基于熒光檢測(cè)技術(shù)的多花黑麥草EST-SSR指紋圖譜的構(gòu)建

劉歡，張新全，馬嘯，張瑞珍，何光武，潘玲，金夢(mèng)雅

（1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，成都 611130；2四川省草原工作總站，成都 610041）

基于熒光檢測(cè)技術(shù)的多花黑麥草EST-SSR指紋圖譜的構(gòu)建

劉歡1，張新全1，馬嘯1，張瑞珍2，何光武2，潘玲1，金夢(mèng)雅1

（1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，成都 611130；2四川省草原工作總站，成都 610041）

【目的】構(gòu)建基于EST-SSR熒光標(biāo)記的多花黑麥草（Lolium multiflorum Lam.）DNA指紋鑒定體系，為多花黑麥草品種鑒定提供高通量技術(shù)手段，為不同品種的合理應(yīng)用提供參考依據(jù)，有效保護(hù)農(nóng)民利益和育種權(quán)益?！痉椒ā坷帽硇托誀畈町惔蟮?個(gè)品種（特高Tetragold、長(zhǎng)江2號(hào)ChangjiangNo.2和阿伯德Aubade），通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳從200對(duì)EST-SSR引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好、擴(kuò)增穩(wěn)定的30對(duì)引物。在篩選出的每對(duì)引物5′端添加熒光標(biāo)記FAM后，采用毛細(xì)管法通過(guò)DNA分析儀檢測(cè)200個(gè)單株不同等位變異的擴(kuò)增片段，從30對(duì)EST-SSR引物中篩選出25對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定的熒光引物，建立基于高通量熒光SSR標(biāo)記的多花黑麥草品種鑒定體系。【結(jié)果】通過(guò)25對(duì)EST-SSR引物構(gòu)建的DNA指紋圖譜來(lái)進(jìn)行10個(gè)多花黑麥草材料的品種鑒定。25對(duì)EST-SSR引物共檢測(cè)到127個(gè)等位基因，等位變異擴(kuò)增片段長(zhǎng)度范圍為51—249 bp，每對(duì)引物可檢測(cè)到有效等位基因數(shù)為2—11個(gè)，特異等位基因最多可檢測(cè)到11個(gè)（N101），平均每對(duì)引物4.00個(gè)；多態(tài)性位點(diǎn)的比率范圍為33.33%—100.00%。平均PIC值為0.702，Shannon指數(shù)最大為3.322（N101），平均為1.929，基因多樣性指數(shù)變幅為0.159—0.500，平均0.318，可鑒別的材料數(shù)為0—10個(gè)；其中14對(duì)特征引物在10個(gè)品種（系）上可檢測(cè)出25個(gè)特異等位基因。綜合來(lái)看，引物N101在200對(duì)引物中鑒別效率最高，可直接將10個(gè)多花黑麥草品種（系）區(qū)分開，在長(zhǎng)江2號(hào)、贛選1號(hào)和川農(nóng)2號(hào)上同時(shí)檢測(cè)出特異等位基因。但由于多花黑麥草在品種間與品種內(nèi)變異均較高，因此為鑒定更多材料，從25對(duì)引物中選擇了6對(duì)擴(kuò)增和檢測(cè)效果較好的引物（N54、N101、N146、N151、N154、N156），6對(duì)引物可檢測(cè)到的穩(wěn)定等位基因數(shù)均不小于19個(gè)，在達(dá)伯瑞和邦德上最多可檢測(cè)到22個(gè)等位基因。通過(guò)6對(duì)高效引物構(gòu)建了10個(gè)多花黑麥草品種（系）的DNA指紋圖譜，包括標(biāo)準(zhǔn)模式圖、圖譜代碼和圖譜QR編碼。首次利用EST-SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)，為10個(gè)多花黑麥草材料分別構(gòu)建了唯一的指紋代碼和QR編碼?！窘Y(jié)論】利用6對(duì)高效引物構(gòu)建了多花黑麥草SSR高通量鑒定體系，其中熒光引物N101多態(tài)性最高，可直接鑒別10個(gè)多花黑麥草品種（系）。

多花黑麥草；EST-SSR分子標(biāo)記；指紋圖譜；熒光檢測(cè)；毛細(xì)管電泳

0 引言

【研究意義】多花黑麥草（Lolium multiflorum Lam.）作為中國(guó)南方種植面積最大的一年生牧草，受到廣大農(nóng)牧民的關(guān)注[1]。在長(zhǎng)期引種、育種和選種的過(guò)程中，栽培范圍不斷擴(kuò)大，品種不斷增加，市場(chǎng)銷售的商品種子出現(xiàn)了同名異物、同物異名、多種混賣、種子不純等現(xiàn)象，阻礙了優(yōu)良品種推廣及應(yīng)用，嚴(yán)重危害了育種者和生產(chǎn)者的利益，因此，能有效地鑒定區(qū)別不同品種是合理利用多花黑麥草的前提條件之一?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，多花黑麥草品種常見的鑒定方法包括DUS鑒定法（distinctness，uniformity，stability）和DNA指紋圖譜鑒定法，但由于DUS鑒定成本高，且易受環(huán)境因素和人為測(cè)量因素影響[2-3]，因此，在不斷完善多花黑麥草 DUS測(cè)試指南的同時(shí)，DNA指紋圖譜在多花黑麥草的品種鑒定中的應(yīng)用也不可忽視[4]。國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV）已批準(zhǔn)在已有DNA指紋圖譜的基礎(chǔ)上[5]，DNA分子標(biāo)記技術(shù)可以應(yīng)用于近似品種的輔助篩選[6]。HIRATA等[7]研究證明SSR分子標(biāo)記可以有效鑒定多花黑麥草和其相似的品種；PASAKINAKIENE等[8]利用SSR標(biāo)記對(duì)多花黑麥草、多年生黑麥草、草地羊茅和高羊茅進(jìn)行了鑒定；趙欣欣等[9]通過(guò)SSR分子標(biāo)記鑒定了多花黑麥草雜種后代真實(shí)性和表型差異；羅永聰?shù)萚10]通過(guò)12對(duì)SSR引物構(gòu)建的指紋圖譜區(qū)分了21個(gè)多花黑麥草品種（系）；黃婷等[11]通過(guò) 20對(duì) SSR引物對(duì) 6個(gè)多花黑麥草品種進(jìn)行了鑒定分析。PRAKASH等[12]雖然對(duì)瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，但仍難以滿足試驗(yàn)中高效、準(zhǔn)確、大樣品數(shù)的需求，因此，在這樣的現(xiàn)狀中，毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)技術(shù)逐漸受到關(guān)注。SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法是以DNA測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)方法，具有高效、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。程本義等[13]和陳雅瓊等[14]研究表明熒光標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)效率顯著高于聚丙烯凝膠電泳，結(jié)果更為精確靈敏，更適用于材料的高通量檢測(cè)分析。易紅梅等[15]通過(guò)對(duì)7個(gè)SSR位點(diǎn)的檢測(cè)分析，通過(guò)毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記檢測(cè)

法和變性PAGE銀染法分別構(gòu)建了192份玉米品種的指紋圖譜，結(jié)果得出熒光標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)法效率更高；許鯤等[16]也通過(guò)40對(duì)SSR熒光引物構(gòu)建了163份國(guó)家冬油菜的指紋圖譜。SANCHEZ-PEREZ等[17]探討了瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳3種技術(shù)在杏仁研究上的優(yōu)劣，結(jié)果證明聚丙烯酰胺凝膠電泳與毛細(xì)管電泳比瓊脂糖凝膠電泳效果更佳，但DNA自動(dòng)測(cè)序儀成本較高，而PAGE更耗費(fèi)時(shí)間。因此，目前的檢測(cè)方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)，單一的檢測(cè)技術(shù)在品種鑒定和指紋圖譜構(gòu)建中已經(jīng)難以滿足所有試驗(yàn)需求，因此，在不同的試驗(yàn)階段按實(shí)際需求選擇合適的檢測(cè)技術(shù)，可顯著提高鑒定效率。【本研究切入點(diǎn)】EST-SSR分子標(biāo)記是基于植物表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，ESTs）進(jìn)行開發(fā)的SSR標(biāo)記，物種間通用性高、側(cè)翼序列保守性高，可直接反映出轉(zhuǎn)錄區(qū)的差異[18]，被廣泛應(yīng)用在結(jié)縷草[19]、牛鞭草[20]和高丹草[21]等禾本科植物DNA指紋鑒定中。目前，已通過(guò)RAPD、SSR和ISSR等分子標(biāo)記構(gòu)建了黑麥草的DNA指紋圖譜，但是EST-SSR分子標(biāo)記在黑麥草指紋圖譜構(gòu)建上的應(yīng)用未見報(bào)道，仍未見SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)法在多花黑麥草上的應(yīng)用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)技術(shù)，構(gòu)建10個(gè)多花黑麥草品種（系）的指紋圖譜，為多花黑麥草品種育成、品種鑒定提供高通量技術(shù)手段，完善多花黑麥草現(xiàn)有的DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇10個(gè)四倍體多花黑麥草材料，包括8個(gè)國(guó)審品種，2個(gè)新品系，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系2014—2015年收集（表1）。于2015年9月在光照培養(yǎng)箱中水培發(fā)芽育苗，待植株長(zhǎng)至4—5葉齡取樣。

表1 供試10個(gè)多花黑麥草品種（系）信息Table 1 Informations of 10 L.multiflorum varieties (strains) used in this study

1.2 DNA的提取

參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《植物品種鑒定DNA指紋方法 總則》（NY/T 2594-2014）[22]，由于多花黑麥草是異花授粉植物，因此，采用單株鑒定的方式，每份材料選取20個(gè)單株，共200個(gè)單株的幼嫩植株，通過(guò)試劑盒（北京天根生化公司）提取基因組DNA，然后用超微量分光光度儀（NanoVue Plus）檢測(cè)DNA純度和濃度，選取合格的DNA樣品于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 EST-SSR引物篩選

引物篩選采用3個(gè)田間表型性狀差異較大的多花黑麥草品種（特高Tetragold、長(zhǎng)江2號(hào)ChangjiangNo.2和阿伯德Aubade），每個(gè)品種選擇4個(gè)單株，共12個(gè)單株提取DNA。所用引物序列由多花黑麥草轉(zhuǎn)錄組自行測(cè)序開發(fā)而來(lái)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR所用94 kD分子量Taq酶、PCR-Mix混合液（含有10×PCR buffer、Mg2+、dNTPs）和50 bp DNA ladder Marker均購(gòu)自北京天根生化公司。

引物篩選采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行，EST-SSR優(yōu)化反應(yīng)體系為15 μL，在前人的基礎(chǔ)上稍作修改[11]，包括DNA 1.5 μL（10 ng·μL-1）、正反向引物各0.3 μL（10 pmol·μL-1）、Taq酶0.3 μL（2.5 U·μL-1）、PCR-Mix 7.5 μL（10 ng·μL-1）和ddH2O 5.1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 30 s，退火45 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺Acr﹕N'-N'甲叉雙丙烯酰胺Bis =29﹕1，1×TBE緩沖液）上進(jìn)行檢測(cè)。每樣品點(diǎn)樣5.5 μL，50 bp DNA Ladder為分子量標(biāo)準(zhǔn)，200 V電壓預(yù)電泳30 min，而后400 V電壓電泳 2 h，在 0.1%的 AgNO3溶液中銀染，在NaOH溶液中顯色[23]，凝膠用Bio-6000凝膠掃描儀掃描保存以供分析。最終從 200對(duì)自主開發(fā)的EST-SSR引物（分別編號(hào)為 N1—N200）中共篩選出30對(duì)高效引物，并根據(jù)反復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果調(diào)整最終的退火溫度與循環(huán)數(shù)（表2）。

表2 30對(duì)EST-SSR熒光引物信息Table 2 Informations of 30 EST-SSR fluorescence primer pairs

1.4 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳

將從200對(duì)引物中篩選出的30對(duì)EST-SSR引物（表 2），在每對(duì)引物 5′端添加熒光標(biāo)記 FAM（6-carboxy-fluorescein）。試驗(yàn)中所用熒光引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物用滅菌ddH2O溶解并稀釋到10 μmol·μL-1備用。

毛細(xì)管電泳的PCR擴(kuò)增采用10 μL的反應(yīng)體系，其中包括 5 ng DNA、3U Taq DNA聚合酶、2 mmol·L-1Mg2+、5 mmol·L-1dNTPs、2 μmol·L-1正向引物和反向引物、2 μmol·L-1FAX熒光標(biāo)記和7 μL ddH2O。PCR反應(yīng)體系為94℃ 5 min；94℃ 30 s，不同退火溫度退火30 s，72℃ 1 min，35或40個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物稀釋，在96孔板的各孔中分別加入9 μL去離子甲酰胺、0.05 μL GS3730-500分子量?jī)?nèi)標(biāo)和1 μL稀釋后的PCR產(chǎn)物，95℃變性5 min，于4℃冷卻10 min，再置于ABI 3730XL DNA分析儀（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，USA）上進(jìn)行自動(dòng)熒光檢測(cè)。毛細(xì)管電泳程序?yàn)轭A(yù)電泳15 kV，2 min；2 kV電壓進(jìn)樣10 s；電泳 15 kV，20 min。最后設(shè)置分子內(nèi)標(biāo)（Size Standard）和參數(shù)（Parameters）用Data Collection和Gene Marker軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集與圖像分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

原始數(shù)據(jù)采用Data Collection軟件收集，并根據(jù)引物篩選時(shí)確定的分子量范圍及引物顏色進(jìn)行分子量的確定，用Gene Marker 2.2.0軟件進(jìn)行分析，最終將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)化成PDF圖片形式導(dǎo)出。將毛細(xì)管電泳檢測(cè)所得的SSR擴(kuò)增片段信息輸入EXCEL表格，以多花黑麥草品種編號(hào)和基因型編號(hào)為橫列，以擴(kuò)增核苷酸片段大小為縱列，有穩(wěn)定擴(kuò)增核苷酸片段記為“1”，沒有或擴(kuò)增不穩(wěn)定的記為“0”，生成由“1”和“0”構(gòu)成的原始數(shù)據(jù)矩陣。然后根據(jù)表征矩陣，數(shù)據(jù)通過(guò)DCFA 1.1[24]生成，利用POPGENE 1.31軟件[25]計(jì)算I值（Shannon’s information index）和H值（Nei’s gene diversity）。多態(tài)性信息含量 PIC值（Polymorphism information content）參考 Nei[26]的方法進(jìn)行計(jì)算，PIC=1-ΣPi2（Pi表示第i個(gè)等位位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率，反映每個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性水平）。

指紋圖譜代碼采用陳昌文等[27]方法，并根據(jù)指紋圖譜代碼構(gòu)建10個(gè)多花黑麥草材料的DNA指紋圖譜；最終將每個(gè)材料的信息分別整合到QR編碼中，編碼中擴(kuò)增信息標(biāo)注方式參考宋海斌等[28]標(biāo)注方法，依據(jù)擴(kuò)增位點(diǎn)分子量從小到大的順序記錄各檢測(cè)位點(diǎn)的分子量（單位為bp，略去單位bp，只記錄數(shù)字），如果一份材料經(jīng)同一引物擴(kuò)增同時(shí)檢測(cè)出多個(gè)位點(diǎn)，則用“-”連接數(shù)字，即可簡(jiǎn)單表示每個(gè)材料的擴(kuò)增信息。

2 結(jié)果

2.1 EST-SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

利用初步篩選出的30對(duì)EST-SSR引物對(duì)10個(gè)多花黑麥草材料進(jìn)行了熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)部分由聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選出的引物，添加熒光標(biāo)記后在毛細(xì)管電泳中難以檢測(cè)到穩(wěn)定片段或檢測(cè)效果不佳，不適用于多花黑麥草高通量指紋鑒定中，因此，根據(jù)DNA分析儀檢測(cè)到的片段，排除檢測(cè)異常、具有較多異常峰型的、較多位點(diǎn)不易判別的引物，篩選出能檢測(cè)到穩(wěn)定變異等位基因的25對(duì)EST-SSR引物，每條擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度范圍為51—249 bp。采取每個(gè)材料20個(gè)單株進(jìn)行毛細(xì)管電泳[6]，刪除部分不穩(wěn)定擴(kuò)增片段后，獲得穩(wěn)定性較高的擴(kuò)增片段信息（表3）。

表3 25對(duì)EST-SSR引物擴(kuò)增片段信息Table 3 Amplified fragment informations of 25 EST-SSR primer pairs

25對(duì)EST-SSR引物對(duì)10個(gè)多花黑麥草品種（系）進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測(cè)出127個(gè)等位基因。不同引物擴(kuò)增的等位基因數(shù)明顯不同，可檢測(cè)到有效等位基因數(shù)為 2（N87）—11（N101）個(gè)，平均每個(gè)引物5.08個(gè)等位基因；特異等位基因數(shù)范圍為0（N152）—11（N101）個(gè)，平均每對(duì)引物 4.00個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)比率為 33.33%—100.00%，平均73.02%（表4）。PIC變動(dòng)范圍為0.484（N87）—0.877（N101），平均 0.702，表明多花黑麥草材料間變異較大，具有豐富的遺傳多樣性。Shannon指數(shù)最大為3.322（N101），均值為1.929；基因多樣性指數(shù)變動(dòng)范圍為0.159（N101）—0.500（N152），平均0.318；可鑒別的材料數(shù)為0—10個(gè)。綜上所述，可得出引物N101是所有引物中鑒定效率最高的引物，該引物可完全區(qū)分本試驗(yàn)所有的多花黑麥草材料。測(cè)得的序列若按二倍性估算，最多可能鑒別121種材料，在以后多花黑麥草DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建中應(yīng)重點(diǎn)應(yīng)用。

表4 EST-SSR引物擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性信息Table 4 Results and the polymorphism informations of EST-SSR primers

2.2 EST-SSR標(biāo)記引物高效性分析

對(duì)25對(duì)EST-SSR熒光引物在10個(gè)多花黑麥草材料的毛細(xì)管電泳結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，10個(gè)多花黑麥草品種（系）均可檢測(cè)到特異等位基因（表5），即均可利用一個(gè)引物就可鑒別相應(yīng)的品種。其中，特高、達(dá)伯瑞和川農(nóng)2號(hào)只具有1個(gè)特征引物；長(zhǎng)江2號(hào)和邦德具有2個(gè)特征引物；贛選1號(hào)、阿伯德、杰威、川農(nóng)1號(hào)和LG1具有3個(gè)特征引物。另外，一個(gè)引物可以同時(shí)鑒定多個(gè)品種，即它能在多個(gè)品種上檢測(cè)到特異等位基因。如圖1，可觀察到N101引物在長(zhǎng)江2號(hào)（118 bp）、贛選1號(hào)（105 bp）和川農(nóng)2號(hào)（92 bp）上同時(shí)檢測(cè)到特異等位基因；N168引物在特高（152 bp）、杰威（169 bp）和LG1（168 bp）上同時(shí)檢測(cè)到特異等位基因；N151引物在長(zhǎng)江2號(hào)（143 bp）和邦德（152 bp）上同時(shí)檢測(cè)到特異等位基因；N156引物在贛選1號(hào)（102 bp）和達(dá)伯瑞（112 bp）上同時(shí)檢測(cè)到特異等位基因；N38引物在阿伯德（143 bp）和杰威（152 bp）上，N54在杰威（136 bp）和川農(nóng)1號(hào)（138 bp）上，N146引物在贛選1號(hào)（93 bp）和LG1（89 bp）上同時(shí)檢測(cè)到特異等位基因；其余引物均只在一個(gè)材料上出現(xiàn)特異等位基因。結(jié)果表明，25對(duì)EST-SSR引物在毛細(xì)管電泳下能檢測(cè)到豐富的等位基因，可有效用于多花黑麥草指紋圖譜的構(gòu)建。

圖1 熒光引物N101在長(zhǎng)江2號(hào)、贛選1號(hào)和川農(nóng)2號(hào)（從上至下）單株上的特異峰圖Fig. 1 Specific peak figures of Changjiang No.2, Ganxuan No.1 and Chuannong No.2 (from up to down) at fluorescent primer N101

2.3 多花黑麥草品種（系）DNA指紋圖譜構(gòu)建

2.3.1 指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)模式圖 由于多花黑麥草是異花授粉植物，在品種間和品種內(nèi)變異均較大，為避免單個(gè)引物構(gòu)建的指紋圖譜在更多材料鑒定時(shí)的誤差，因此，采用引物組合法進(jìn)行了指紋圖譜構(gòu)建[29]。根據(jù)毛細(xì)管檢測(cè)峰型、PIC值、引物多態(tài)性、引物鑒定效率（表4和表5），從25對(duì)EST-SSR引物中選擇了6對(duì)擴(kuò)增和檢測(cè)效果較好的引物（N54、N101、N146、N151、N154、N156）[30]，6對(duì)引物可檢測(cè)到的穩(wěn)定等位基因數(shù)均不小于19個(gè)（表6），在達(dá)伯瑞和邦德上可檢測(cè)到的等位基因數(shù)最多，均為22個(gè)，其中，基因數(shù)較少的是杰威和川農(nóng)2號(hào)，但材料間可檢測(cè)到的等位基因數(shù)差異不顯著。

表5 10個(gè)多花黑麥草材料的14對(duì)特征引物Table 5 14 specific primer pairs for 10 L.multiflorum materials

表6 6對(duì)引物在不同材料中可檢測(cè)到的等位基因數(shù)Table 6 The number of alleles in different materials by 6 primer pairs

利用篩選出的6對(duì)EST-SSR熒光引物分別構(gòu)建了10個(gè)多花黑麥草材料檢測(cè)位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)模式圖（圖2）。以品種長(zhǎng)江2號(hào)為例，橫坐標(biāo)表示不同的EST-SSR多態(tài)性引物，縱坐標(biāo)表示引物擴(kuò)增峰圖的分子量。長(zhǎng)江2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)模式圖表示的是，長(zhǎng)江2號(hào)分別在引物N54的127、129和131 bp，引物N101的95、100、103、110和118 bp，N146的86和91 bp，引物N151的138、139、142、143、145和146 bp，引物N154的144、146和148 bp，N156的116 bp處檢測(cè)到核苷酸片段，可鑒定區(qū)別于其他品種，這種標(biāo)準(zhǔn)模式圖能將毛細(xì)管電泳峰圖轉(zhuǎn)變成更直觀的多態(tài)性譜帶圖，為品種鑒定提供了更簡(jiǎn)單易操作的方式。

2.3.2 指紋圖譜代碼 參考陳昌文等[27]方法，對(duì)篩選出來(lái)的6個(gè)引物擴(kuò)檢測(cè)出的位點(diǎn)進(jìn)行賦值（表7），采用1—9字符進(jìn)行賦值，對(duì)于等位基因數(shù)超過(guò)9的引物，采用只考慮其中9個(gè)基因位點(diǎn)的方法來(lái)進(jìn)行，優(yōu)先刪除鑒定性差的等位基因位點(diǎn)。根據(jù)這些原則，對(duì)25對(duì)引物擴(kuò)增的等位基因篩選后，選擇了其中42個(gè)等位基因位點(diǎn)進(jìn)行賦值。根據(jù)引物擴(kuò)增峰值的選擇和賦值標(biāo)準(zhǔn)，編碼時(shí)保證每對(duì)引物下的編碼只有一位數(shù)字，并且按照6個(gè)引物下的擴(kuò)增片段大小，先選擇位點(diǎn)較小的原則進(jìn)行賦值，編碼了多花黑麥草指紋圖譜代碼（表8）。編碼后，每個(gè)材料的DNA指紋圖譜代碼具有6位數(shù)字，代表6個(gè)引物上的6個(gè)電泳峰。如特高，圖譜代碼為 331233，表示特高在引物 N54的131 bp（3）、N101的98 bp（3）、N146的86 bp（1）、N151的138 bp（2）、N154的144 bp（3）和N156的113 bp（3）處均能檢測(cè)出峰。

表7 等位基因電泳峰的選擇和賦值標(biāo)準(zhǔn)Table 7 The selection and encoded standard of allelic peak

圖2 10個(gè)多花黑麥草材料的標(biāo)準(zhǔn)模式圖Fig. 2 The standard model pattern of 10 L.multiflorum materials

編碼結(jié)果表明，6位指紋圖譜代碼能夠完全區(qū)分10個(gè)多花黑麥草材料，每份材料均具有特異的指紋圖譜代碼。根據(jù)指紋圖譜代碼，簡(jiǎn)化多花黑麥草材料的指紋圖譜，圖3中譜帶與表8中的指紋圖譜代碼完全一致，由圖3可知，10個(gè)多花黑麥草材料明顯具有不同位點(diǎn)檢測(cè)到等位基因，可明顯區(qū)別不同材料。

2.3.3 指紋圖譜QR編碼 利用QrPlant Generator植物二維碼生成工具對(duì)所有供試材料進(jìn)行編碼，為每份材料構(gòu)建了一份指紋圖譜QR編碼（圖4），其中包含了材料名稱、材料類型、材料的植物學(xué)分類、指紋圖譜代碼、引物擴(kuò)增信息[28]。如掃描特高的QR編碼，會(huì)獲得如下信息：

圖3 10個(gè)多花黑麥草材料指紋圖譜Fig. 3 Fingerprintings of 10 L.multiflorum materials

材料名稱Cultivars Name：特高Tetragold；

類型Type：引進(jìn)品種The introduced varieties；

植物學(xué)分類 Botanic classification：L. multiflorum.cv. Tetragold；

EST-SSR指紋圖譜代碼EST-SSR fingerprinting codes：331233；

擴(kuò)增信息Amplification information：

N54-131-141N101-98-102N146-86-88-91-97N151-138-145-14 6N154-144-146-148-151N156-113-116-118-121-12。

圖4 多花黑麥草指紋圖譜QR編碼Fig. 4 Fingerprinting QR code of L.multiflorum

表8 10個(gè)多花黑麥草材料的DNA指紋圖譜代碼Table 8 DNA fingerprinting codes of 10 L.multiflorum materials

3 討論

3.1 EST-SSR標(biāo)記效果分析

EST-SSR分子標(biāo)記不僅具有SSR標(biāo)記共顯性、重復(fù)性高、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)[31-32]，而且通用性也較SSR分子標(biāo)記高，因此，逐漸成為植物種質(zhì)遺傳多樣性分析、系譜分析、品種鑒定及DNA指紋圖譜構(gòu)建中廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記[33-34]。本試驗(yàn)根據(jù)熒光檢測(cè)毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果，選擇了25對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行多花黑麥草材料的鑒定。25對(duì)引物共檢測(cè)出127個(gè)等位基因，特異等位基因數(shù)在0—11個(gè)不等，平均每對(duì)引物4.00個(gè)，PIC變幅為0.484—0.877，Nei氏基因多樣性指數(shù)變幅為 0.159—0.500。同時(shí)，引物 N101在 200對(duì)引物中鑒定效率最高，在多花黑麥草遺傳多樣性、品種鑒定和DNA指紋圖譜的構(gòu)建中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

多花黑麥草品種（系）間存在相似的遺傳背景和近緣關(guān)系，特別是雜交材料，一般是通過(guò)雜交后代連續(xù)混合選擇或多個(gè)品種開放授粉連續(xù)混合選擇育成的，因此，品系間、品系與親本間親緣關(guān)系相近，在品種鑒定時(shí)難以區(qū)分。本試驗(yàn)篩選出的6對(duì)引物成功將親緣關(guān)系近的材料區(qū)分開，如贛選1號(hào)，同時(shí)是川農(nóng)1號(hào)（牧杰×贛選1號(hào)）和LG1（F4N×贛選1號(hào)）的親本，在6對(duì)引物下的指紋圖譜代碼分別為151131、231214和223224，證明了引物多態(tài)性好且鑒別效率高，在近親品種的鑒定中也具有品種特異性片段，可形成不同的指紋代碼。

3.2 DNA指紋圖譜構(gòu)建分析

DNA指紋圖譜是快速鑒別植物品種時(shí)的有效工具，效率較 DUS鑒定法更加準(zhǔn)確快速，錯(cuò)誤率更低[35-36]；較物理化學(xué)鑒定法和生化鑒定法更具有普遍性，不需要特殊的物理化學(xué)反應(yīng)或者特殊的蛋白質(zhì)，能在各類植物中普遍應(yīng)用。DNA指紋圖譜構(gòu)建采用的方法一般有特征位點(diǎn)法[30]、單引物法[37]和核心引物組合法[38]。但由于利用單一引物法獲取不同的品種特異性等位基因需要較多引物和更多的供試品種，導(dǎo)致鑒定效率較不同引物組合法更低[39-40]，因此，本試驗(yàn)采用6對(duì)引物組合構(gòu)建了10個(gè)多花黑麥草材料的指紋圖譜，圖譜包括指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)模式圖、指紋圖譜代碼和指紋圖譜QR編碼。雖然指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)模式圖與指紋圖譜代碼易于理解，但包含信息量較少；而指紋圖譜QR編碼信息量更大，可編碼該品種的所有相關(guān)信息，檢索該品種時(shí)更方便且全面，也更加有利于多花黑麥草指紋鑒定工作的快速進(jìn)行。同時(shí)配合品種 DUS測(cè)試，可以更全面的解決生產(chǎn)實(shí)際中多花黑麥草品種的鑒定區(qū)分問(wèn)題。本研究通過(guò)EST-SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)電泳檢測(cè)法初步建立了多花黑麥草高通量指紋鑒定體系，為多色熒光檢測(cè)法、種子純度鑒定、指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究篩選應(yīng)用了25對(duì)EST-SSR引物，構(gòu)建了 10個(gè)多花黑麥草材料的DNA指紋圖譜。通過(guò)引物多態(tài)性和高效性分析表明，熒光引物N101在多花黑麥草材料上多態(tài)性高，可直接鑒別本試驗(yàn)中的所有多花黑麥草材料。采用6對(duì)引物構(gòu)建了多花黑麥草指紋圖譜，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)模式圖、圖譜代碼和圖譜QR編碼3種方式鑒定了10個(gè)多花黑麥草材料，分別構(gòu)建了唯一的指紋代碼和QR編碼，建立了基于 SSR熒光標(biāo)記的高通量多花黑麥草指紋鑒定體系。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Construction of EST-SSR Fingerprinting Based on Fluorescence Detection Technology for Italian Ryegrass

LIU Huan1, ZHANG XinQuan1, MA Xiao1, ZHANG RuiZhen2, HE GuangWu2, PAN Ling1, JIN MengYa1
(1Department of Grassland Science, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130;2Grassland Station of Sichuan Province, Chengdu 610041)

【Objective】In this study, a Italian ryegrass (Lolium multiflorum Lam.) variety identification system based on fluorescently labeled ETS-SSR markers was developed to provide a high-throughput DNA profiling means for identification of Italian ryegrass varieties, which can provide valuable information for the use of Italian ryegrass production and an effective method of protecting farmers’ benefits and breeders’ rights.【Method】Using three Italian ryegrass varieties (Tetragold, ChangjiangNo.2 andAubade) with high difference of phenotypic traits, 30 primers were screened from the original 200 EST-SSR primers by polyacrylamide gel electrophoresis, which had clear amplification bands, rich polymorphism and stable amplification. Markers selected were labeled at the 5′ end of forward primer using fluorescent tags FAM, DNA analyzer was employed to detect different allelic variations of 200 individual PCR-amplified fragments by capillary electrophoresis. After further screening, 25 out of 30 fluorescent markers were chosen based on stable amplification to construct a high throughput identification system for Lolium multiflorum L..【Result】DNA fingerprint of ten Italian ryegrass materials were constructed using 25 EST-SSR primers for variety identification. A total of 127 alleles were amplified by 25 primer pairs, and the amplification fragment length ranged from 51 to 249. The effective number of alleles ranged from 2 to 11 on each pair of primers among them, primer N101 with 11 specific alleles was the most of all primers and each pair of primers had 4.00 specific alleles on average. The ratio of polymorphism sites ranged from 33.33% to 100.00%. The average value of polymorphic information content (PIC) was 0.702, the largest Shannon’s value (I) was 3.322 (N101) and the average value was 1.929, the Nei’s genetic diversity (H) ranged from 0.159 to 0.500 and the average value was 0.318. The amount of identified materials was from 0 to 10, and 14 of 25 primer pairs had 25 specific amplification sites among ten varieties (strains). Taken together, the results showed that the N101 fluorescence primer had the highest identification capability, which can identify these varieties (strains) directly. In addition, specific alleles were detected in primer ‘N101’ in three varieties such as Changjiang No.2, Ganxuan No.1 and Chuannong No.2. But due to high variation exists in same variety and different varieties of Lolium multiflorum L., in order to identify other materials, 6 EST-SSR primers (N54, N101, N146, N151, N154, N156) with good amplification and detection effect were chosen from 25 primers, the numbers of stable alleles were no less than 19, and the varieties “Double Barrel” and “Abundant” with 22 alleles were the most of all materials. Six high-efficiency primers were used for construction of DNA fingerprint spectrum including the standard model, fingerprint code and QR encodes of fingerprint spectrum. In this study, the fingerprint code and the unique QR encode for ten varieties of Italian ryegrass were firstly obtained using EST-SSR molecular marker with the aid of capillary electrophoresis and fluorescence labeling technology.【Conclusion】In this study, a SSR high-throughput identification system was constructed according to six pairs high efficiency primers, in which the ‘N101’ fluorescence primer having the most polymorphism can directly apply to identification of 10 Italian ryegrass varieties (strains).

Italian ryegrass (Lolium multiflorum Lam.); EST-SSR marker; fingerprinting; fluorescence detection; capillary electrophoresis

2016-08-04；接受日期：2016-11-04

國(guó)家現(xiàn)代牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-35-05）、農(nóng)業(yè)部草品種DUS測(cè)定項(xiàng)目（20130106）、四川省飼草育種攻關(guān)（2011NZ0098-11）

聯(lián)系方式：劉歡，Tel：18728157834；E-mail：snlh9231@163.com。通信作者張新全，E-mail：zhangxq@sicau.edu.cn