阿立哌唑?qū)β25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)PC12細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制

楊淑珍，趙晶媛（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院精神七科，河南新鄉(xiāng) 453002）

阿立哌唑?qū)β25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)PC12細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制

楊淑珍＊，趙晶媛#（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院精神七科，河南新鄉(xiāng) 453002）

目的：研究阿立哌唑?qū)β淀粉樣蛋白（Aβ25-35）誘導(dǎo)的神經(jīng)PC12細(xì)胞損傷的影響及其機(jī)制。方法：將PC12細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組、模型組（20 μmol/LAβ25-35）和阿立哌唑低、中、高濃度組（5、10、20 μmol/L阿立哌唑+20 μmol/LAβ25-35），加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，每組6個(gè)復(fù)孔。MTT法檢測細(xì)胞活力（光密度值），Hoechst染色法檢測細(xì)胞凋亡情況，分光光度法檢測細(xì)胞中天冬氨酸特異性蛋白酶3（Caspase-3）、Caspase-9活性，Western blot法檢測細(xì)胞中B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）蛋白表達(dá)及蛋白激酶B（Akt）磷酸化水平。結(jié)果：與正常對照組比較，模型組細(xì)胞光密度值降低，凋亡率增加，Caspase-3、Caspase-9活性和Bax蛋白表達(dá)均增強(qiáng)，Bcl-2、PI3K蛋白表達(dá)和Akt磷酸化水平均降低（P＜0.01）。與模型組比較，阿立哌唑低、中、高濃度組細(xì)胞光密度值增加，凋亡率減少，Caspase-3、Caspase-9活性減弱，Bcl-2、PI3K蛋白表達(dá)和Akt磷酸化水平均增加；阿立哌唑中、高濃度組細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)減弱（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：阿立哌唑可明顯抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，其作用可能與激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

阿立哌唑；Aβ淀粉樣蛋白；神經(jīng)PC12細(xì)胞；凋亡；磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）又稱老年癡呆癥，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、行為及活動(dòng)能力下降或異常。其中腦內(nèi)及海馬區(qū)Aβ淀粉樣蛋白（Amyloid β-protein，Aβ）沉積是AD主要病理變化之一，已成為AD治療藥物的主要靶點(diǎn)之一[1-2]。PC12細(xì)胞是來源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的一種常用的神經(jīng)細(xì)胞，其形態(tài)、結(jié)構(gòu)及生化功能與神經(jīng)元類似，常作為研究神經(jīng)細(xì)胞生長、凋亡、發(fā)育及功能的細(xì)胞培養(yǎng)模型。Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型已被廣泛使用于AD等神經(jīng)性疾病的探討研究[3-4]。阿立哌唑是一種非典型抗精神病藥物，能通過激活多巴胺受體改善精神分裂癥狀及抑郁癥。同時(shí)臨床研究證實(shí)，阿立哌唑單獨(dú)用藥或者聯(lián)用其他非典型抗精神病藥物對AD患者療效顯著[5-6]?；A(chǔ)研究也證實(shí)，阿立哌唑?qū)C12細(xì)胞活力或者1-甲基-4-苯基吡啶離子（MMP+）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有顯著影響[7-8]，但具體作用機(jī)制尚未見報(bào)道。所以，本研究擬以Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，探討阿立哌唑的抗損傷作用及具體機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；ChemiDocTMXRS型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；AF6000型熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 藥品與試劑

阿立哌唑口腔崩解片（浙江大冢制藥有限公司，批號：140910A，規(guī)格：5 mg/片）；Aβ25-35（美國Sigma公司，批號：A4559，純度：＞95%）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（批號：P0010）、小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）、Hoechst染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；兔抗B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化（p-）Akt單克隆抗體（美國Epitmics公司）；天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、Caspase-9活性檢測試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）。

1.3 細(xì)胞

大鼠神經(jīng)PC12細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。

2 方法

2.1 分組與給藥

按文獻(xiàn)[9-11]方法將試驗(yàn)分為正常對照組、模型組（20 μmol/L Aβ25-35）和阿立哌唑低、中、高濃度組（5、10、20 μmol/L阿立哌唑+20 μmol/LAβ25-35），加入含相應(yīng)藥物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，每組6個(gè)復(fù)孔。

2.2 細(xì)胞活力的檢測

將處于生長對數(shù)期的PC12細(xì)胞消化，調(diào)細(xì)胞密度為5×103mL－1，接種于96孔板，每孔200 μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。按“2.1”項(xiàng)下分組給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加MTT（5 mg/mL）20 μL，4 h后棄上清，并每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL培養(yǎng)10 min。用酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定光密度（OD值），以此評價(jià)細(xì)胞活力。

2.3 細(xì)胞凋亡的檢測

將融合度為80%的PC12細(xì)胞消化，調(diào)細(xì)胞密度為1×104mL－1，接種于6孔板，每孔1 mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，按“2.1”項(xiàng)下分組給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后按照Hoechst染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，固定，顯微鏡下觀察細(xì)胞核，發(fā)亮發(fā)白即是凋亡細(xì)胞。利用Image J軟件計(jì)算各組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率（%）。

2.4 細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活性的檢測

將融合度為80%的PC12細(xì)胞消化，調(diào)細(xì)胞密度為1×104mL－1，接種于6孔板，每孔1 mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。按“2.1”項(xiàng)下分組給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后按照Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀于405 nm波長處測定吸光度，計(jì)算活性。

2.5 凋亡相關(guān)因子和PI3K/Akt信號通路相關(guān)因子的檢測

將融合度為80%的PC12細(xì)胞消化，調(diào)細(xì)胞密度為1×104mL－1，接種于6孔板，每孔1 mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。按“2.1”項(xiàng)下分組給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液，裂解30 min。以離心半徑為15 cm、10 000 r/min離心10 min，收獲蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白樣品煮沸變性10 min，上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉凝膠電泳1～2 h，濕法轉(zhuǎn)膜30～40 min，加入一抗（兔抗Bax、Bcl-2、PI3K、Akt、p-Akt單克隆抗體，小鼠抗GAPDH單克隆抗體，稀釋比例均為1∶100）孵育，4℃過夜。漂洗后，加入二抗[HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L），稀釋比例均為1∶500]，室溫孵育1～2 h。漂洗并滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）液后，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光，用Quantity One軟件統(tǒng)計(jì)各抗體條帶灰度值。以Bcl-2、Bax、PI3K與GADPH灰度值的比值表示對應(yīng)蛋白的相對表達(dá)量，以p-Akt與Akt灰度值的比值表示Akt的磷酸化水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞活力的測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞的OD值降低（P＜0.01）。與模型組比較，阿立哌唑各濃度組細(xì)胞的OD值均增加（P＜0.01）。與阿立哌唑低濃度組比較，阿立哌唑中、高濃度組細(xì)胞的OD值均增加（P＜0.01）；與阿立哌唑中濃度組比較，阿立哌唑高濃度組細(xì)胞的OD值增加（P＜0.01）。各組細(xì)胞活力的測定結(jié)果見表1。

3.2 細(xì)胞凋亡率的測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.01）。與模型組比較，阿立哌唑各濃度組細(xì)胞凋亡率減少（P＜0.05或P＜0.01）。與阿立哌唑低濃度組比較，阿立哌唑中、高濃度組細(xì)胞凋亡率減少（P＜0.01）；與阿立哌唑中濃度組比較，阿立哌唑高濃度組細(xì)胞凋亡率減少（P＜0.01）。各組細(xì)胞凋亡情況的Hoechst染色圖見圖1，凋亡率測定結(jié)果見表1。

表1 各組細(xì)胞活力和凋亡率的測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1 Results of cell viability and apoptotic rate in each group（±s，n＝6）

表1 各組細(xì)胞活力和凋亡率的測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1 Results of cell viability and apoptotic rate in each group（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與阿立哌唑低濃度組比較，ΔΔP＜0.01；與阿立哌唑中濃度組比較，▲▲P＜0.01Note：vs.normal control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.aripiprazole low-concentration group，ΔΔP＜0.01；vs.aripiprazole medium-concentration group，▲▲P＜0.01

組別正常對照組模型組阿立哌唑低濃度組阿立哌唑中濃度組阿立哌唑高濃度組細(xì)胞凋亡率，% 5.38±0.54 38.46±2.54＊＊27.72±2.56#17.48±1.74##ΔΔ9.59±0.98##ΔΔ▲▲OD值0.67±0.06 0.34±0.03＊＊0.43±0.05##0.52±0.05##ΔΔ0.63±0.06##ΔΔ▲▲

圖1 各組細(xì)胞凋亡情況（Hoechst染色，×200）Fig1 Cell apoptosis in each group（Hoechst staining，×200）

3.3 細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活性的測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活性增強(qiáng)（P＜0.01）。與模型組比較，阿立哌唑各濃度組細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活性減弱（P＜0.05或P＜0.01）。與阿立哌唑低濃度組比較，阿立哌唑中、高濃度組細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活性減弱（P＜0.01）；與阿立哌唑中濃度組比較，阿立哌唑高濃度組細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活性減弱（P＜0.01）。各組細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活性的測定結(jié)果見表2。

3.4 細(xì)胞中Bax、Bcl-2、PI3K蛋白表達(dá)和Akt磷酸化水平的測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞中Bcl-2、PI3K蛋白表達(dá)減弱，Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)，p-Akt/Akt降低（P＜0.01）。與模型組比較，阿立哌唑各濃度組細(xì)胞中Bcl-2、PI3K蛋白表達(dá)增強(qiáng)和p-Akt/Akt增加，阿立哌唑中、高濃度組細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)減弱（P＜0.05或P＜0.01）。與阿立哌唑低濃度組比較，阿立哌唑中、高濃度組細(xì)胞中Bcl-2、PI3K蛋白表達(dá)增強(qiáng)和p-Akt/Akt增加，Bax蛋白表達(dá)減弱（P＜0.01）；與阿立哌唑中濃度組比較，阿立哌唑高濃度組細(xì)胞中Bcl-2、PI3K蛋白表達(dá)增強(qiáng)和p-Akt/ Akt增加，Bax蛋白表達(dá)減弱（P＜0.01）。各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、PI3K蛋白表達(dá)及Akt磷酸化水平的電泳圖見圖2，測定結(jié)果見表3。

表2 各組細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活性的測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 Results of the activities of Caspase-3 and Caspase-9 in cell of each group（±s，n＝6）

表2 各組細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活性的測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 Results of the activities of Caspase-3 and Caspase-9 in cell of each group（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與阿立哌唑低濃度組比較，ΔΔP＜0.01；與阿立哌唑中濃度組比較，▲▲P＜0.01Note：vs.normal control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.aripiprazole low-concentration group，ΔΔP＜0.01；vs. aripiprazole medium-concentration group，▲▲P＜0.01

組別正常對照組模型組阿立哌唑低濃度組阿立哌唑中濃度組阿立哌唑高濃度組Caspase-9 0.29±0.02 2.38±0.24＊＊1.95±0.20#1.23±0.12##ΔΔ0.74±0.07##ΔΔ▲▲Caspase-3 0.48±0.04 3.27±0.30＊＊2.72±0.26##2.08±0.20##ΔΔ1.23±0.13##ΔΔ▲▲

圖2 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、PI3K蛋白表達(dá)及Akt磷酸化水平的電泳圖Fig 2 Electrophoresis of protein expressions of Bax，Bcl-2 and PI3K and the phosphorylation of Akt in cell of each group

表3 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、PI3K蛋白表達(dá)及Akt磷酸化水平的測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 3 Determination results for protein expressions of Bax，Bcl-2 and PI3K and the phosphorylation ofAkt in cell of each group（±s，n＝6）

表3 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、PI3K蛋白表達(dá)及Akt磷酸化水平的測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 3 Determination results for protein expressions of Bax，Bcl-2 and PI3K and the phosphorylation ofAkt in cell of each group（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與阿立哌唑低濃度組比較，ΔΔP＜0.01；與阿立哌唑中濃度組比較，▲▲P＜0.01Note：vs.normal control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.aripiprazole low-concentration group，ΔΔP＜0.01；vs.aripiprazole medium-concentration group，▲▲P＜0.01

組別正常對照組模型組阿立哌唑低濃度組阿立哌唑中濃度組阿立哌唑高濃度組p-Akt/Akt 0.83±0.08 0.08±0.01＊＊0.19±0.02##0.37±0.03##ΔΔ0.38±0.03##ΔΔBax/GADPH 0.15±0.01 1.34±0.13＊＊1.32±0.05 0.88±0.09##ΔΔ0.40±0.04##ΔΔ▲▲Bcl-2/GADPH 1.29±0.12 0.21±0.02＊＊0.37±0.03#0.93±0.10##ΔΔ1.14±0.10##ΔΔ▲▲PI3K/GADPH 0.62±0.06 0.18±0.01＊＊0.30±0.03##0.41±0.04##ΔΔ0.42±0.37##ΔΔ

4 討論

本研究首先通過MTT法檢測阿立哌唑?qū)β25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的影響，結(jié)果表明阿立哌唑能濃度依賴性地提高PC12細(xì)胞活力，進(jìn)一步的Hoechst染色結(jié)果也證實(shí)阿立哌唑能抵抗Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，由此提示阿立哌唑能抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)細(xì)胞存活。

細(xì)胞凋亡由多種信號通路所調(diào)控，PI3K/Akt信號通路就是其中之一，具有“抗凋亡通路”之稱。當(dāng)PI3K被激活后，可促使3，4-二磷酸脂酰肌醇（PIP2）轉(zhuǎn)化為3，4，5-三磷酸脂酰肌醇（PIP3），后者招募并激活A(yù)kt，活化的Akt通過磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白如Bax、Bcl-2及Caspase表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等過程。Bcl-2是最常見的抑凋亡蛋白，能與促凋亡蛋白Bax形成異源二聚體，從而作用于線粒體膜上，促進(jìn)細(xì)胞色素C及Caspase-3與Caspase-9的釋放，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。已有研究證實(shí)，Aβ能促使神經(jīng)元細(xì)胞Bcl-2表達(dá)減弱、Bax表達(dá)增強(qiáng)，使Bcl-2/Bax比值降低[12]；同時(shí)Aβ25-35可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)下調(diào)、Bax表達(dá)上調(diào)、Caspase-3活性增強(qiáng)[10，13]；另外Aβ可降低AD大鼠腦組織中PI3K/Akt信號通路活性，并伴隨著Caspase-3活性的增強(qiáng)[14]。而Xian YF等[15]、劉玲等[10]報(bào)道PI3K/Akt信號通路的激活可以拮抗Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。因此本研究進(jìn)一步探討阿立哌唑?qū)β25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路激活情況，Bax、Bcl-2表達(dá)量及Caspase-3、Caspase-9活性的影響，結(jié)果表明，阿立哌唑能顯著上調(diào)PI3K及Bcl-2表達(dá)，提高Akt磷酸化水平，降低Bax表達(dá)及Caspase-3、Caspase-9活性。這提示阿立哌唑可通過激活PI3K/Akt信號通路，調(diào)節(jié)信號通路下游凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)或活性，進(jìn)而改善Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷。

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（編輯：鄒麗娟）

Effects of Aripiprazole on PC12 Cell Injury Induced by Aβ25-35and Its Mechanism

YANG Shuzhen，ZHAO Jingyuan（Dept.Seven of Psychiatry，the Second Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Henan Xinxiang 453002，China）

OBJECTIVE：To study the effects of aripiprazole on PC12 cell injury induced by amyloid β-protein（Aβ25-35）and its mechanism.METHODS：PC12 cells were randomized into normal control group，model group（20 μmol/L Aβ25-35），aripiprazole low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups（5，10，20 μmol/L aripiprazole+20 μmol/L Aβ25-35）.These groups were cultured with culture medium containing relevant medicine for 48 h，with 6 wells in each group.The viability（optical density value）of PC12 cell was measured by MTT assay，and PC12 cell apoptosis was measured by Hoechst staining.The activities of Caspase-3 and Caspase-9 were determined by spectrophotometry.The protein expression of Bcl-2，Bax and PI3K and the phosphorylation of Akt were assayed by Western blot assay.RESULTS：Compared with normal control group，optical density value of model group was decreased while apoptotic rate was increased；the activities of Caspase-3 and Caspase-9，and the protein expression of Bax were increased；the protein expression of Bcl-2 and PI3K，the phosphorylation of Akt were decreased（P＜0.01）.Compared with model group，optical density value of aripiprazole low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups were increased，while apoptotic rate and the activities of Caspase-3 and Caspase-9 were decreased；the protein expression of Bcl-2 and PI3K and the phosphorylation of Akt were enhanced；while the protein expression of Bax were decreased in aripiprazole medium-concentration and high-concentration groups（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Aripiprazole can suppress cell apoptosis of PC12 cell induced by Aβ25-35，which is related to activating PI3K/Akt signal pathway.

Aripiprazole；Amyloid β-protein；Nerve PC12 cell；Apoptosis；PI3K/Akt signal pathway

R361+.3

A

1001-0408（2017）01-0053-05

2016-04-23

2016-06-17）

＊主治醫(yī)師，碩士。研究方向：神經(jīng)病學(xué)。E-mail：jsprincess11@ 163.com

#通信作者：副主任醫(yī)師，碩士。研究方向：精神病學(xué)。電話：0373-3373606

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.14