基于DO-stat流加培養(yǎng)控制的海藻糖合成酶發(fā)酵條件研究

段瑩瑩，曹大鵬，任 峰，張曰輝，趙 偉*

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

基于DO-stat流加培養(yǎng)控制的海藻糖合成酶發(fā)酵條件研究

段瑩瑩，曹大鵬，任 峰，張曰輝，趙 偉*

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

溶氧濃度對重組大腸桿菌的生長和外源蛋白的高效表達影響較大，為進一步增加菌體量和重組蛋白表達量，該研究采用DO-stat流加培養(yǎng)進行控制，分別研究了溶氧濃度20%、30%、35%和40%條件下大腸桿菌的生長情況以及海藻糖合成酶的表達情況。結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵罐中溶氧濃度控制在30%時，發(fā)酵40 h，菌體干質(zhì)量可達53.9 g/L，是分批發(fā)酵時的6倍，海藻糖轉(zhuǎn)化率達到80.9%，是分批發(fā)酵時的2.25倍。

高密度發(fā)酵；DO-stat；海藻糖合成酶

海藻糖（trehalose）是一種二糖，由兩個葡萄糖分子通過α-1,1-糖苷鍵連接而成，作為一種添加劑、穩(wěn)定劑和甜味劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域[1-2]。海藻糖目前的生產(chǎn)方法主要為酶法，其中較為簡便的海藻糖生產(chǎn)方法[3]是利用海藻糖合成酶的分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基化作用將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖。

生產(chǎn)大腸桿菌（Escherichia coli）或以其構(gòu)建的基因工程菌的表達產(chǎn)物時采用一般的發(fā)酵工藝，大腸桿菌的菌體生物量、蛋白表達量、代謝產(chǎn)物在發(fā)酵液中和菌體內(nèi)的濃度都比較低，很難得到理想的生產(chǎn)效率。高密度發(fā)酵重組大腸桿菌可獲得較高的生物量，但對發(fā)酵條件的要求非常高。影響高密度發(fā)酵的因素非常多，如細胞生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)、發(fā)酵過程中積累的生長抑制物、培養(yǎng)溫度、溶氧濃度、發(fā)酵液的pH值、補料方式、誘導(dǎo)方式等。

在大腸桿菌的高密度發(fā)酵過程中，培養(yǎng)液中的溶氧量對大腸桿菌生長過程中的調(diào)控具有重要的作用[4]，能很好的反應(yīng)大腸桿菌的生長狀態(tài)。DO-stat流加培養(yǎng)控制的基本原理是將由于底物缺失造成的溶氧濃度上升作為補加底物的信號[5]，是應(yīng)用較多的一種反饋控制方式。重組大腸桿菌發(fā)酵過程中溶解氧濃度過高或過低均會抑制菌體的生長代謝，不利于產(chǎn)酶，為進一步增加海藻糖合成酶的表達量，提高海藻糖的轉(zhuǎn)化率，采用了DO-stat法用溶氧濃度作為反饋指標來流加營養(yǎng)物質(zhì)的發(fā)酵方式[6]。當(dāng)發(fā)酵液中的底物消耗到一定程度時，細胞由于營養(yǎng)缺失而耗氧下降導(dǎo)致溶氧濃度迅速上升，但是，通過補加底物，溶氧濃度又開始下降[7]。通過這種方式，可以維持溶氧濃度在一個恒定的水平。胡沛臻等[8]采用了溶氧反饋-補料分批技術(shù)在培養(yǎng)基因重組工程菌E.coliBL21/pET-MHM的過程中并取得了很好的效果，菌體的密度達到了70 g/L以上，目的蛋白的表達量＞菌體蛋白總量的38%。KORZ D J等[9]通過溶氧值的變化情況進行補料控制高密度培養(yǎng)大腸桿菌發(fā)酵過程，在補料培養(yǎng)階段大腸桿菌始終處于碳源限制性生長的狀態(tài)，保持著恒定的比生長速率，大腸桿菌的最終菌體密度達到148 g/L。本研究利用DO-stat流加控制方式探討了不同溶氧濃度對重組海藻糖合成酶工程菌的發(fā)酵過程的影響，研發(fā)出了穩(wěn)定高效的高密度發(fā)酵工藝，為海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

大腸桿菌（E.coli）：山東福洋生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，氨芐西林鈉0.01%，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，NaH2PO40.3%，K2HPO41%，MgSO4·7H2O 0.12%，NH4Cl 0.1%，CaCl20.001%，玉米漿0.2%，氨芐西林鈉0.01%，pH 7.0。

1.1.3 試劑

海藻糖標準品：美國Sigma公司；乙腈（色譜純）：西隴化工股份有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、酵母粉、蛋白胨：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖：山東西王糖業(yè)有限公司；氯化鈉、氯化銨、氯化鈣、硫酸鎂：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；氨芐西林鈉：山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

15L發(fā)酵罐和過程參數(shù)檢測與控制系統(tǒng)：上海國強生化工程；PAS7000型生物尾氣分析系統(tǒng)：重慶哈特曼科技有限公司；Waters515泵、Waters2414型示差折光檢測器的高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國Waters公司；TP-114型電子天平：丹佛儀器有限公司；FE-20型pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；AH-BASIC型勻漿機：ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司；DHZ-DA型冷凍恒溫振蕩器：太倉市實驗設(shè)備廠；SW-CJ-2D型凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)方法

將甘油保存液中保存的菌株以1%的接種量接到含有150 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h。

1.3.2 分批發(fā)酵培養(yǎng)方法

15 L全自動發(fā)酵罐，裝液量10 L，接種量10%，接種前發(fā)酵罐內(nèi)加入氨芐西林鈉至100 μg/mL，設(shè)定發(fā)酵罐溫度37℃，空氣通量300 L/h，罐壓0.02 MPa，流加25%的氨水調(diào)節(jié)pH使其維持在7.0±0.2。

1.3.3 DO-stat流加控制培養(yǎng)方法

在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，當(dāng)發(fā)酵液中的葡萄糖濃度下降且溶氧濃度上升時，通過蠕動泵自動向發(fā)酵罐內(nèi)流加500 g/L的葡萄糖溶液。據(jù)報道，溶氧量維持在30%～40%[10]有利于重組大腸桿菌的生長和外源蛋白的高效表達，所以考察了20%、30%、35%和40%這幾個溶氧水平對重組海藻糖合成酶工程菌發(fā)酵過程的影響。

1.3.4 測定方法

菌體干質(zhì)量：取不同發(fā)酵時間的菌液15mL，10000r/min離心10 min，蒸餾水清洗2次，105℃烘干至質(zhì)量恒定，用微量分析天平稱量菌體干質(zhì)量。

殘?zhí)牵翰捎渺沉衷噭┓y殘?zhí)呛?，同一樣品做平行實?次。

殘?zhí)呛浚?）=[空白消耗葡萄糖溶液體積（mL）－樣品消耗葡萄糖溶液體積（mL）]×2×標準葡萄糖溶液的質(zhì)量濃度（1 g/L）×樣品稀釋倍數(shù)

海藻糖轉(zhuǎn)化率：準確稱取轉(zhuǎn)化液1.000 0 g，超純水定容至100 mL，搖勻后超聲混勻20 min，進樣前用0.22 μm的濾膜過濾。HPLC測定轉(zhuǎn)化液中的海藻糖含量。

式中：C1為轉(zhuǎn)化液中海藻糖的含量，g/mL；C2為發(fā)酵底物中麥芽糖的含量，g/100g。

2 結(jié)果與分析

2.1 分批發(fā)酵培養(yǎng)方法

在分批發(fā)酵過程中，初始糖度為25 g/L，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度＜10 g/L時，開始手動補加葡萄糖，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度維持在10 g/L左右，其分批發(fā)酵過程曲線見圖1。

圖1 重組海藻糖合成酶工程菌分批發(fā)酵過程曲線Fig.1 Process curve of batch fermentation with trehalose synthase recombinant engineering strain

由圖1可知，0～8 h為菌體生長延遲期，此時菌體正慢慢適應(yīng)外界環(huán)境，糖耗速率較慢，基本不產(chǎn)酸；9～22 h為菌體對數(shù)生長期，此時菌體的生長速率達到最大值并保持較大值，糖耗速率明顯加快，溶氧迅速下降，15 h時發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度下降到最低值，此階段開始周期性補加葡萄糖；23～32 h為菌體減速生長期，25 h時加入乳糖降溫誘導(dǎo)表達海藻糖合成酶；33～40 h為細胞穩(wěn)定生長期，此間糖耗速率減慢，溶氧回升，分批發(fā)酵結(jié)束，下罐后菌體干質(zhì)量為8.85 g/L，海藻糖轉(zhuǎn)化率為35.9%。

2.2 DO-stat流加控制培養(yǎng)方法

2.2.1 不同溶氧量對菌體干質(zhì)量的影響

從圖2可知，溶氧量對菌體干質(zhì)量影響較大，發(fā)酵初期即菌體生長延遲期同分批發(fā)酵過程，控制不同溶氧水平后菌體生長差異較大。30%溶氧條件下菌體生長最快，明顯優(yōu)于20%、35%和40%這三個溶氧水平，發(fā)酵40 h時，菌體干質(zhì)量可達53.9 g/L。

圖2 不同溶氧量對菌體干質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of different dissolved oxygen concentration on cell growth

2.2.2 不同溶氧量對海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響

圖3 不同溶氧量下產(chǎn)生的海藻糖合成酶隨時間的變化曲線Fig.3 Change curve of trehalose synthase at different dissolved oxygen concentrations

由圖3可知，發(fā)酵對數(shù)中期約25 h時加入乳糖降溫誘導(dǎo)表達海藻糖合成酶，不同溶氧濃度下海藻糖合成酶的表達量呈現(xiàn)出明顯的差異。當(dāng)溶氧濃度控制在30%，發(fā)酵40 h時海藻糖轉(zhuǎn)化率最高，達到80.9%；溶氧濃度控制在20%、35%，發(fā)酵40 h時海藻糖轉(zhuǎn)化率分別為50.8%和39.8%；溶氧濃度控制在40%，發(fā)酵40 h時，其海藻糖轉(zhuǎn)化率最低，可能是發(fā)酵液中溶氧濃度過高或過低均不利于海藻糖合成酶的表達。

3 結(jié)論

通過DO-stat流加策略研究溶氧濃度20%、30%、35%和40%條件下大腸桿菌的生長情況以及海藻糖合成酶的表達情況，結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵罐中溶氧濃度控制在30%，發(fā)酵40 h時，菌體干質(zhì)量可達53.9 g/L，是分批發(fā)酵（8.85 g/L）時的6倍，海藻糖轉(zhuǎn)化率達到80.9%，是分批發(fā)酵（35.9%）時的2.25倍。重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖合成酶過程中采用DO-stat流加培養(yǎng)控制方式，一方面可以更好地控制溶氧濃度，滿足菌體生長及代謝所需的溶氧水平，另一方面可以在較短的發(fā)酵時間內(nèi)實現(xiàn)重組大腸桿菌的高密度高表達，為工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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Research on trehalose synthase fermentation conditions based on DO-stat culture-feeding strategy

DUAN Yingying,CAO Dapeng,REN Feng,ZHANG Yuehui,ZHAO Wei*(Shangdong Fuyang Biotechnology Co.,Ltd.,Dezhou 253100,China)

Dissolved oxygen concentration has great effect on recombinantEscherichia coligrowth and high-efficiency expression of heterologous protein.In order to further increase the cell content and recombinantE.coliexpression,DO-stat feeding strategy was adopted.The effect of dissolved oxygen concentration(20%,30%,35%and 40%)onE.coligrowth and trehalose synthase expression were investigated respectively.Results showed that the cells dry mass reached 53.9 g/L,which was 6 times of those in fed-batch fermentation,the conversion rate of trehalose reached 80.9%,which was 2.25 times of those in fed-batch fermentation,when dissolved oxygen concentration was controlled at 30%for 40 h fermentation.

high density fermentation;DO-stat;trehalose synthase

TQ920.1

0254-5071（2017）01-0135-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.028

2016-08-10

段瑩瑩(1985-)，女，工程師，碩士，研究方向為微生物發(fā)酵。

*通訊作者：趙偉(1979-)，女，工程師，碩士，研究方向為微生物發(fā)酵。