高效液相色譜-熒光檢測法測定淀粉制品中孔雀石綠隱形孔雀石綠殘留量的研究

范芳芳，樊 成，石旭東，伊 昕

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，陜西西安 710048）

高效液相色譜-熒光檢測法測定淀粉制品中孔雀石綠隱形孔雀石綠殘留量的研究

范芳芳，樊 成，石旭東，伊 昕

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，陜西西安 710048）

采用高效液相色譜-熒光檢測的方法檢測粉條等淀粉制品中孔雀石綠和隱形孔雀石綠的殘留量；通過乙腈提取、氮吹濃縮、酸性氧化鋁小柱凈化的方法分離出淀粉制品中的目標物；通過C18-ODS柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）（柱后接25%的二氧化鉛氧化柱），以乙腈與0.1 mol/L的乙酸銨緩沖溶液（用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.5）體積比80∶20為緩沖液，實現(xiàn)孔雀石綠和隱形孔雀石綠的分離。于波長588 nm和618 nm處測定2種物質(zhì)的質(zhì)量濃度在0.3～8.0 μg/mL線性關(guān)系良好，相對偏差（n=7）小于2.5%，檢出限為0.08 μg/mL，分析時間為20 min。以粉條為基體進行回收試驗，回收率為77.9%～89.5%。

高效液相色譜-熒光檢測；孔雀石綠；隱形孔雀石綠；淀粉制品

孔雀石綠（C23H25N2，Malachite green，MG） 是一類合成的三苯基甲烷類化學物質(zhì)[1-2]，常作為防腐劑、殺菌劑、驅(qū)蟲劑在水產(chǎn)中使用[3]，用來預防和治療各類水產(chǎn)動物的水霉病、鍶霉病和小瓜蟲病等[4]?？兹甘G及其代謝物（Leucomalachite green，LMG）具有極強的毒性，其官能團三苯甲基可引起肝癌，因此被國際癌癥研究機構(gòu)列為第2類致癌物質(zhì)[5]。由于孔雀石綠的廉價性，其使用范圍又被擴大。近年來，有不良商販為了使粉條看起來顏色鮮綠，增加賣點，將孔雀石綠作為染色劑在制作粉條等淀粉制品的過程中加入。2015年，曾有地方食藥局查獲這樣一批粉條，加之在一定條件下，孔雀石綠和隱形孔雀石綠會互相轉(zhuǎn)化，因此建立粉條等淀粉制品中孔雀石綠和隱形孔雀石綠殘留的提取及檢測方法迫在眉睫。

目前，國內(nèi)外關(guān)于水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物提取檢測方法的研究[6-11]很多，但對于淀粉制品中MG和LMG的提取檢測尚未見報道。水產(chǎn)動物屬于生物體，在對MG和LMG殘留的提取上存在穿透細胞、去除蛋白[2]等雜質(zhì)的技術(shù)難點，而淀粉制品不存在這些問題。經(jīng)過查閱大量參考文獻及反復的試驗，研究最終通過用乙腈反復提取、氮吹至近干、乙腈重新溶解后過酸性氧化鋁小柱凈化，最后收集全部流出液，再用氮吹儀吹至近干，用乙腈溶解殘渣并定容，通過C18-ODS柱（5 μm，4.6 mm×250 mm） （柱后接25%的二氧化鉛氧化柱），以乙腈與0.1 mol/L的乙酸銨緩沖溶液（pH值為4.5）體積比80∶20為緩沖液，實現(xiàn)孔雀石綠和隱形孔雀石綠的分離。該法具有操作簡單、定量性好、回收率穩(wěn)定等特點。

1 試驗部分

1.1 材料與試劑

孔雀石綠（草酸鹽）標準品和隱形孔雀石綠標準品，均為德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司提供，其純度分別為95%和98%，生產(chǎn)批號分別為20201和30103；乙腈，色譜純，德國默克公司提供；試驗用水為超純水，所用試劑除指定外均為分析純。

孔雀石綠標準儲備液（100 μg/mL），準確稱取0.01 g孔雀石綠（草酸鹽）標準品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容；隱形孔雀石綠標準儲備液（100 μg/mL），準確稱取0.01 g隱形孔雀石綠的標準品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容；量取約5.0 g不含孔雀石綠和隱形孔雀石綠的粉條粉碎樣于50 mL容量瓶中，量取一定量乙腈進行混勻，經(jīng)超聲、離心后取上清液得到基質(zhì)溶液。用儲備液和基質(zhì)溶液配置一系列質(zhì)量濃度的標準工作溶液，于4℃的冰箱中冷藏保存；配制0.1 mol/L的乙酸胺溶液，并用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值為4.5，供流動相用。

1.2 儀器與設(shè)備

2998 TDQ型高效液相色譜儀配有二聯(lián)泵、柱溫箱、UV2487型檢測器、Waters色譜工作站，美國Waters產(chǎn)品；HP5016SY型氮吹儀，上海濟成儀器廠產(chǎn)品；TG16-NS型離心機，湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品；KQ-250DE型超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；JA1003N型天平，上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.3 色譜條件

色譜柱：Waters C18-ODS柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm），柱后接25%的二氧化鉛氧化柱；柱溫25℃；流速1.0 mL/min；流動相：乙腈與0.1 mol/L的乙酸銨緩沖溶液（pH值為4.5）體積比為80∶20；進樣量20 μL；檢測波長588 mm和618 mm。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品提取

取一定量的粉條樣品，用打磨機將其打磨至粉末狀。稱取5.00 g粉條磨碎樣于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，劇烈振搖30 s，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心10 min，取上清液于潔凈試管中；然后向50 mL離心管中加入15 mL乙腈，重復上述操作，合并乙腈層至試管中。

1.4.2 樣品凈化

將盛有提取液試管放置含有水浴鍋的氮吹儀上，在45℃的條件下氮吹至近干，加入2.5 mL乙腈溶解殘渣。將酸性氧化鋁小柱放置在固相萃取裝置上，用5 mL乙腈活化，將試管中的溶液轉(zhuǎn)移至小柱中，用2.5 mL乙腈洗滌試管2次，洗滌液依次過柱，并控制流速，使其緩緩流下，收集全部流出液，于45℃條件下氮吹至近干，殘渣用1 mL乙腈溶解，過0.45 μm濾膜，按色譜條件進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準色譜圖

通過比較Agilent的C18型柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm）與Waters-ODS的C18型柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm）分離情況發(fā)現(xiàn)，后者對目標物的分離效果好、基線平穩(wěn)、雜峰干擾少。在波長分別為588 nm和618 nm時，孔雀石綠和隱形孔雀石綠分別在5.053 min和17.149 min時響應值最大。

5 μg/mL混合標準色譜見圖1。

圖1 5 μg/mL混合標準色譜

2.2 流動相的選擇

試驗中色譜分離的難點是孔雀石綠與周圍雜質(zhì)峰的分離程度。通過研究流動相的組成以及各種梯度的淋洗發(fā)現(xiàn)，乙腈與0.1 mol/L的乙酸銨緩沖溶液（pH值為4.5）體積比為80∶20時，可實現(xiàn)孔雀石綠和隱性孔雀石綠與其周圍雜質(zhì)峰的完全分離，且分離所需時間最短，為20 min。

流動相組成對目標物峰型的影響見表1。

表1 流動相組成對目標物峰型的影響

2.3 線性關(guān)系和檢出限

在色譜條件下，分別對所配置的孔雀石綠和隱形孔雀石綠的系列混合標準溶液進行測定。以峰面積A對質(zhì)量濃度C（μg/mL）進行線性回歸。

線性回歸方程和線性范圍見表2。

表2 線性回歸方程和線性范圍

孔雀石綠和隱形孔雀石綠檢出限均為0.08 μg/mL。

2.4 精密度試驗

在色譜條件下，用5.0 μg/mL孔雀石綠、隱形孔雀石綠混合標準溶液進樣，每次20 μL，重復進樣6次，得孔雀石綠和隱形孔雀石綠的相對標準偏差分別為0.8%和1.3%，均小于2.5%。

2.5 回收率

以不含孔雀石綠和隱形孔雀石綠的粉條為樣品，采用標準加入法進行回收試驗。

回收試驗結(jié)果（n=7）見表3。

表3 回收試驗結(jié)果（n=7）

由表3可知，孔雀石綠的回收率整體高于隱形孔雀石綠，但是對于同種目標物質(zhì)，回收試驗時其加入的質(zhì)量與回收率并無直接關(guān)系。

2.6 樣品分析

分別從市場購買多批粉條、粉絲以及粉帶等淀粉制品，按上述方法在色譜條件下進行測定，并用外標法定量。結(jié)果表明，這些產(chǎn)品的殘留量均小于0.08 μg/mL。

3 結(jié)論與展望

通過研究淀粉制品中MG和LMG殘留的檢測方法，建立了以乙腈溶解、氮吹濃縮以及酸性氧化鋁

小柱凈化的提取方法，并用高效液相色譜-熒光檢測器的方法進行測定。該法具有穩(wěn)定性好、重現(xiàn)度高、定量性好以及檢出限低等優(yōu)點。在今后的試驗中，應進一步對試驗中各個因素進行研究，并且提高回收率。

[1]李寧.孔雀石綠對健康的影響 [J].國外醫(yī)學（衛(wèi)生學分冊），2005，32（5）：262-264.

[2]翟毓秀，郭瑩瑩，耿霞，等.孔雀石綠的代謝機理及生物毒性研究進展 [J].中國海洋大學學報（自然科學版），2007，37（1）：27-32.

[3]Gouvello R L，Pobel T，Richards R H，et al.Field efficacy of a 10-day treatment of fumagillin against proliferative kidney disease in rainbow trout Oncorhynchus mykiss[J]. Aquaculture，1999，171（1）：27-40.

[4]Fred J Foster，Lowell Woodbury.The use of malachite green as a fish fungicide and antiseptic[J].North American Journal of Aquaculture，1936，3（18）：7-9.

[5]田秀慧，于召強，陳瑋，等.超高相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)苗種中孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠[J].食品科學，2013，34（12）：171-177.

[6]龍洲雄，萬春花，胡海山，等.高效液相色譜快速測定水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其無色產(chǎn)物的殘留量 [J].理化檢驗（化學分冊），2010（4）：368-370.

[7]宮向紅，徐英江，任傳博，等.HPLC測定水產(chǎn)品中孔雀石綠、亞甲基藍、結(jié)晶紫及其代謝物的殘留量 [J].食品科學，2012，33（4）：144-147.

[8]任秀蓮，魏琦峰，程春萍，等.高效液相色譜測定水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留量的研究進展 [J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17（1）：173-176.

[9]Motomizu S，Wakimoto T，T?ei K.Spectrophotometric determination of phosphate in river waters with molybdate and malachite green[J].Analyst，1983，108（1 284）：3 227.

[10]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 19857—2005水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定 [S].北京：中國標準出版社，2005.

[11]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T 1479—2004進出口水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量檢測方法 [S].北京：中國標準出版社，2004.◇

Study on Extracting Malachite Green and Leucomalachite Green in Starch Products by HPLC-FLD

FAN Fangfang，F(xiàn)AN Cheng，SHI Xudong，YI Xin
（Shaanxi Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Xi'an，Shaanxi 710048，China）

High performance liquid chromatography（HPLC）coupled with fluorescence detection（FLD）is developed for the detection of malachite green and leucomalachite green from starch products such as vermicelli.The sample is extracted with acetonitrile and purified by nitrogen and passing through SPE column of acidic aliminum oxide.The C18-ODS column 5 μm，4.6 mm×250 mm is used as the stationary phase（link with oxygen column of 25%lead dioxide），and solutions of acetonitrile and 0.1 mol/L ammonium acetate（adjusted to pH 4.5 with glacial acetic acid）mixed by the volume ration of 80∶20 are used as the mobile phase in gradient elution.Linear relationships between values of peak area and mass concentration of the 2 compounds are found in the same range of 0.3～8.0 μg/mL，with their detection limits less than 0.08 μg/mL.Array diode detection at 588 nm and 618 nm is adopted.Values of relative standard deviation（RSD）for the 2 compounds are all less than 2.5%.The time of this method is last for 20 min.Some of starch products are analyzed by this method，and test for recovery is calculated in the range of 77.9%～89.5%.

HPLC-FLD；malachite green；leucomalachite green；starch products

S948

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.021

1671-9646（2017）01a-0074-03

2016-11-11

范芳芳（1987— ），女，碩士，研究方向為食品安全與檢測。