測(cè)試片法快速檢測(cè)乳品中的菌落總數(shù)

梁春梅，喻東威，吳玉秋，劉曉川，薛志清，解鑫，趙媛，許璐，扎木則仁

（1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司中心實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特011500；2.北京安普生化科技有限公司北京100027）

測(cè)試片法快速檢測(cè)乳品中的菌落總數(shù)

梁春梅1，喻東威1，吳玉秋1，劉曉川2，薛志清1，解鑫1，趙媛1，許璐1，扎木則仁1

（1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司中心實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特011500；2.北京安普生化科技有限公司北京100027）

通過(guò)用快速菌落總數(shù)測(cè)試片法與國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行對(duì)比,從而對(duì)快速菌落總數(shù)測(cè)試片的準(zhǔn)確性、特異性、靈敏度、穩(wěn)定性等各項(xiàng)性能進(jìn)行評(píng)估，并驗(yàn)證了快速菌落總數(shù)測(cè)試片與國(guó)標(biāo)方法（GB 4789.2-2010）檢測(cè)結(jié)果的一致性。結(jié)果表明，快速菌落總數(shù)測(cè)試片計(jì)數(shù)更簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，縮短了檢測(cè)時(shí)間，24 h即可對(duì)樣品進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

快速菌落總數(shù)測(cè)試片;國(guó)標(biāo)法;乳制品

0 引言

菌落總數(shù)測(cè)試片是美國(guó)3M公司生產(chǎn)的一預(yù)先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng),在食品企業(yè)中該系列產(chǎn)品作為微生物日常檢測(cè)的方法，已經(jīng)廣泛用于食品、飲料及相關(guān)行業(yè)的微生物檢測(cè)；

快速菌落總數(shù)測(cè)試片是培養(yǎng)基中含有作為載體的冷水可溶性凝膠及雙聯(lián)指示劑，使測(cè)試片中的菌落顯不同顏色。比傳統(tǒng)的方法能縮短時(shí)間（24 h即可對(duì)樣品進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)），且觀察結(jié)果更簡(jiǎn)便，有助于提高微生物實(shí)驗(yàn)質(zhì)量和提高工作效率。

本文將快速菌落總數(shù)測(cè)試片法和國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行對(duì)比，考察在檢測(cè)乳制品樣品時(shí)兩種方法是否存在顯著性差異，為乳品企業(yè)更好的應(yīng)用該產(chǎn)品提供有效數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與設(shè)備

生乳80份、奶粉90份、冰激凌10份、純牛奶（加標(biāo)）份、奶酪20份、酸性產(chǎn)品（加標(biāo)）20份，其中加標(biāo)是指添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)菌株的產(chǎn)品。

標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希氏菌（cicc0389）,金黃色葡萄球菌（cicc21600）。

3MPetrifil mTM快速菌落總數(shù)測(cè)試片，平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基。

生物安全柜,恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 方法

所有樣品均以快速菌落總數(shù)測(cè)試片法和國(guó)標(biāo)法同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，其中快速菌落總數(shù)測(cè)試片法培養(yǎng)時(shí)間為24 h（奶粉除外，要求培養(yǎng)48 h），國(guó)標(biāo)法為48 h。

接種標(biāo)準(zhǔn)菌株新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯中36℃培養(yǎng)18～24 h，上述培養(yǎng)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水制成每1 mL含菌數(shù)為1～1 000 mL-1的菌懸液，備用。

1.3 測(cè)定方法

(1)樣品試驗(yàn),本試驗(yàn)對(duì)235個(gè)樣品進(jìn)行對(duì)比。按照國(guó)標(biāo)GB4789.2-2010方法對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度采用測(cè)試片法和國(guó)標(biāo)法分別進(jìn)行試驗(yàn)。測(cè)試片法需36℃培養(yǎng)24 h（奶粉樣品需培養(yǎng)48 h），國(guó)標(biāo)方法需36℃培養(yǎng)48 h，記錄菌落數(shù)量。

(2)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)抽取1個(gè)批次的生乳樣品采用國(guó)標(biāo)法和測(cè)試片法同時(shí)檢測(cè)，分別由不同人員，在不同時(shí)間進(jìn)行檢驗(yàn)，分別做20組平行實(shí)驗(yàn)。

(3)定量限試驗(yàn),在檢驗(yàn)范圍的低限制備5份不同含菌濃度的樣品，每份不同含菌濃度的樣品分別用測(cè)試片法和國(guó)標(biāo)法進(jìn)行不少于5次檢驗(yàn)，采用統(tǒng)計(jì)方法比較替代方法的檢驗(yàn)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法結(jié)果的差異。

(4)線性試驗(yàn),選擇5個(gè)濃度的樣品，每個(gè)濃度至少測(cè)定5次。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以檢驗(yàn)結(jié)果為因變量，以樣品中微生物的預(yù)期數(shù)量為自變量進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r。替代方法的相關(guān)系數(shù)不得低于0.95。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

將菌落計(jì)數(shù)結(jié)果轉(zhuǎn)化成常用對(duì)數(shù)值后，對(duì)每類樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)對(duì)數(shù)平均偏差進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)以確定不同方法之間微生物菌落總數(shù)是否有顯著性差異。重復(fù)性試驗(yàn)用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行分析，也可用F檢驗(yàn)計(jì)算得出不同方法的重復(fù)性差異。對(duì)線性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品實(shí)驗(yàn)

本研究采用試片法和國(guó)標(biāo)方法對(duì)6種乳制品產(chǎn)品，共235個(gè)樣品進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定比對(duì)，結(jié)果分別采用spss軟件對(duì)樣品菌落總數(shù)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)分析如下：

分析結(jié)果可知兩種方法檢測(cè)生乳、奶粉、冰激凌、純牛奶、奶酪等樣品相關(guān)性分別為：0.963、0.955、0.98、0.984、0.994、0.989；兩種方法檢測(cè)結(jié)果具有良好的相關(guān)性，且方法之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取1個(gè)純牛奶樣品分裝試管，用其稀釋活化好的標(biāo)準(zhǔn)菌株（大腸埃希氏菌）稀釋至適宜范圍，分別用國(guó)標(biāo)方法和測(cè)試片法進(jìn)行計(jì)數(shù)，此適宜稀釋度做20個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 兩種方法精密度實(shí)驗(yàn)對(duì)比結(jié)果

AD判定標(biāo)準(zhǔn)：99%置信水平下AD<1.035，或95%置信水平下AD<0.752,則說(shuō)明系統(tǒng)服從正態(tài)性分布。

圖2 精密度實(shí)驗(yàn)正態(tài)性檢驗(yàn)

測(cè)試片法精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）為7.06%，國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為7.82%,兩種方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合要求（RSD%<15%）。從圖1可知測(cè)試片法重復(fù)檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法保持很好的一致性。

對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)分析（如圖2）得到AD=0.604，小于臨界值0.725（95%置信區(qū)間），系統(tǒng)服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)處于受控狀態(tài)。再對(duì)其兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗(yàn)和T檢驗(yàn)分析如下：

F檢驗(yàn)分析得出F計(jì)=0.751，F(xiàn)表（0.05，19，19）= 2.168，F(xiàn)計(jì)

t檢驗(yàn)分析得出t計(jì)=1.500，查表得出t表（0.05，38）= 2.024因t計(jì)

2.3 定量限實(shí)驗(yàn)

原奶樣品和奶粉樣品按照10倍梯度進(jìn)行稀釋，選取0 mL-1的樣品,1 mL-1的樣品,10 mL-1的樣品,20 mL-1的樣品,50 mL-1的樣品,采用測(cè)試片法和國(guó)標(biāo)方法分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。且對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如表1所示。

表1 成對(duì)樣本統(tǒng)計(jì)量

采用spss軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)分析如下：

由表1可知，采用不同方法對(duì)不同菌濃度的純牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，共得到90組數(shù)據(jù)，其中測(cè)試片法測(cè)得平均菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值為0.8424，標(biāo)準(zhǔn)差為0.73612，標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.14722；國(guó)標(biāo)方法測(cè)得平均菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值為 0.8700，標(biāo)準(zhǔn)差為 0.70881，標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.14176。

表2 成對(duì)樣本相關(guān)系數(shù)

由表2和表3可知，采用不同方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，其相關(guān)性為0.990，P>0.05,即不同菌濃度的純牛奶樣品用測(cè)試片法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)得菌落總數(shù)結(jié)果無(wú)顯著性差異，說(shuō)明測(cè)試片法的定量限檢測(cè)結(jié)果符合要求。

表3 成對(duì)樣本檢驗(yàn)

試驗(yàn)同時(shí)對(duì)1 mL-1左右的20組樣品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試片法和國(guó)標(biāo)方法檢出率均達(dá)到80%，測(cè)試片法檢測(cè)限為1 mL-1，靈敏度相當(dāng)于國(guó)標(biāo)方法。

2.4 線性實(shí)驗(yàn)

原奶樣品和奶粉樣品按照10倍梯度進(jìn)行稀釋，分

別選取1～10，10～30，30～100，100～200，200～300 mL-1的樣品采用測(cè)試片法和國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

用國(guó)標(biāo)法和測(cè)試片法進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果R=0.988，R2=0.976，調(diào)整R2=0.975，標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)誤差為0.12169。

表4 方差分析結(jié)果

表5 回歸系數(shù)

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸線性分析，結(jié)果如下。

表4“方差”分析中，“回歸”P值為0.000，如果“回歸”P值小于0.05是顯著的，因此建立的模型是可行的。表5“系數(shù)”中計(jì)算出的系數(shù)的概率值都是小于顯著性水平（P）0.05，說(shuō)明兩種方法回歸系數(shù)達(dá)到了顯著水平，因此得出測(cè)試片法和國(guó)標(biāo)方法具備相關(guān)性。由圖3可知相關(guān)系數(shù)R2=0.975，測(cè)試片法相關(guān)系數(shù)不低于0.95，因此測(cè)試片法測(cè)定菌落總數(shù)符合線性關(guān)系。

3 結(jié)論

圖3 3M測(cè)試片法和國(guó)標(biāo)法檢驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明快速菌落總數(shù)測(cè)試片法和國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)純牛奶、奶粉、酸性產(chǎn)品(包括酸酸乳、真果粒)、冰激凌等產(chǎn)品中的菌落總數(shù)，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）,準(zhǔn)確度、精密度、定量限、線性試驗(yàn)均符合要求；快速測(cè)試片法檢測(cè)奶粉樣品，48 h會(huì)有水化現(xiàn)象，與48 h菌落測(cè)試片相比水化程度有所改善，建議奶粉樣品24 h預(yù)讀數(shù)，再培養(yǎng)到48 h讀數(shù)。快速菌落總數(shù)測(cè)試片可用于酸性產(chǎn)品菌落總數(shù)測(cè)定，pH值大于4的酸性樣品不需要調(diào)節(jié)。

快速菌落總數(shù)測(cè)試片采用雙聯(lián)指示劑，使測(cè)試片中的菌落顯不同顏色計(jì)數(shù)更簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，并且相對(duì)傳統(tǒng)的測(cè)試片方法檢測(cè)時(shí)間為48h縮短至24 h，在更短的時(shí)間內(nèi)獲得樣品的測(cè)試結(jié)果，能更加迅速地采取有效的措施解決發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題，因此用于乳與乳制品中菌落總數(shù)的檢測(cè)可提高檢測(cè)效率。

[1]GB 4789.2-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[S].

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)，中國(guó)藥典（2010版）:藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則.中國(guó)醫(yī)藥技術(shù)出版社,2010（3）:340-345.

Petrifil mtest piece method o f rapid total colony nu mber count to detect the aer?abic p late count in dairy p roducts

LIANG Chunmei1，YU Dongwei1，WU Yuqiu1，LIU Xiaochuan2，XUE Zhiqing1，XIEXin1，ZHAO Yuan1，XU Lu1，Zhamuzeren1
（1.Inner Mongolia Meng N iu Dairy Products Co.,Ltd，Hohhot 010018，China；2.Beijing Anapure BioScientific Co., Ltd,Beijing 100027，China）

The test compared the Petrifilmtest piecemethod of rapid aerabic plate count and national standard method,evaluatedaccuracy, specificity,sensitivity,stability,and other performance attributesof the Petrifil mtest piecemethodof rapid aerabic plate count,and validated the consistency of test resultsof Petrifil mtest piecemethod of rapid aerabic p late count and the national standard method(GB 4789.2-2010). In the test results,the Petrifil mtest piecemethod of rapid aerabic plate count has si mpler colony-counting,more convenient operation,and shorter detection time;it only take 24 hours to start colony-counting.

Petrifil mtest piece;national standard method;dairy products

TS252.7

A

1001-2230（2017）01-0047-03

2016-09-28

國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)（2013YQ 14037108）。

梁春梅（1983-），女，工程師，從事食品檢測(cè)及分析工作。