多酶法提取葡萄皮渣中可溶性膳食纖維的研究

樊 柳，黃文書，張永忠

（1.新疆農業(yè)大學食品科學與藥學院，新疆烏魯木齊 830091；2.新疆九鼎農業(yè)集團有限公司，新疆烏魯木齊 830009）

多酶法提取葡萄皮渣中可溶性膳食纖維的研究

樊 柳1，2，*黃文書1，張永忠2

（1.新疆農業(yè)大學食品科學與藥學院，新疆烏魯木齊 830091；2.新疆九鼎農業(yè)集團有限公司，新疆烏魯木齊 830009）

以葡萄酒廠中的廢料——葡萄皮渣為主要原料，采用多酶法活化其中的膳食纖維，達到增加葡萄皮渣中可溶性膳食纖維含量的目的。經(jīng)過單因素試驗和正交試驗，發(fā)現(xiàn)酶活化葡萄皮渣可溶性膳食纖維的最佳反應條件為蛋白酶添加量0.3%，糖化酶和纖維素酶（混合酶）的最佳配比1∶4，混合酶添加量1.2%，混合酶酶解溫度60℃，混合酶酶解時間120 min。

葡萄皮渣；可溶性膳食纖維；提取

新疆地處葡萄種植的黃金區(qū)域（北緯30°～50°），在葡萄的生長季節(jié)，白天日照時間很長，有利于葡萄進行充分的光合作用；夜晚與白天的溫差較大，年均日溫差為14～16℃，非常利于葡萄品質和產量的提高，這些都不難看出，新疆的氣候條件十分適宜葡萄種植。2014年新疆葡萄種植面積達14.91×104hm2，總產量為213.6×104t（包括兵團在內）。而新疆葡萄酒的產區(qū)主要集中在鄯善、瑪納斯和石河子等地區(qū)。迄今為止，新疆葡萄酒的加工企業(yè)大約有20家，加工能力可以達到20×104t左右，大約占到全國葡萄酒總產量的34%[1]。

在葡萄酒的釀制過程中，經(jīng)過榨汁處理或發(fā)酵后的葡萄皮渣，大約占原果總質量的10%，這些皮渣主要以葡萄皮、籽、枝條為主。

目前，葡萄皮渣常見處理辦法是把其當做肥料或者飼料處理，這樣不僅造成了資源浪費，還污染了環(huán)境，而且資源的利用率也極低。因此合理開發(fā)利用葡萄皮渣，不僅可以提高產業(yè)的附加值，使其經(jīng)濟有效地利用資源，提高葡萄的綜合利用價值，還對促進葡萄產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的發(fā)展意義[2-7]。

膳食纖維（Dietary fibre，DF）指植物性食物中含有不能被人體消化吸收的碳水化合物，被營養(yǎng)家列于繼碳水化合物、蛋白質、脂肪、維生素、礦物質、水傳統(tǒng)六大營養(yǎng)素之后的“第七營養(yǎng)素”，是平衡膳食結構的必需營養(yǎng)素之一[8-9]。

膳食纖維不僅可以吸附膽固醇和其他有機化合物，而且可與鉛及其他有害離子交換，減少這些物質的吸收率，從而促使人體內的有毒物質、化學藥品等排出體外，可見膳食纖維具有降糖減肥、降脂和排毒等作用。因此，營養(yǎng)專家認為，膳食纖維食品將是在21世紀的主要食品之一[10-18]。

目前，我國對葡萄皮渣中提取膳食纖維的研究還處于起步階段，尤其對于膳食纖維的提取、檢測方法等方面的研究相對較少，現(xiàn)在一般使用的方法是堿法或者發(fā)酵法。但是，傳統(tǒng)的堿制備法受多種反應條件影響，導致成本較高，而且在實際生產操作過程中難度較大，不宜推廣使用，并且所使用的大量酸堿試劑在環(huán)保方面存在弊端。為此，試驗以葡萄皮渣為原料，利用多酶法對葡萄皮渣中膳食纖維進行提取研究，以期為葡萄皮渣提取膳食纖維的工藝和應用提供一定技術支持[19-25]。

1 試驗材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

試驗用葡萄皮渣，新疆張裕葡萄酒業(yè)提供。

1.1.2 試劑

糖化酶（活性10萬/g）、纖維素酶（活性1∶1 000）、蛋白酶（活性6萬/g），北京奧博星生物有限責任公司提供；95%乙醇、濃鹽酸，均為分析純。

1.1.3 儀器與設備

6202號小型粉碎機，北京興時利和設備有限公司產品；HH.S11-6型電熱恒溫水浴鍋，北京永光明機電設備有限公司產品；ML204型分析天平，梅特勒-托利多產品；R-1005型旋轉蒸發(fā)儀，鄭州長城儀器設備有限公司產品；TD5A-WS型臺式低速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司產品；LYJB300-S型電動分散攪拌器，上海翎羽機電設備有限公司產品；BPX-272型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱、GZX-9070MBE型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海博訊設備有限公司產品。

2 試驗方法

2.1 葡萄皮渣中膳食纖維的制備工藝流程

2.2 操作要點

2.2.1 葡萄皮的預處理

稱取一定量的葡萄皮渣，在60～70℃的干燥箱內干燥12 h，然后用粉碎機打成碎末，使用60目篩進行篩選，篩出來的粉末即為試驗用葡萄皮渣，收好后備用。

2.2.2 蛋白酶酶解

準確稱取2 g預處理后的葡萄皮渣（精確至0.000 1 g）放進錐形瓶中，然后按照1∶20的比例加入蒸餾水40 mL，調節(jié)pH值至7.0左右，再加入適量蛋白酶在水浴鍋中進行酶解90 min，水浴溫度50℃，隨后放在90℃水浴鍋中，滅酶5 min后取出，待冷卻到室溫備用。

2.2.3 糖化酶和纖維素酶酶解

經(jīng)過滅酶處理后的原料，調節(jié)pH值至5左右，再加入適量糖化酶和纖維素酶，置于60℃水浴鍋中酶解90 min，隨后置于90℃水浴鍋中滅酶5 min取出，冷卻至室溫。

2.2.4 醇沉

將冷卻至室溫后的物料，進行離心分離（轉速為4 000 r/min，時間為15 min），取上清液備用，將離心分離后的固體進行干燥后稱質量，即為不溶性膳食纖維。

將上清液用其4倍體積的95%乙醇進行醇沉10 h，之后再進行離心分離（轉速為4 000 r/min，時間為10 min），取所得到的固體經(jīng)干燥后稱質量，即為可溶性膳食纖維，將上清液進行回收。

2.3 各種營養(yǎng)成分的測定

水分的測定按照GB/T 5009.3—2003；灰分的測定按照GB/T 5009.4—2003；蛋白質的測定按照GB/T 5009.5—2003；脂肪的測定按照GB/T 5009.6—2003；總糖的測定按照GB/T 5009.7—2003。

2.4 試驗步驟

2.4.1 蛋白酶添加量對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響

準確稱取5份經(jīng)過預處理的葡萄皮渣，每份2.000 0 g，加20倍葡萄皮渣質量的蒸餾水，調節(jié)pH值到中性，再分別加入0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%的蛋白酶，然后按照2.2.3的工藝路線，考察蛋白酶添加量對可溶性膳食纖維得率的影響。

2.4.2 蛋白酶酶解時間對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響

準確稱取5份經(jīng)過預處理的葡萄皮渣，每份2.000 0 g，加20倍葡萄皮渣質量的蒸餾水，調節(jié)pH值到中性，再加入0.3%的蛋白酶，在60℃水浴鍋中，分別進行水解30，60，90，120，150 min然后取出，之后參照2.2.3的工藝路線，考察蛋白酶的酶解時間對可溶性膳食纖維得率的影響。

2.4.3 蛋白酶酶解溫度對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響

準確稱取5份經(jīng)過預處理的葡萄皮渣，每份2.000 0 g，加20倍葡萄皮渣質量的蒸餾水，調節(jié)pH值到中性，之后加入0.3%的蛋白酶，在50，60，70，80，90℃的水浴鍋中進行水解60 min后取出，之后按照2.2.3的工藝路線，考察蛋白酶酶解溫度對可溶性膳食纖維得率的影響。

2.4.4 混合酶配比對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響

準確稱取5份經(jīng)過預處理的葡萄皮渣，每份2.000 0 g，加20倍葡萄皮渣質量的蒸餾水，調節(jié)pH值到中性，之后加入0.3%的蛋白酶于60℃水浴鍋中進行水解90 min后，再放置于90℃水浴鍋中進行滅酶處理5 min。取出后冷卻到室溫，再加入1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5的糖化酶和纖維素酶混合酶，后參照2.2.3的工藝路線，考察糖化酶和纖維素酶混合酶的最佳配比對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響。

2.4.5 混合酶添加量對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響

準確稱取5份經(jīng)過預處理的葡萄皮渣，每份2.000 0 g，加20倍葡萄皮渣質量的蒸餾水，調節(jié)pH值到中性，之后加入0.3%的蛋白酶在60℃水浴鍋中進行水解90 min后，再放到90℃水浴鍋中進行滅酶5 min。取出冷卻到室溫后，按照1∶4的配比加入0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%糖化酶和纖維素酶混合酶，再參照2.2.3的工藝路線，考察糖化酶和纖維素酶混合酶最佳添加量對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響。

2.4.6 混合酶酶解時間對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響

準確稱取5份經(jīng)過預處理的葡萄皮渣，每份2.000 0 g，加20倍葡萄皮渣質量的蒸餾水，調節(jié)pH值到中性，之后加入0.3%的蛋白酶，在60℃水浴鍋中進行水解90 min后，再放入90℃水浴鍋中滅酶5 min。取出后冷卻到室溫，再加入糖化酶和纖維素酶混合酶（混合配比為1∶4），在60℃水浴鍋中分別水解30，60，90，120，150 min取出，再參照2.2.3的工藝路線，考察糖化酶和纖維素酶混合酶最佳酶解時間對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響。

2.4.7 混合酶酶解溫度對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響

準確稱取5份經(jīng)過預處理的葡萄皮渣，每份2.000 0 g，加20倍葡萄皮渣質量的蒸餾水，調節(jié)pH值到中性，之后加入0.3%的蛋白酶，在60℃水浴鍋中進行水解90 min后，再放置于90℃水浴鍋中水浴滅酶5 min。取出冷卻到室溫后，加入糖化酶和纖維素酶混合酶（混合配比為1∶4），分別在30，40，50，60，70℃的條件下進行水浴90 min取出，再按照2.2.3的工藝路線，考察糖化酶和纖維素酶混合酶最佳酶解溫度對可溶性膳食纖維得率的影響。

2.4.8 葡萄皮渣可溶性膳食纖維提取條件的優(yōu)化正交試驗

通過上述單因素試驗可以發(fā)現(xiàn)，蛋白酶添加量、糖化酶和纖維素酶的混合酶添加量以及混合酶酶解溫度和混合酶酶解時間對可溶性膳食纖維的影響比較大，所以選擇4個因素3個比較優(yōu)的水平進行正交試驗。

葡萄皮渣可溶性膳食纖維提取條件的正交試驗L9（34）因素與水平設計見表1。

正交試驗L9（34）因素與水平設計

表1 葡萄皮渣可溶性膳食纖維提取條件的

2.5 葡萄皮渣膳食纖維提取結果與分析

2.5.1 葡萄皮渣成分分析

葡萄皮渣的成分含量（質量分數(shù)W/W，%）見表2。

表2 葡萄皮渣的成分含量

2.5.2 提取葡萄皮渣可溶性膳食纖維的結果與分析

（1）蛋白酶添加量對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響。

蛋白酶添加量對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響見圖1。

圖1 蛋白酶添加量對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響

由圖1可知，隨著蛋白酶添加量的逐漸增加，可溶性膳食纖維的得率不斷增加。當?shù)鞍酌傅奶砑恿窟_到0.3%時，其中可溶性膳食纖維的得率可以達到4.95%，達到最高值；然后隨著蛋白酶添加量的不斷的增加，可溶性膳食纖維的得率卻不斷減少。對原因進行分析認為，蛋白酶可以有效地促使可溶性膳食纖維溶出，從而增加可溶性膳食纖維的提取含量；但是當?shù)鞍酌柑砑恿砍^0.3%后，反而不會有大量的細胞壁隨蛋白酶添加量增加而被降解，因而會使可溶性膳食纖維的聚合度降低，因此可溶性膳食纖維得率下降。所以，蛋白酶添加量以0.3%為最佳。

（2）蛋白酶酶解時間對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響。

蛋白酶酶解時間對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響見圖2。

由圖2可知，隨著蛋白酶酶解時間的不斷增加，可溶性膳食纖維的得率也不斷增加，當?shù)鞍酌该附鈺r間進行到60 min時，葡萄皮渣可溶性膳食纖維的得率最高達到4.28%；但是隨著蛋白酶酶解時間逐漸的增加，葡萄皮渣可溶性膳食纖維的得率卻不斷減少。分析后認為可能是因為葡萄皮渣內含有大量可溶性膳食纖維，蛋白酶的酶解時間過低時，葡萄皮渣可溶性膳食纖維進行的水解不完全；而蛋白酶的酶解時間過高時，膳食纖維中可溶性膳食纖維等活性生理物質進行分解，造成得率降低。所以，蛋白酶的酶解時間在60 min時最佳。

圖2 蛋白酶酶解時間對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響

（3）蛋白酶酶解溫度對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響。

蛋白酶酶解溫度對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響見圖3。

圖3 蛋白酶酶解溫度對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響

由圖3可知，隨著蛋白酶酶解溫度的不斷增加，可溶性膳食纖維的得率也不斷增加，當?shù)鞍酌傅拿附鉁囟冗_到50℃時，可溶性膳食纖維的得率達到最高為3.53%；隨著蛋白酶酶解時間的逐漸增加，可溶性膳食纖維的得率反而不斷減少。分析原因可能是因為蛋白酶在50℃左右的環(huán)境溫度下，活性達到最高，在其催化作用下葡萄皮渣可溶性膳食纖維的得率最高，提取效果也最好；根據(jù)酶促反應動力學的原理，當酶處于高于最適溫度的時候，隨著溫度不斷升高，酶會逐步變性，反應速度反而下降，最終導致提取含量降低。因此，蛋白酶酶解溫度以50℃為最佳。

（4）混合酶配比對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響。

混合酶配比對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響見圖4。

圖4 混合酶配比對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響

由圖4可知，隨著混合酶配比的不斷增加，葡萄皮渣膳食纖維的得率也在逐步增加。當混合配比在1∶4時，葡萄皮渣可溶性膳食纖維的得率達到最高值3.83%。這正是因為混合酶配比過低，糖分水解不完全，所以造成可溶性膳食纖維得率降低；而當混合酶配比過高時，葡萄皮渣膳食纖維易軟化，會造成膳食纖維和半膳食纖維發(fā)生輕度的水解，也最終會導致葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率降低。因此，糖化酶和纖維素酶混合酶配比在1∶4時最佳。

（5）混合酶添加量對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響。

混合酶添加量對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響見圖5。

圖5 混合酶添加量對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響

由圖5可知，隨著糖化酶和纖維素酶混合酶添加量的不斷增加，葡萄皮渣可溶性膳食纖維的得率不斷增加。當混合酶添加量在1%時，葡萄皮渣可溶性膳食纖維的得率達到最高為3.75%。這是因為當混合酶添加量過低時糖分水解不完全，易造成可溶性膳食纖維得率降低；而混合酶添加量過高，膳食纖維易軟化，會造成膳食纖維和半膳食纖維發(fā)生輕度水解，也會導致葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率降低。因此，糖化酶和纖維素酶混合酶最適添加量為1%時最佳。

（6）混合酶酶解時間對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響。

混合酶酶解時間對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響見圖6。

由圖6可知，隨著糖化酶和纖維素酶混合酶酶解時間的不斷增加，葡萄皮渣膳食纖維的得率也在逐漸增加。當酶解時間在90 min時，葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率達到最高值為6.18%。這是因為當酶解時間過短，糖類物質水解不完全；而酶解時間過長，提取液黏度增加，使纖維素溶出減少而得率降低。因此，糖化酶和纖維素酶混合酶酶解時間在90 min時為佳。

圖6 混合酶酶解時間對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響

（7）混合酶酶解溫度對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響。

混合酶酶解溫度對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響見圖7。

圖7 混合酶酶解溫度對葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的影響

由圖7可知，隨著糖化酶和纖維素酶混合酶酶解溫度的不斷增加，葡萄皮渣膳食纖維的得率也在逐漸增加。當酶解溫度在60℃時，其得率達到最高為4.02%；隨著酶解溫度的進一步的增加，葡萄皮渣膳食纖維的得率反而不斷減少。這是因為葡萄皮渣內含有大量糖類和不溶性纖維，當酶解溫度過低時，糖類和不溶性纖維水解不完全；而當酶解溫度過高，容易使葡萄皮渣膳食纖維中可溶性纖維素等活性生理物質分解，造成得率降低。所以，糖化酶和纖維素酶混合酶酶解溫度在60℃時為最佳。

（8）最佳提取工藝的確定及正交試驗結果與分析。

葡萄皮渣可溶性膳食纖維提取條件的L9（34）正交試驗結果見表3。

由表3正交試驗的極差R可知，各因素對提取效果影響的主次關系依次為D＞C＞B＞A，即混合酶酶解時間＞混合酶酶解溫度＞混合酶添加量＞蛋白酶添加量。確定提取葡萄皮渣可溶性膳食纖維的最佳方案為A2B3C2D3，即混合酶酶解時間120 min，混合酶酶解溫度60℃，混合酶添加量1.2%，蛋白酶添加量0.3%，通過試驗驗證其重復性較好。

3 討論

通過多酶法工藝來制備葡萄皮渣中膳食纖維，其最大的優(yōu)點是先通過蛋白酶分解葡萄皮渣中的蛋白質，然后再同時使用糖化酶和纖維素酶的混合酶來分解葡萄皮渣中的多糖，從而使可溶性膳食纖維溶出更多，而且采用多酶法工藝制備對膳食纖維損傷比較少，最終得到的膳食纖維色澤為淺黃色、純度也比較高。

表3 葡萄皮渣可溶性膳食纖維提取條件的L9（34）正交試驗結果

蛋白酶在試驗過程中主要起到分解葡萄皮渣中蛋白質的作用，纖維素酶主要作用是將皮渣中的纖維素轉化為葡萄糖，并且不斷降解不溶性膳食纖維，破壞其分子間結構，進一步促使不溶性膳食纖維轉化為可溶性膳食纖維，從而達到提高葡萄皮渣可溶性膳食纖維得率的目的。

在試驗過程中，采取糖化酶和纖維素酶同時加入，結果發(fā)現(xiàn)糖化酶和纖維素酶依次加入與糖化酶和纖維素酶同時加入對試驗的最終結果影響比較小，可忽略不計；而且糖化酶和纖維素酶同時加入，還可以縮短酶解的時間、節(jié)省試驗工序，因此將糖化酶和纖維素酶同時加入。

4 結論

在葡萄皮渣中提取可溶性膳食纖維，酶的添加量、混合酶酶解時間、混合酶酶解溫度、混合酶配比是影響其得率的主要因素。

通過正交試驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，混合酶酶解時間120 min，混合酶酶解溫度60℃，混合酶添加量1.2%，蛋白酶添加量0.3%時，為多酶法提取葡萄皮渣中可溶性膳食纖維的最優(yōu)方案。

目前，膳食纖維正逐漸成為食品和銷售的重要構成部分，可溶性膳食纖維因其性能優(yōu)良、使用便捷，已逐步成為食品行業(yè)的寵兒，其市場所占比例一直呈上升趨勢。當前，世界老齡化人口問題非常嚴重，而在老齡化人群中常見的高血壓、高血脂、便秘、癌癥等都或多或少與纖維攝入量不足有關系。而我國的老年人口總數(shù)居世界之最，據(jù)統(tǒng)計局相關數(shù)據(jù)表明，截至2015年末，我國60周歲及以上老年人口已經(jīng)多達2.22億人，占到全國總人口的16.1%，因此大量研究、開發(fā)適宜老年人的食品，特別是種類多樣化的纖維食品，是今后食品工業(yè)發(fā)展的方向之一。

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Extraction of Soluble Dietary Fiber from Grape Skin Study on the Application of Yogurt Products

FAN Liu1，2，*HUANG Wenshu1，ZHANG Yongzhong2

（1.College of Food Science and Pharmacy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang 830091，China；2.Xinjiang Jiuding Agricultural Group Co.，Ltd.，Urumqi，Xinjiang 830009，China）

In this paper，a by-product wine plant grape pomace as the raw material，using multi enzyme method in which activation of dietary fiber，increased soluble dietary fiber from grape pomace（SDF）content.By single factor and orthogonal experiment，obtained activation grape pomace（SDF） optimum reaction conditions for protease addition the enzyme is 0.3%，glucoamylase and cellulase（mixed enzyme）the optimum ratio，enzyme dosage，enzymolysis temperature，enzymatic hydrolysis time is 1∶4，1.2%，60℃，soluble dietary fiber and 120 min.

grape skin dregs；soluble dietary fiber；extraction

TS209

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.007

1671-9646（2017）01a-0023-06

2016-11-18

樊 柳（1986— ），女，在讀碩士，研究方向為食品工程。

*通訊作者：黃文書（1975— ），女，博士，教授，研究方向為農產品加工與貯藏。