長(zhǎng)江流域主要常規(guī)雙季早秈稻的遺傳相似性分析及指紋圖譜構(gòu)建

戴冬青張華麗張萌 李西明 馬良勇

(中國(guó)水稻研究所,杭州310006;＃共同第一作者;?通訊聯(lián)系人,E-mail:maliangyong＠caas．cn)

長(zhǎng)江流域主要常規(guī)雙季早秈稻的遺傳相似性分析及指紋圖譜構(gòu)建

戴冬青＃張華麗＃張萌 李西明 馬良勇?

(中國(guó)水稻研究所,杭州310006;＃共同第一作者;?通訊聯(lián)系人,E-mail:maliangyong＠caas．cn)

【目的】構(gòu)建常規(guī)早稻品種的指紋圖譜以及分析其遺傳相似性,為早稻品種鑒定、育種者有效選配親本提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳?000年以來(lái)長(zhǎng)江流域雙季稻區(qū)通過(guò)省級(jí)以上審定的常規(guī)早稻品種為材料,利用50對(duì)多態(tài)性高,穩(wěn)定性好,且均勻分布于水稻12條染色體的SSR引物,建立常規(guī)早稻的SSR指紋圖譜。利用NTSYS PC Version 2．10e軟件、UPGMA法進(jìn)行聚類分析?！窘Y(jié)果】50對(duì)引物共檢測(cè)到多態(tài)性位點(diǎn)154個(gè),每對(duì)引物檢測(cè)到的等位基因數(shù)為2～6個(gè),平均3．08個(gè);引物多態(tài)信息含量(PIC)值為0．03～0．75,平均值為0．36。62份材料的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0．66～1,并且在相似系數(shù)為0．73處可分為浙江省內(nèi)品種及省外品種2組,各組間差異不大?！窘Y(jié)論】結(jié)合系譜關(guān)系發(fā)現(xiàn),本研究中所用早稻品種的遺傳背景較為狹窄。

早稻;系譜;DNA指紋圖譜;聚類分析

早秈稻是我國(guó)水稻的主要生態(tài)類型之一,通常用作雙季稻栽培,主要分布于華南雙季稻作區(qū)和華中雙、單季稻作區(qū)。包括江西、湖南、廣西、廣東、湖北、安徽、福建、河南、浙江、云南、四川等省的部分地區(qū)[1]。其生產(chǎn)具有獨(dú)特的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義,表現(xiàn)在育種、糧食政策、商品加工性及糧食安全等多方面[2,3]。早中熟早稻品種的推廣,給晚稻產(chǎn)量大幅度增長(zhǎng)創(chuàng)造了條件,為我國(guó)糧食生產(chǎn)的發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)[4]。據(jù)2014年中國(guó)農(nóng)業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì)資料顯示, 2013年早稻種植面積為580．44萬(wàn)hm2,約占整個(gè)水稻種植面積的19．14%,總產(chǎn)量為3413．5萬(wàn)t,約占當(dāng)年水稻總產(chǎn)量的16．76%,產(chǎn)量為5881 kg/hm2,是中國(guó)糧食安全的重要支撐[5]。

隨著水稻育種事業(yè)的發(fā)展,總體育種目標(biāo)趨于一致,少數(shù)骨干親本被反復(fù)利用,導(dǎo)致品種間親緣關(guān)系越來(lái)越近,遺傳差異越來(lái)越小,完全依據(jù)形態(tài)性狀進(jìn)行品種的辨別越來(lái)越困難[6]。此外,雖然我國(guó)在品種選育方面取得了喜人成果,但在品種鑒定和品種權(quán)保護(hù)上進(jìn)展卻比較緩慢,品種保護(hù)意識(shí)和手段的欠缺直接影響到新品種的保護(hù),品種侵權(quán)事件經(jīng)常發(fā)生,嚴(yán)重影響到育種者的積極性和育種成果的合法推廣應(yīng)用[7]。傳統(tǒng)的水稻新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性(DUS)測(cè)試具有耗時(shí)久、鑒定指標(biāo)有限及準(zhǔn)確性相對(duì)不高等特點(diǎn)[8]。20世紀(jì)90年代之前,作物品種鑒定工作中經(jīng)常會(huì)用到生化指紋圖譜輔助鑒定。1985年,英國(guó)科學(xué)家Jeffreys等[9]用人類基因組高變區(qū)的高度保守序列作探針進(jìn)行Southern雜交,得到了類似指紋的特異性雜交圖譜,并將其稱作DNA指紋圖譜。1988年,水稻的DNA圖譜誕生[10]。新興的基于SSR標(biāo)記的DNA指紋圖譜鑒定速度快、結(jié)果準(zhǔn)確,已迅速推廣到科研、育種及生產(chǎn)指導(dǎo)工作中[11-15]。SSR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、效率高和重演性強(qiáng)等特點(diǎn),現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于水稻遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀基因定位和標(biāo)記輔助育種等眾多領(lǐng)域,也是當(dāng)前主要農(nóng)作物品種(如玉米、水稻、大豆)真?zhèn)涡澡b定中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記[16-20]。

近年來(lái),基于SSR標(biāo)記構(gòu)建了水稻[21]、小麥[22]、玉米[23]、煙草[24]、大豆[25]、棉花[26]等主要農(nóng)作物的DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。從夕漢等[27]構(gòu)建了56份雜交水稻骨干親本的指紋圖譜;馬紅勃等[28]構(gòu)建了福建省若干水稻品種的指紋圖譜;陳英華等[29]構(gòu)建了東北地區(qū)區(qū)試新品種的指紋圖譜;朱良勇等[30]構(gòu)建了太湖稻區(qū)及國(guó)內(nèi)部分香稻的SSR指紋圖譜。綜合前人研究結(jié)果,可以看出,在水稻中對(duì)指紋圖譜的研究大多集中于雜交水稻這一方面,對(duì)于常規(guī)稻尤其是常規(guī)早稻的指紋圖譜研究相對(duì)較少。

本研究以58份常規(guī)早稻品種及4份祖先品種為研究材料,從水稻的12條染色體上篩選出50對(duì)SSR引物構(gòu)建了這些材料的DNA指紋圖譜,同時(shí)結(jié)合系譜關(guān)系對(duì)品種間的遺傳相似性進(jìn)行了分析,以期為以后的研究提供針對(duì)早稻品種準(zhǔn)確、科學(xué)的鑒定方法,保護(hù)育種者的知識(shí)產(chǎn)權(quán)和權(quán)益,也為育種者選配親本提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

選用2000年以后長(zhǎng)江流域雙季稻區(qū)通過(guò)省級(jí)以上審定的58份常規(guī)早稻品種及4份2000年以前通過(guò)審定的祖先品種IR8、浙輻802、嘉育293和嘉育948。材料來(lái)源于中國(guó)水稻研究所早稻育種組及中國(guó)水稻研究所國(guó)家水稻中期庫(kù),品種名及其系譜關(guān)系見(jiàn)圖1。SSR引物由北京鼎國(guó)生物工程公司合成,2×PCR Mix及電泳試劑等購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1．2 系譜分析

根據(jù)中國(guó)水稻品種及其系譜數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http://www．ricedata．com)上的系譜信息,追溯供試材料至配組時(shí)的親本。審定的品種的親本為審定的品種或中間材料時(shí),大多數(shù)追溯到上3代,外引品種一般不再追溯其系譜而視為原始親本[31]。

1．3 DNA提取及標(biāo)記檢測(cè)

用TPS法[32]提取供試的所有62份水稻材料的總DNA。本研究所用的50對(duì)SSR標(biāo)記(表1)來(lái)源于兩部分,其中38對(duì)是從新的“水稻品種鑒定SSR標(biāo)記法”[33]中的48對(duì)微衛(wèi)星引物篩選而來(lái);其余的為本實(shí)驗(yàn)室從水稻12條染色體上篩選到的多態(tài)性和穩(wěn)定性較好、條帶清晰的12對(duì)微衛(wèi)星引物。PCR擴(kuò)增、電泳等嚴(yán)格按照“新國(guó)標(biāo)”技術(shù)要求進(jìn)行。

1．4 指紋的建立

根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳凝膠上的位置,視每條多態(tài)性帶為一個(gè)等位基因,對(duì)每對(duì)引物生成的不同基因型進(jìn)行編號(hào),構(gòu)建62份常規(guī)水稻品種的DNA指紋圖譜。電泳結(jié)果采用1,0系統(tǒng)記錄每個(gè)位置等位變異的有無(wú),即某個(gè)擴(kuò)增條帶有帶記為1,無(wú)帶記為0。并且將每對(duì)引物在品種間擴(kuò)增得到的二進(jìn)制(0,1)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為十進(jìn)制數(shù)據(jù),以所得的十進(jìn)制數(shù)據(jù)代表每對(duì)引物擴(kuò)增的結(jié)果,以50對(duì)引物組合的十進(jìn)制字符串作為每一個(gè)品種的數(shù)字指紋。

1．5 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)公式PIC＝1-ΣPi2計(jì)算每對(duì)引物的多態(tài)信息量(Polymorphism information content, PIC)[29],其中Pi指第i個(gè)等位變異出現(xiàn)的頻率。通過(guò)NTSYS-pc V2．10e軟件,利用UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic mean,非加權(quán)平均法)進(jìn)行聚類分析,并繪制樹(shù)狀聚類圖。同時(shí),利用Qualitative data計(jì)算品種間的遺傳相似系數(shù)(Jaccard系數(shù))[26]。

圖1 主要早稻品種的系譜關(guān)系Fig．1．Pedigree diagram of the main early rice varieties．

2 結(jié)果與分析

2．1 系譜圖的繪制

以本研究所涉及的早稻品種為基礎(chǔ)繪制其系譜關(guān)系圖(圖1)。從系譜圖中可以看出,早稻品種大部分可追溯到一個(gè)祖先品種IR8及其衍生的浙輻802、嘉育293和中選181等,不同的早稻品種之間在配組時(shí)經(jīng)常會(huì)相互組合,很難明確分出不同的派系,親緣關(guān)系相互融合。而且在新品種選育的過(guò)程中,以秈-秈交為主,遺傳背景越來(lái)越狹窄。

2．2 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

利用50對(duì)多態(tài)性高,穩(wěn)定性好,且均勻分布于水稻12條染色體的SSR引物(表1),共檢測(cè)到等位變異位點(diǎn)154個(gè),平均等位變異數(shù)為3．08個(gè),每個(gè)標(biāo)記檢測(cè)到的等位變異數(shù)為2～6個(gè);共檢測(cè)到基因型總數(shù)為162個(gè),每個(gè)標(biāo)記檢測(cè)到的基因型個(gè)數(shù)為2～6個(gè),標(biāo)記RM208在62份水稻品種中共檢測(cè)到5種不同基因型(圖2)。如表1所示,標(biāo)記間的多樣性指數(shù)介于0．03和0．75之間,平均多樣性指數(shù)為0．36,大于平均數(shù)的標(biāo)記29個(gè),引物編號(hào)為1、3、4、6、7、8、10、12、16、17、23、24、26、27、28、29、30、31、32、36、37、38、41、42、43、46、47、48、50;等位基因數(shù)和多樣性指數(shù)均大于平均值的標(biāo)記有14個(gè),引物編號(hào)為3、7、8、16、27、29、36、37、38、41、42、44、47、48,表明這些引物在區(qū)分早秈稻品種時(shí)具有較強(qiáng)的鑒別能力。

2．3 指紋圖譜的構(gòu)建

將每對(duì)引物在品種間擴(kuò)增得到的二進(jìn)制數(shù)據(jù)(0,1)轉(zhuǎn)化為十進(jìn)制數(shù)據(jù),以該十進(jìn)制結(jié)果代表每對(duì)引物擴(kuò)增出的結(jié)果,將每個(gè)品種用50個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增出的結(jié)果串聯(lián)在一起,構(gòu)成每個(gè)品種特有的指紋信息。常規(guī)SSR引物在早稻品種鑒別中多樣性指數(shù)偏低,且參試早稻品種遺傳背景較為狹窄,很難找出某個(gè)品種能夠明顯區(qū)別于其他品種的含有特有指紋信息的某一個(gè)特征引物,于是利用全部50對(duì)引物的組合信息構(gòu)建2000年以后長(zhǎng)江流域主要栽培早稻品種的指紋圖譜(表2)。在引物較多的情況下,對(duì)于少數(shù)品種可以采用組合少量引物的方式區(qū)分。如對(duì)于本研究中的4份2000年以前通過(guò)審定的祖先品種,可以通過(guò)引物組合的方式找到其特征引物,如IR8可以通過(guò)RM3331和RM258的組合區(qū)別于其他品種;嘉育293可以通過(guò)RM208、RM552和RM583的組合區(qū)別于其他品種;浙輻802可以通過(guò)RM224、

RM552和RM3331的組合區(qū)別于其他品種;嘉育948可以通過(guò)RM209、RM493和RM7102的組合區(qū)別于其他品種。

表1 50對(duì)SSR標(biāo)記在62份水稻品種中的引物多態(tài)性信息Table 1．Polymorphism information of 50 SSR loci in 62 rice varieties．

圖2 標(biāo)記RM208在62份材料中電泳擴(kuò)增等位基因特征Fig．2．Alleles feature of marker RM208 in 62 rice varieties．

表2 利用50對(duì)引物構(gòu)建的62份水稻品種的指紋信息Table 2．DNA fingerprinting of 62 rice varieties with 50 primers．

續(xù)表2

2．4 聚類分析

根據(jù)SSR分子標(biāo)記所檢測(cè)到的154個(gè)多態(tài)性片段,利用NTSYS-pc V2．10e軟件對(duì)62份材料進(jìn)行聚類分析,得到樹(shù)狀聚類圖(圖3)。利用Jaccard系數(shù)計(jì)算62個(gè)水稻品種的遺傳相似系數(shù),得到相似系數(shù)矩陣。由聚類圖可看出,品種間的遺傳變異較小,遺傳相似系數(shù)變化范圍為0．66～1．00,表明參試早稻品種之間遺傳多樣性較狹窄。

其中,遺傳相似系數(shù)最大的是嘉育253和中冷23,二者相似系數(shù)為1,表明這50對(duì)SSR并未檢測(cè)出這兩個(gè)品種之間的差異。遺傳相似系數(shù)最小的是湘早143和中選056,說(shuō)明這兩個(gè)品種之間遺傳差異較大,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。當(dāng)相似系數(shù)為0．73時(shí),可以大致將浙江省育成的早稻品種與其他省份育成品種分成兩組。從審定年份來(lái)看,在2000年以前通過(guò)審定的4個(gè)品種IR8、浙輻802、嘉育293和嘉育948與2000年后通過(guò)審定的品種的遺傳相似系數(shù)的范圍分別是0．59～0．77、0．61～0．85、0．60～0．88和0．65～0．90。隨著年份的推移,遺傳相似系數(shù)越來(lái)越大,在一定程度上符合系譜中育種選擇的進(jìn)程;而2005年通過(guò)浙江省審定、2006年通過(guò)國(guó)家審定的高產(chǎn)早稻品種嘉育253與其衍生品種的相似系數(shù)分別為0．72(嘉育140)、0．75(早秈788)、0．79(中組7號(hào))、0．80(早秈615)、0．87(中早39)、0．89(甬秈975)、0．88(嘉早311)、0．91(中早35)、0．94(中嘉早32)、0．94(中嘉早17)、0．96(臺(tái)早518)、0．96(嘉育67)和1(中冷23),相似系數(shù)均較高,并且中早35、中早39和中嘉早17也是農(nóng)業(yè)部冠名的超級(jí)稻示范推廣品種,這說(shuō)明嘉育253在早稻育種過(guò)程中是重要的骨干親本。

3 討論

圖3 62個(gè)水稻品種的聚類分析Fig．3．Dendrogram of genetic similarity among 62 rice varieties．

系譜信息在育種工作中有重要的參考價(jià)值,以系譜為線索研究品種群體,對(duì)重要基因的來(lái)源有很好的追蹤。目前,利用分子標(biāo)記對(duì)不同作物家系有很多研究。Sun等[34]利用RAPD分子標(biāo)記結(jié)合家系的系譜信息研究了45個(gè)馬鈴薯的遺傳多樣性,結(jié)果表明基于分子標(biāo)記得到的遺傳相似性的聚類結(jié)果,并不能完全符合家系的信息,可能是由于來(lái)自相同親緣的家系受到嚴(yán)格的選擇而出現(xiàn)分化。

從系譜關(guān)系圖和聚類分析圖可以看出(圖1,圖3),目前早稻的主栽品種親緣關(guān)系十分相近,相互滲透,尤其是浙江省內(nèi)的品種,很難明確劃分為幾個(gè)類群,這可能是由于不同育種單位或育種者在早稻品種的選育過(guò)程中總體目標(biāo)一致,且對(duì)少數(shù)骨干親本重復(fù)利用。并且基于遺傳相似性的聚類結(jié)果并不能與系譜關(guān)系完全吻合(圖1,圖3),這可能是由于育種過(guò)程中的隨機(jī)誤差所造成的。從遺傳相似系數(shù)來(lái)看,通過(guò)審定的早稻品種之間年份越接近,系譜中的親緣關(guān)系越近,相似系數(shù)越高,一定程度上符合育種選擇的進(jìn)程。

目前,利用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定的研究和應(yīng)用越來(lái)越多,充分體現(xiàn)出了該方法的優(yōu)越性。本研究所用50對(duì)SSR引物在62份早稻品種中多態(tài)信息含量(PIC)普遍偏低,這可能是由于這些早稻品種本身屬于秈稻亞群,且在早稻育種過(guò)程中,育種者的目標(biāo)一致,選用的親本組合血緣關(guān)系相近,導(dǎo)致主要栽培品種遺傳基礎(chǔ)狹窄,多樣性下降[35-36],容易造成對(duì)逆境反應(yīng)的遺傳脆弱性[33]。并且國(guó)標(biāo)“新標(biāo)準(zhǔn)”中的引物代表性不足,多態(tài)性對(duì)這些早稻品種不完全適用?？傮w而言,在水稻品種DNA指紋鑒別上,至今未能形成一個(gè)廣適性的標(biāo)準(zhǔn)。究其原因,可能有以下兩個(gè)方面:一是研究中選用的樣本數(shù)少、來(lái)源地窄,導(dǎo)致獲得的核心SSR標(biāo)記的代表性不足,往往只能用于當(dāng)?shù)仄贩N鑒別,一旦擴(kuò)大到其他區(qū)域或增加品種數(shù)量時(shí),便出現(xiàn)核心SSR標(biāo)記并不核心的現(xiàn)象[16];二是我國(guó)絕大多數(shù)水稻品種間的遺傳基礎(chǔ)窄,尤其是不同省內(nèi)審定的適用于特定生態(tài)區(qū)內(nèi)種植的品種[19],遺傳多樣性更低,這導(dǎo)致基于不同生態(tài)區(qū)間的品種研發(fā)的多態(tài)性SSR標(biāo)記在一些省內(nèi)審定品種間沒(méi)有多態(tài)性[33]。所以針對(duì)早稻品種的特殊分子標(biāo)記如SNP等標(biāo)記亟待發(fā)掘和應(yīng)用。在沒(méi)有適用性好的特殊引物時(shí),我們可以采取用足夠多的分子標(biāo)記來(lái)構(gòu)建指紋圖譜的策略。

在今后的研究中應(yīng)該開(kāi)發(fā)更多秈稻亞屬內(nèi)差異的分子標(biāo)記,尤其是早秈稻特有的分子標(biāo)記,并將分子標(biāo)記與形態(tài)特征相結(jié)合,形成信息更完善、準(zhǔn)確的指紋圖譜。

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Analysis of Genetic Similarity and Construction of DNA Fingerprinting for Conventional Double Cropping Early Rice Varieties in the Yangtze River Basin

DAI Dongqing＃,ZHANG Huali＃,ZHANG Meng,LI Ximing,MA Liangyong?
(China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China;＃These authors contributed equally to this work;?Corresponding author,E-mail:maliangyong＠caas．cn)

【Objective】To provide a reference for rice variety identification and parents selection,we constructed fingerprints of conventional early rice varieties and analyzed its genetic similarity．【Method】Conventional early rice varieties registered at or above the provincial level since 2000 in the Yangtze River Basin were analyzed using 50 pairs of SSR primers with high polymorphism,good stability,and even distribution on 12 chromosomes of rice to construct SSR fingerprints of conventional early rice．Cluster analysis was conducted with NTSYS PC Version 2．10e software and UPGMA cluster analysis method．【Results】A total of 154 polymorphic bands were detected among 62 rice lines．Two to six alleles were detected for each marker with an average of 3．08．Primers polymorphism information content(PIC) value ranged from 0．03 to 0．75,with an average of 0．36．Cluster analysis with NTSYS PC Version 2．10e software showed that the genetic similarities ranged from 0．66 to 1．00．The 62 varieties could be divided into two groups as varieties in Zhejiang Province and varieties outside the province at the similarity coefficient of 0．73 with small difference between groups．【Conclusion】Combination with the pedigree relationship,it was revealed that the genetic background of early rice varieties in this study was relatively narrow．

early rice;pedigree;DNA fingerprinting;clustering analysis

S511.032;S511.2+1

A

1001-7216(2017)01-0040-10

2016-08-01;修改稿收到日期:2016-09-24。

國(guó)家863計(jì)劃資助項(xiàng)目(2014 AA10A604-15);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31501288);浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LQ16C130002);浙江省高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)多抗水稻新品種選育(9410計(jì)劃)資助項(xiàng)目(2012C12901-2);中國(guó)水稻研究所中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2014RG003-3)。