現(xiàn)Cas9蛋白和sgRNA的運(yùn)輸[11]。同時要保證一個有效手段將RCas9的 PAMmer運(yùn)輸?shù)秸_的位置。雖然這些方法已用于在體內(nèi)運(yùn)輸?shù)腞Cas9系統(tǒng)中的1個或2個部件，但目前仍然需要探索載體以哪種方式與3個組件(Cas9、sgRNA和PAMmer)結(jié)合更有利于其在體內(nèi)的有效重建。

O′Connell等[9]在研究過程中發(fā)現(xiàn)，DNA-RNA雜交鏈會被細(xì)胞內(nèi)的RNase H降解。早期的研究表明，被修飾的DNA寡核苷酸可以消除RNase H的活性[12]，如對PAMmer進(jìn)行2′-羥基甲基化修飾可以有效地防止靶RNA被降解。對其長度進(jìn)行細(xì)微調(diào)整或修飾也可以避免啟動RNAi機(jī)制。

上述研究只在體外進(jìn)行，Cas9在活體細(xì)胞內(nèi)或生物體內(nèi)定位RNA的強(qiáng)度和特異性尚不清楚。例如，雖然RCas9在體外不剪切DNA，但在體內(nèi)是否會出現(xiàn)定位DNA的情況還是未知的。RCas9能否成功地在體內(nèi)應(yīng)用從根本上取決于它的特異性和是否能作用于靶RNA，為了評估其作為一種細(xì)胞內(nèi)RNA編輯工具的潛能，還需要對RCas9的特異性進(jìn)行廣泛驗證。

2 RCas9系統(tǒng)的潛在應(yīng)用

2.1 調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)

RCas9最普遍的應(yīng)用是利用Cas9內(nèi)切酶活性使特定的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物裂解，從而下調(diào)基因表達(dá)。雖然RNA干擾(RNAi)也能進(jìn)行RNA識別和切割，但當(dāng)RNAi機(jī)制不存在或者不活躍時[13]，基于RCas9的基因敲除在細(xì)胞中將發(fā)揮重要作用，并且RNAi在作用過程中存在著諸多局限性。2003年，Jackson等[14]使用基因芯片技術(shù)研究人體細(xì)胞內(nèi)siRNA介導(dǎo)的基因沉默時，發(fā)現(xiàn)siRNA對其不完全匹配的mRNA也具有抑制作用，同時mRNA局部二級結(jié)構(gòu)[15]和長dsRNA[16]也會影響siRNA的作用效果。相比之下，RCas9對RNA有高親和力且能被sgRNA和PAMmer雙重識別，比siRNA能降解更多的靶向RNA。具體比較見表1。

另外，使基因表達(dá)上調(diào)的途徑是難以獲得的。CRISPR-Cas系統(tǒng)的另外一種形式稱為CRISPR干擾(CRISPRi)，CRISPRi依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑與無核酸酶活性的Cas9(dCas9)融合[17]調(diào)控基因的表達(dá)。dCas9雖然失去了剪切DNA的能力，但依然能和sgRNA共表達(dá)，形成一種DNA識別復(fù)合物。由此，研究人員試圖將dCas9轉(zhuǎn)化為能激活基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，即在RCas9系統(tǒng)中，將dCas9與翻譯增強(qiáng)因子融合，在不改變RNA豐度的同時可能會達(dá)到增強(qiáng)特定基因表達(dá)的目的。

表1 RNAi與RCas9在基因表達(dá)調(diào)控中的比較

2.2 應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)

控制RNA的定位可能是再生治療的一個重要方法。例如在神經(jīng)元中，mRNA將參與突觸的建成活動，但突觸間隙會給積累足夠濃度的突觸蛋白帶來挑戰(zhàn)。一些證據(jù)表明編碼細(xì)胞骨架成分的RNA的定位是軸突再生的關(guān)鍵[18]，通過與轉(zhuǎn)運(yùn)因子融合，結(jié)合了這些特定RNA的RCas9系統(tǒng)會被運(yùn)輸?shù)侥硞€選定區(qū)域，如突觸前端或末端，使突觸蛋白積累到正常的生理濃度。即在RCa9系統(tǒng)的參與下有可能實現(xiàn)損傷后神經(jīng)元的再生。

RCas9也可以用來改變RNA的組成。前體mRNA的可變剪接是mRNA合成的關(guān)鍵步驟，剪接因子在前體mRNA上的不同作用位點可以產(chǎn)生多種mRNA。剪接因子與RCas9融合后，其作用位點的選擇可能會受到RCas9與靶向mRNA結(jié)合位點的影響，即產(chǎn)生特定的剪接因子。這種有針對性的剪接可以用來逆轉(zhuǎn)異常剪接引起的各種疾病[19]。例如，脊髓性肌萎縮是由運(yùn)動神經(jīng)元生存基因SMN1缺失導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡引起的，但有證據(jù)表明，在SMN1基因缺失的細(xì)胞中改變SMN2的剪接可以產(chǎn)生1個同類型的SMN2，從而重新獲得SMN1基因的活性[20]。這不僅促進(jìn)了疾病模型的建立，也為再生醫(yī)學(xué)藥物的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2.3 應(yīng)用于RNA成像

2.3.1 不同的RNA成像方法 近些年發(fā)展起來的幾種核酸識別工具已經(jīng)能夠使活細(xì)胞中的特異性核酸成像，但也存在一些缺陷[21]。類似于與熒光蛋白融合使蛋白質(zhì)可視化的方式，一些RNA識別系統(tǒng)通過序列標(biāo)簽與靶向RNA的結(jié)合使RNA可視化，這些RNA標(biāo)簽可以被某些蛋白質(zhì)特異性識別。目前應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)是通過MS2噬菌體的外殼蛋白(MCP)與熒光蛋白[22]融合，識別RNA序列中的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。這是一種使高豐度RNA在活細(xì)胞中成像的高效方法[23]，但游離的MS2熒光蛋白會引起較高的背景值[22]，也可能影響mRNA的穩(wěn)定性[24]。另一種方法是將分子信標(biāo)與外源性小分子熒光結(jié)合[25]，當(dāng)核酸適配體和靶向RNA發(fā)生雜交后，通過熒光基團(tuán)與熒光淬滅劑分離或利用熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)產(chǎn)生熒光信號[26]。第3種方法是基于將熒光蛋白拆分為兩個結(jié)構(gòu)域，分別與RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)蛋白融合[27]。當(dāng)該復(fù)合體與靶向RNA結(jié)合時，通過兩個熒光發(fā)射團(tuán)的重組可實現(xiàn)RNA的可視化成像。這種方法可以有效抑制背景熒光[28]。

雖然這3種方法被廣泛用于研究RNA動力學(xué)，但面臨著高背景噪聲、運(yùn)輸繁瑣、序列標(biāo)簽影響RNA活性等問題。RCas9可以在保證高特異性和低噪聲的同時，通過直接識別未標(biāo)記的RNA來避免這些問題。

RCas9系統(tǒng)具有同時使一個或多個內(nèi)源性RNA豐度和定位可視化的潛能。通過將dCas9與熒光蛋白融合，可以顯示特定的RNA的定位。另外，將1對Cas9蛋白分別與一半熒光蛋白融合，如黃色熒光蛋白Venus[29]，可以定位到RNA的鄰近位點。這可能會比一個完整的熒光蛋白產(chǎn)生更低的背景值，從而實現(xiàn)RNA位置的可視化或單個細(xì)胞中RNA含量的測量。這種利用部分熒光蛋白的方法還可以用于在不同的選擇性剪接過程中定位相鄰的外顯子，對于表達(dá)特定RNA剪切異構(gòu)體的細(xì)胞進(jìn)行鑒定和分離。這種利用Cas蛋白和sgRNA的正交鑒定技術(shù)可以同時定位多個轉(zhuǎn)錄，從而進(jìn)行RNA位置和豐度的測量，也可以用于個體活細(xì)胞RNA動力學(xué)的綜合性研究。

2.3.2 應(yīng)用于干細(xì)胞研究 活細(xì)胞內(nèi)源性RNA定位和豐度測量的應(yīng)用非常廣泛。例如目前闡明干細(xì)胞的特性仍然存在困難，因為只存在少數(shù)幾個表面標(biāo)記用于細(xì)胞識別和純化，基因表達(dá)圖譜是目前鑒定干細(xì)胞類型的最有效方法[30]。例如CD44是一種腫瘤干細(xì)胞(CSCs)標(biāo)記，位于細(xì)胞表面，參與細(xì)胞間的相互作用、細(xì)胞的黏附和遷移[31]。為了研究CD44基因在肝癌干細(xì)胞中的整體功能，來自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部和南方醫(yī)科大學(xué)的研究人員[32]使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，敲除了人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系C3A中的CD44，證實了CD44通過保持低分化的腫瘤細(xì)胞群，在肝癌干細(xì)胞中發(fā)揮重要功能。RCas9同樣可以滿足這種無損檢測，所以少量干細(xì)胞可以實現(xiàn)保存、增殖和分離。

2.3.3 用于應(yīng)激顆粒的研究 RNA定位在細(xì)胞對損傷、應(yīng)激和某些行為的應(yīng)答中也具有重要意義。應(yīng)激顆粒是一種RNA和蛋白質(zhì)的聚合體，通常在應(yīng)對氧化應(yīng)激、高溫、病毒感染或缺氧時形成[33]。許多疾病都與RNA顆粒的異常形成有關(guān)：如登革熱病毒在侵染宿主后降低了宿主細(xì)胞整體的mRNA含量，抑制了應(yīng)激顆粒的形成[34]；而脊髓灰質(zhì)炎病毒在感染早期可誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的產(chǎn)生，后期病毒剪切應(yīng)激顆粒使之降解[35]，從而有利于其自身mRNA的復(fù)制。但是，對于應(yīng)激顆粒中RNA的研究才剛剛起步，利用RCas9系統(tǒng)使應(yīng)激顆粒中的內(nèi)源性RNA成像將有助于弄清應(yīng)激顆粒在健康和疾病中的重要性。如利用RCas9在病變神經(jīng)元中追蹤RNA運(yùn)輸，檢測應(yīng)激顆粒形成，以鑒別出這些疾病的分子特征[36]。這表明RCas9系統(tǒng)介導(dǎo)的RNA定位將在受損組織再生中發(fā)揮作用。

2.4 應(yīng)用于合成生物學(xué)

合成生物學(xué)發(fā)展的重點在于建立基于基因組和蛋白質(zhì)組的模塊化的資源庫和技術(shù)平臺，從而應(yīng)用于設(shè)計或改造生物大分子、生物部件、代謝途徑或發(fā)育過程。RCas9系統(tǒng)的高度模塊化和可編程性使其在合成生物學(xué)中可以作為潛在的技術(shù)平臺。例如，Cas9蛋白可以與裂解酶融合，在識別靶向RNA后使裂解酶恢復(fù)活性。例如檢測出和癌癥相關(guān)的RNA后，Cas9可以使分裂的死亡誘導(dǎo)蛋白恢復(fù)活性。甚至，通過Cas9蛋白和RNA的相互作用，可能會重新設(shè)計涉及連續(xù)蛋白質(zhì)之間的相互作用途徑。在基因表達(dá)的過程中，RCas9在蛋白質(zhì)之間的相互作用中可能起支架作用以控制信號傳輸。例如杜克大學(xué)的研究人員利用dCas9將酶攜帶至基因組中的特異位點，將一種表觀遺傳標(biāo)記——乙?；砑拥搅私M蛋白上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶基因的表達(dá)量上調(diào)[37]。原則上，Cas9蛋白和靶向RNA之間強(qiáng)有力的結(jié)合效果可以優(yōu)于連續(xù)蛋白質(zhì)的相互作用，從而達(dá)到一個新的調(diào)控水平。這表明RCas9系統(tǒng)也具有闡明表觀遺傳學(xué)修飾的功能和遺傳性，協(xié)助開發(fā)控制細(xì)胞表型和干涉基因組調(diào)控新策略的潛能[38]。

3 展望

從RNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域作為RNA序列特異性的決定因素到RCas9通過簡單的核酸雜交進(jìn)行靶向識別，RNA靶向技術(shù)的研究取得了和DNA靶向技術(shù)相當(dāng)?shù)陌l(fā)展。ZFN(鋅指技術(shù))和TALEN(轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù))為Cas9介導(dǎo)的DNA識別技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。在定位DNA的應(yīng)用中，Cas9及其sgRNA在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)得很穩(wěn)定且無毒性，但編碼RNA的識別技術(shù)則處于起步階段，RCas9系統(tǒng)的3個組件(Cas9、sgRNA和PAMmer)是否能夠有效傳遞并成功結(jié)合RNA還有待觀察。RCas9系統(tǒng)通過簡單的堿基配對識別無標(biāo)記的內(nèi)源RNA的能力，是RNA識別技術(shù)中取得的主要成就，在診斷和治療中的應(yīng)用尤為重要。如果在可以避免定位基因組DNA和轉(zhuǎn)錄脫靶的同時，將RCas9系統(tǒng)提供給細(xì)胞進(jìn)行RNA識別，可以預(yù)見該系統(tǒng)在基礎(chǔ)應(yīng)用生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)泻芏嘈碌膽?yīng)用。

[1] Consortium T E P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome [J]. Nature, 2012, 489(7414):57-74.

[2] Voineagu I, Wang X, Johnston P,etal.. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology [J]. Nature, 2011, 474(7351):380-384.

[3] Anderson D, Anderson K, Chang C L,etal.. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance [J]. Cell, 2015, 160(4):595-606.

[4] Mohan B, Natalia B, Robert F,etal.. A dual function of the CRISPR-Cas system in bacterial antivirus immunity and DNA repair [J]. Mol. Microbiol., 2011, 79(2):484-502.

[5] Sander J D, Joung J K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes [J]. Nat. Biotechnol., 2014, 32(4):347-355.

[6] Mali P, Yang L, Esvelt K M,etal.. RNA-guided human genome engineering via Cas9 [J]. Science, 2013, 339(6121):823-826.

[7] Mojica F J, Díez-Villaseor C, García-Martínez J,etal.. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system [J]. Microbiology, 2009, 155(3):733-740.

[8] Marraffini L A, Sontheimer E J. Self versus non-self discrimination during CRISPR RNA-directed immunity [J]. Nature, 2010, 463(463):568-571.

[9] O′Connell M R, Oakes B L, Sternberg S H,etal.. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9 [J]. Nature, 2014, 516(7530):263-266.

[10] Kasap C, Elemento O, Kapoor T M. Drug target SeqR: a genomics- and CRISPR-Cas9-based method to analyze drug targets [J]. Nat. Chem. Biol., 2014, 10(8):626-628.

[11] Steyer B, Carlson-Stevermer J, Angenent-Mari N,etal.. High content analysis platform for optimization of lipid mediated CRISPR-Cas9 delivery strategies in human cells[J]. Acta Biomater., 2015, 34:143-158.

[12] Wu H, Lima W F, Crooke S T. Properties of cloned and expressed human RNase H1[J]. J. Biol. Chem., 1999, 274(40):28270-28278.

[13] Xie K. RNAi in budding yeast [J]. Science, 2009, 326(5952):544-550.

[14] Jackson A L, Bartz S R, Schelter J,etal.. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi[J]. Nat. Biotechnol., 2003, 21(6):635-637.

[15] Birmingham A, Anderson E M, Reynolds A,etal.. 3′ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets [J]. Nat. Methods, 2006, 3(6):199-204.

[16] Kulkarni M M, Booker M, Silver S J,etal.. Evidence of off-target effects associated with long dsRNAs in Drosophila melanogaster cell-based assays [J]. Nat. Methods, 2006, 3(10):833-838.

[17] Qi L, Larson M, Gilbert L,etal.. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression[J]. Cell, 2013, 152(5):1173-1183.

[18] Donnelly C J, Willis D E, Xu M ,etal.. Limited availability of ZBP1 restricts axonal mRNA localization and nerve regeneration capacity[J]. EMBO J., 2011, 30(22):4665-4677.

[19] David C J, Manley J L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged [J]. Genes Dev., 2010, 24(21):2343-2364.

[20] Hua Y, Vickers T A, Okunola H L,etal.. Antisense masking of an hnRNP A1/A2 intronic splicing silencer corrects SMN2, splicing in transgenic mice [J]. Am. J. Human Genet., 2008, 82(4):834-848.

[21] Rath A K, Rentmeister A. Genetically encoded tools for RNA imaging in living cells [J]. Curr. Opin. Biotechnol., 2015, 31:42-49.

[22] Bertrand E, Chartrand P, Schaefer M,etal.. Localization of ASH1, mRNA particles in living yeast[J]. Mol. Cell, 1998, 2(4):437-445.

[23] Park H Y, Lim H, Yoon Y J,etal.. Visualization of dynamics of single endogenous mRNA labeled in live mouse [J]. Science, 2014, 343(6169):422-424.

[24] Lange S, Katayama Y, Schmid M,etal.. Simultaneous transport of different localized mRNA species revealed by live-cell imaging[J]. Traffic, 2008, 9(8):1256-1267.

[25] Strack R L, Disney M D, Jaffrey S R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA [J]. Nat. Methods, 2013, 10(12):1219-1224.

[26] Shin I, Ray J, Gupta V,etal.. Live-cell imaging of Pol Ⅱ promoter activity to monitor gene expression with RNA IMAGE tag reporters [J]. Nucl. Acids Res. Adv. Access, 2014, 42(11):2247-2258.

[27] Magliery T J, Wilson C G M, Pan W,etal.. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: scope and mechanism [J]. J. Am. Chem. Soc., 2005, 127(1):146-157.

[28] Rackham O, Brown C M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs [J]. EMBO J., 2004, 23(16):3346-3355.

[29] Ozawa T, Natori Y, Sato M,etal.. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells [J]. Nat. Methods, 2007, 4(5):413-419.

[30] Zhang J, Nuebel E, Daley G,etal.. Metabolic regulation in pluripotent stem cells during reprogramming and self-renewal[J]. Cell Stem Cell, 2012, 11(5):589-595.

[31] Leung E L, Fiscus R R, Tung J W,etal.. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties [J]. PLoS ONE, 2010, 5(11):e14062.

[32] Han S, Guo J H, Liu Y N,etal.. Knock out CD44 in reprogrammed liver cancer cell C3A increases CSCs stemness and promotes differentiation [J]. Oncotarget, 2015, 6(42):44452-44465.

[33] Sonenberg N, Hinnebusch A G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: Mechanisms and biological targets [J]. Cell, 2009, 136(4):731-745.

[34] Xia J, Chen X, Xu F,etal.. Dengue virus infection induces formation of G3BP1 granules in human lung epithelial cells[J]. Arch. Virol., 2015, 160(12):2991-2999.

[35] Fitzgerald K D, Semler B L. Poliovirus infection induces the co-localization of cellular protein SRp20 with TIA-1, a cytoplasmic stress granule protein [J]. Virus Res., 2013, 176(1-2):223-231.

[36] Nelles D A, Fang M Y, O′Connell M R,etal.. Programmable RNA tracking in live cells with CRISPR/Cas9 [J]. Cell, 2016, 165(2):488-496.

[37] Hilton I B, D′Ippolito A M, Vockley C M,etal.. Epigenome editing by a CRISPR/Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers [J]. Nat. Biotechnol., 2015, 33(5):510-517.

[38] Doudna J A, Gersbach C A. Genome editing: the end of the beginning [J]. Genome Biol., 2014, 16(1):1-3.

CRISPR/Cas9-mediated Gene Editing Technology and Potential Applications in RNA Editing

REN Wenlin1, ZHANG Jun2, XU Guixia2, MOU Yani1, LOU Yang3, WU Songqing2*

1.CollegeofLifeSciences,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China; 2.CollegeofForestry,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China; 3.CollegeofPlantProtection,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China

The CRISPR-Cas9 system, fromStreptococcuspyogenes, has gained widespread application as a genome editing tool. Previous studies showed that CRISPR-Cas9 system has the potential utility as a universal nucleic acid-recognition technology, that is Cas9 system can also allow RNA identification and editing in live cells. By fusing RCas9 to different protein factors, it may be possible to modulate gene expression, control the localization of RNA, alter the composition of RNAs and enable imaging of specific RNA. In this paper, the mechanism of CRISPR-Cas9 system-mediated immunity was introduced, in particular, we compared RCas9 to previous methods for RNA targeting and discussed potential uses ranging from live imaging of transcriptional dynamics to regenerative therapies and applications in synthetic biology, and finally prospected the application of this new system in life science, which was expected to provide reference for CRISPR-Cas9 system application in RNA editing.

CRISPR-Cas9; RCas9; RNA biology; RNA targeting

2016-06-22; 接受日期：2016-07-18

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201304401)；中央財政林業(yè)科技推廣示范項目[Min(2015)TG017]；福建省科技廳自然科學(xué)基金項目(2016J01097)； 福建省教育廳科技項目(JA15161)；福建農(nóng)林大學(xué)重點項目建設(shè)專項(6112C035003)；福建農(nóng)林大學(xué)科研基金項目(2014xjj12)資助。

任文琳，本科生，主要從事微生物農(nóng)藥研究。E-mail:863507710@qq.com。*通信作者：吳松青，講師，博士，主要從事微生物農(nóng)藥研究。E-mail: dabinyang@126.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2017.01.01