水飛薊素腸溶聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒在大鼠在體腸灌流模型及Caco-2細胞模型中的吸收研究Δ

何 靜，邱妍川，楊延音，林鳳云，劉松青，江尚飛，朱照靜#（1.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校繼續(xù)教育學(xué)院，重慶 4011；.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，重慶 4011；.第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶40008）

水飛薊素腸溶聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒在大鼠在體腸灌流模型及Caco-2細胞模型中的吸收研究Δ

何 靜1＊，邱妍川2，楊延音2，林鳳云2，劉松青3，江尚飛2，朱照靜2#（1.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校繼續(xù)教育學(xué)院，重慶 401331；2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，重慶 401331；3.第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶400038）

目的：研究水飛薊素腸溶聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米粒在大鼠在體腸灌流模型及結(jié)腸腺癌Caco-2細胞模型中的吸收特性。方法：采用高效液相色譜法測定水飛薊素含量，考察水飛薊素混懸液、水飛薊素PLGA納米粒和水飛薊素腸溶PLGA納米粒在大鼠在體腸灌流模型十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的吸收速率常數(shù)（Ka）和表觀吸收系數(shù)（Kapp）及其含低、中、高質(zhì)量濃度（20、40、60 μg/mL）水飛薊素時在Caco-2細胞模型中的表觀滲透系數(shù)（Papp）。結(jié)果：與水飛薊素混懸液比較，水飛薊素PLGA納米粒和水飛薊素腸溶PLGA納米粒在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的Ka、Kapp均增加（P＜0.05）；與對應(yīng)濃度水飛薊素混懸液比較，含低、中、高質(zhì)量濃度水飛薊素的腸溶PLGA納米粒和PLGA納米粒在Caco-2細胞模型中的雙向Papp均增加（P＜0.05），其中水飛薊素的腸溶PLGA納米粒與PLGA納米粒間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：水飛薊素腸溶PLGA納米?？捎行г黾铀w薊素腸內(nèi)吸收及Caco-2細胞攝取和跨膜轉(zhuǎn)運速率。

水飛薊素；腸溶聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒；在體腸灌流模型；結(jié)腸腺癌Caco-2細胞；吸收

水飛薊素（Silymarin）是從菊科植物水飛薊中提取精制而成的一類具有抗肝炎病毒活性的黃酮類化合物的總稱，臨床上廣泛用于急慢性病毒性肝炎、藥源性肝損傷、肝硬化等多種肝臟疾病的治療[1]。水飛薊素主要由水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊寧和水飛薊亭等組成，其中水飛薊賓及其異構(gòu)體異水飛薊賓含量最高，約占該化合物的60%～70%，且具有最強的藥理活性[2]。但是，由于水飛薊素難溶于水，口服生物利用度很低，嚴(yán)重影響了其臨床療效的發(fā)揮和在臨床的應(yīng)用。已有研究顯示，其大鼠口服給藥后的絕對生物利用度約為0.95%[3]。

目前，市售水飛薊素多為片劑或膠囊劑，患者用藥劑量較大，需每天使用1.2～1.5 g。筆者前期采用納米沉淀法以羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯（HPMCP）為腸溶材料、聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）為載體制備了水飛薊素腸溶PLGA納米粒和水飛薊素PLGA納米粒，結(jié)果顯示，水飛薊素腸溶PLGA納米粒的穩(wěn)定性較好，能有效抑制水飛薊素在人工胃液中的釋放[4]。本試驗通過大鼠在體腸灌流模型及結(jié)腸腺癌Caco-2細胞模型，進一步評價其吸收特性。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010C HT高效液相色譜儀（日本Shimdazu公司）；倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；超速離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；MK3酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）；EVOM2上皮細胞電壓電阻儀（美國WPI公司）；康寧3412Transwell系統(tǒng)（美國康寧公司）。

1.2 藥品與試劑

水飛薊素對照品（西安瑞林生物科技有限公司，批號：130802，純度：＞98%）；水飛薊素腸溶PLGA納米粒和水飛薊素PLGA納米粒（重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥劑學(xué)實驗室自制，批號：均為20140801，含量：53.15 mg/g）；水飛薊素片（商品名：益肝靈片，沈陽東陵藥業(yè)股份有限公司，批號：130302，規(guī)格：每片38.5 mg）；0.25%胰蛋白酶（美國Amresco公司）；胎牛血清（FBS，美國Hyclone公司）；DMEM培養(yǎng)基、非必需氨基酸、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）、HBSS緩沖液（美國Gibco公司）；甲醇、乙腈為色譜純，水為去離子水。

1.3 細胞株與動物

Caco-2細胞株由美國組織培養(yǎng)中心提供。SD大鼠，♂，體質(zhì)量為220～250 g，由重慶大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號為SCXK（渝）2014-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 水飛薊素含量測定方法

2.1.1 色譜條件與專屬性試驗 色譜柱：Dikma-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸液（35∶65，V/V），流速：1 mL/min；檢測波長：288 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。該色譜條件下，取水飛薊素對照品、結(jié)腸空白灌流液、空腸灌流液和給藥30 min后細胞樣品進樣測定。水飛薊賓和異水飛薊賓的出峰時間分別為16.2、17.9 min，以兩者峰面積之和進行水飛薊素含量的計算，其他輔料不影響水飛薊素的含量測定。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.2 腸灌流液中水飛薊素的測定 精密稱取水飛薊素對照品10.2 mg，用甲醇超聲溶解，用空白K-R緩沖液[5]稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.102、0.204、0.51、2.04、10.2、20.4 μg/mL的系列溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)進行回歸分析，得回歸方程為y＝332 578.6x+496.6（r＝0.999 8），水飛薊素檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.102～20.4 μg/mL。取0.204、2.04、10.2 μg/mL的水飛薊素系列溶液同日內(nèi)進樣5次，連續(xù)進樣3 d考察日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果日內(nèi)、日間RSD均小于2%。方法回收率為98.55%～100.26%（RSD＝4.15%，n＝3），37℃下2.5 h內(nèi)穩(wěn)定性試驗的RSD＝5.68%（n＝5）?？瞻仔∧c段黏膜層與空白灌流液稀釋所得的水飛薊素系列溶液在37℃條件下孵育2 h后取樣測定，RSD＝6.32%（n＝5）。

2.1.3 細胞樣品中水飛薊素的測定 取甲醇溶解的水飛薊素溶液，用HBSS緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.102、0.204、0.51、2.04、10.2、20.4 μg/mL的系列溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)進行回歸分析，得回歸方程為y＝456 635x+752.1（r＝0.999 9），水飛薊素檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.102～20.4 μg/mL。取0.204、2.04、10.2 μg/mL的水飛薊素系列溶液同日內(nèi)進樣5次，連續(xù)進樣3 d考察日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果日內(nèi)、日間RSD均小于2%，方法回收率為99.62%～100.22%（RSD＝3.45%，n＝3）。

2.2 大鼠在體腸灌流試驗

SD大鼠禁食12 h后，以0.9%戊巴比妥鈉麻醉并固定，照文獻[5]報道的方法進行手術(shù)和藥物灌流。各考察腸段（包括十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸）均取約10 cm進行試驗，于試驗結(jié)束后剪下試驗?zāi)c段測量長度和半徑。分別考察質(zhì)量濃度為100 μg/mL的水飛薊素腸溶PLGA納米粒、水飛薊素PLGA納米粒、水飛薊素混懸液（水飛薊素片以去離子水重新分散）灌流后，水飛薊素在不同腸段的吸收情況，采用質(zhì)量法校正灌流液體積，計算3種樣品在各腸段的吸收速率常數(shù)（Ka）和表觀吸收系數(shù)（Kapp）。采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩兩比較采用方差分析。3種樣品在大鼠在體腸灌流模型中Ka、Kapp的測定結(jié)果見表1。

表1 3種樣品在大鼠在體腸灌流模型中Ka、Kapp的測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1 Kaand Kappof 3 samples in rat in situ intestinesmodel（±s，n＝6）

表1 3種樣品在大鼠在體腸灌流模型中Ka、Kapp的測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1 Kaand Kappof 3 samples in rat in situ intestinesmodel（±s，n＝6）

注：與水飛薊素混懸液比較，＊P＜0.05Note：vs.silymarin suspension，＊P＜0.05

參數(shù)Ka，×10－2L/s Kapp，×10－4cm/s水飛薊素PLGA納米粒5.37±1.62＊4.29±1.63＊3.59±1.54＊3.26±1.35＊14.08±5.98＊8.96±3.64＊8.21±3.59＊6.92±3.74＊腸段十二指腸空腸回腸結(jié)腸十二指腸空腸回腸結(jié)腸水飛薊素混懸液1.68±0.82 1.22±0.65 0.98±0.44 0.67±0.32 5.25±1.69 2.68±1.09 2.31±1.22 1.65±1.03水飛薊素腸溶PLGA納米粒5.45±1.55＊4.33±1.48＊3.62±1.29＊3.58±1.22＊14.39±4.62＊10.28±2.57＊8.44±2.48＊6.58±2.52＊

由表1結(jié)果顯示，與水飛薊素混懸液比較，水飛薊素腸溶PLGA納米粒與水飛薊素PLGA納米粒在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的Ka、Kapp均增加（P＜0.05），但二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?？梢?，將水飛薊素制備成為PLGA納米粒后，可明顯增加其在腸道的吸收。

2.3 Caco-2細胞模型雙向轉(zhuǎn)運試驗

2.3.1 Caco-2細胞模型的建立 參考文獻[6]進行Caco-2細胞培養(yǎng)，采用倒置顯微鏡觀察細胞接種培養(yǎng)23 d后細胞單分子層的形態(tài)。結(jié)果顯示，細胞呈緊密單層，邊界清晰，并且在細胞間形成了良好的緊密連接，細胞跨膜電阻＞600 Ω/cm2。采用普萘洛爾轉(zhuǎn)運試驗[7]測得細胞的表觀滲透系數(shù)（Papp）為（28.57±0.25）×10－6cm/s，表明本試驗建立的Caco-2細胞模型有緊密的細胞單分子層，具有較好的完整性和滲透性，滿足試驗需要。Caco-2細胞形態(tài)圖見圖2。

圖2 Caco-2細胞形態(tài)圖（×400）Fig 2 Caco-2 cellular morphology（×400）

2.3.2 質(zhì)量濃度的選擇 采用MTT法測定水飛薊素對Caco-2細胞的毒性，結(jié)果顯示，水飛薊素質(zhì)量濃度在20～100 μg/mL范圍內(nèi)其吸光度無突然下降的現(xiàn)象，表明在該范圍內(nèi)給藥對Caco-2細胞無毒性。本試驗選擇水飛薊素質(zhì)量濃度為20、40、60 μg/mL的水飛薊素腸溶PLGA納米粒、水飛薊素PLGA納米粒、水飛薊素混懸液進行試驗。

2.3.3 雙向轉(zhuǎn)運試驗 取水飛薊素腸溶PLGA納米粒、水飛薊素PLGA納米粒和水飛薊素片粉末，以HBSS緩沖液分散稀釋，分別制備成低、中、高質(zhì)量濃度（20、40、60 μg/mL）的供試液。在腸腔側(cè)（AP）→基底側(cè)（BL）的轉(zhuǎn)運試驗中，于AP側(cè)加入供試液0.5 mL，BL側(cè)加入HBSS緩沖液1.5 mL；BL→AP的轉(zhuǎn)運試驗中，于BL側(cè)加入供試液1.5 mL，AP側(cè)加入HBSS緩沖液0.5 mL。37℃條件下振搖孵育，分別于10、20、30、45、60、90、120 min吸取接收液0.1 mL測定，同時加入等量HBSS緩沖液于Transwell板中，試驗完成后，測定跨膜電阻以保證細胞膜完整性。計算3種樣品在Caco-2細胞中的累積吸收量（AP→BL）、累積分泌量（BL→AP）和Papp，以Papp（BL→AP）與Papp（AP→BL）的比值計算外排比率（ER），結(jié)果見表2。

表2 不同質(zhì)量濃度的3種樣品在Caco-2細胞中累積吸收量、分泌量、Papp和ER的測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab 2 Accumulative absorption volume，secretory volume，Pappand ER of different concentrations of 3 samples in Caco-2 cell（±s，n＝3）

表2 不同質(zhì)量濃度的3種樣品在Caco-2細胞中累積吸收量、分泌量、Papp和ER的測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab 2 Accumulative absorption volume，secretory volume，Pappand ER of different concentrations of 3 samples in Caco-2 cell（±s，n＝3）

注：與同質(zhì)量濃度的水飛薊素混懸液比較，＊P＜0.05Note：vs.silymarin suspension with corresponding concentration，＊P＜0.05

ER 1.02 1.04 1.04 1.02 0.97 1.06 0.96 0.92 1.01樣品水飛薊素腸溶PLGA納米粒水飛薊素PLGA納米粒水飛薊素混懸液質(zhì)量濃度，μg/mL 20 40 60 20 40 60 20 40 60累積吸收量，μg 4.85±0.08＊9.58±0.25＊14.57±0.59＊4.33±0.11＊9.85±0.45＊14.03±1.33＊1.33±0.03 2.89±0.56 4.08±1.03累積分泌量，μg 5.22±0.09＊10.33±0.21＊14.85±1.28＊4.52±0.18＊9.03±0.84＊4.22±1.56＊1.26±0.05 2.69±0.84 4.21±0.99 Papp，×10－6cm/s BL→AP 9.64±0.58＊9.52±0.69＊9.31±0.78＊9.22±0.64＊9.46±0.89＊9.04±1.06＊3.22±0.15 3.65±0.11 3.59±0.18 AP→BL 9.86±0.76＊9.88±0.48＊9.67±0.62＊9.45±0.47＊9.15±1.08＊9.62±1.57＊3.09±0.18 3.35±0.21 3.63±0.25

由表2可知，與同質(zhì)量濃度水飛薊素混懸液比較，含低、中、高質(zhì)量濃度水飛薊素的腸溶PLGA納米粒和PLGA納米粒在Caco-2細胞模型中的雙向Papp均增加（P＜0.05），其中水飛薊素的腸溶PLGA納米粒與PLGA納米粒間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?？梢姡瑢⑺w薊素制備成為PLGA納米粒后，可明顯增加其細胞轉(zhuǎn)運的Papp。

3 討論

水飛薊素作為肝疾病的輔助用藥廣泛應(yīng)用于臨床，其不僅可有效保護肝細胞，拮抗肝纖維化，近年來越來越多的研究顯示其還具有除肝保護作用以外的藥理效應(yīng)，在抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等方面都具有良好的研發(fā)和臨床應(yīng)用前景[8-10]，故進一步開發(fā)穩(wěn)定性好、毒性小、制備工藝簡單的新型水飛薊素給藥系統(tǒng)具有很好的臨床實用價值[11-12]。

從本試驗所得的Kapp與Papp均可以看出，將水飛薊素制備為PLGA納米粒之后，可顯著改善其體內(nèi)的溶解性和滲透性，有利于增加其口服給藥的生物利用度。此外，本研究還對不同劑量水飛薊素制劑在Caco-2細胞模型中的雙向轉(zhuǎn)運進行考察，結(jié)果顯示，其雙向轉(zhuǎn)運可能與劑量無關(guān)，提示水飛薊素在體內(nèi)主要以被動擴散為主進行吸收，且ER均接近1，表明其吸收過程可能不受外排轉(zhuǎn)運蛋白的影響，但具體情況需進一步研究確定[13-14]。

PLGA是目前開發(fā)最為成功的一種生物可降解聚合物，具有較好的生物相容性，可用于多種藥物制劑的處方，包括親水性、疏水性藥物，也包括各種大分子或小分子藥物，可有效延緩藥物在體內(nèi)的釋放，降低藥物在體內(nèi)的代謝速度以及實現(xiàn)藥物的靶向給藥[15-16]。從本研究結(jié)果看，將水飛薊素制備為腸溶PLGA納米粒或PLGA納米粒后，可有效改善其吸收特征。與水飛薊素PLGA納米粒比較，預(yù)計水飛薊素腸溶PLGA納米?？蓽p小水飛薊素對胃部的刺激，降低其胃部不良反應(yīng)的發(fā)生次數(shù)和程度。

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Study on the Absorption of Silymarin Enteric Coated-PLGA Nanoparticles in Rat in situ Intestine Perfusion Model and Caco-2 Cell Model

HE Jing1，QIU Yanchuan2，YANG Yanyin2，LIN Fengyun2，LIU Songqing3，JIANG Shangfei2，ZHU Zhaojing2（1.College of Extended Education，Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 401331，China；2.College of Pharmacy，Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 401331，China；3.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital to Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

OBJECTIVE：To study the absorption features of Silymarin enteric coated-polyllactic-co-glycolic acid（PLGA）nanoparticles in rat in situ intestine perfusion model and colonic adenoma Caco-2 cell model.METHODS：HPLC method was used to determine the content of silymarin.The absorption rate constant（Ka）and apparent absorption coefficient（Kapp）of Silymarin suspension，Silymarin PLGA nanoparticles and Silymarin enteric coated-PLGA nanoparticles were investigated in duodenum，jejunum，ileum and colon of rat in situ intestine perfusion model；the apparent permeability coefficient（Papp）of those drugs containing low-concentration，medium-concentration and high-concentration（20，40，60 μg/mL）of silymarin in Caco-2 cell model were also investigated.RESULTS：Compared with Silymarin suspension，Kaand Kappof Silymarin PLGA nanoparticles and Silymarin enteric coated-PLGA nanoparticles were all increased in duodenum，jejunum，ileum and colon（P＜0.05）；compared with the corresponding concentration Silymarin suspension，two-way Pappof Silymarin PLGA nanoparticles and Silymarin enteric coated-PLGA nanoparticles containing low-concentration，medium-concentration and high-concentration of silymarin were all increased in Caco-2 cell model（P＜0.05）；there was no statistical significance between Silymarin PLGA nanoparticles and Silymarin enteric coated-PLGA nanoparticles（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Silymarin enteric coated-PLGA nanoparticles can effectively increase the intestinal absorption，cellular uptake and transmembrane transport rate of silymarin.

Silymarin；Enteric coated-PLGA nanoparticle；in situ intestine perfusion model；Colonic adenoma Caco-2 cell；Absorption

R965

A

1001-0408（2017）01-0046-04

2016-04-05

2016-06-22）

（編輯：鄒麗娟）

重慶市科技攻關(guān)計劃項目（No.cstc2012ggyyjs10008）；重慶市醫(yī)學(xué)科研計劃項目（No.2012-2-256）

＊副教授，碩士。研究方向：緩控釋制劑。電話：023-61969212。E-mail：hejingt@126.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：制劑研究。電話：023-61969994。E-mail：zhaojing6271@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.12