一株非釀酒酵母的菌種誘變選育

劉鑫楠，宗倩倩，李金鵬，張惠玲*

(寧夏大學農學院食品系，寧夏銀川750021)

一株非釀酒酵母的菌種誘變選育

劉鑫楠，宗倩倩，李金鵬，張惠玲*

(寧夏大學農學院食品系，寧夏銀川750021)

將全美梅奇酵母作為出發(fā)菌株，進行紫外誘變和微波誘變，得到最佳誘變條件為：紫外線（30 W）照射5 min，微波（2 450 MHz，700 W）輻照30s。初篩與復篩后獲得耐受性較好的突變菌株2株，最終通過氣相色譜-質譜法進行香氣成分測定，對比香氣種類和含量，獲得一株發(fā)酵力好，可耐受300 g/L葡萄糖、9%vol酒精度和300 mg/L二氧化硫環(huán)境的突變菌株W1。其發(fā)酵液總酯含量為85.97%，總醇含量2.33%，二者高于出發(fā)菌株和突變菌株W2。菌株W1發(fā)酵液香氣飽滿，以果香為主，具有赤霞珠葡萄酒的色澤，適合葡萄酒的釀造應用。

非釀酒酵母；酒精；誘變；揮發(fā)性物質

釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）是葡萄酒的靈魂，用不同的酵母菌株發(fā)酵的葡萄酒，可以使葡萄酒的色澤、香氣成分及感官品質均有所不同[1]。非釀酒酵母菌的研究為研究葡萄酒的香氣成分方面奠定了重要基礎，極大的促進了葡萄酒產業(yè)的發(fā)展[2]。近年來，人們對非釀酒酵母在葡萄酒生產中的應用越來越關注。非釀酒酵母的釀酒特性、生物多樣性、分類鑒定及其潛在應用價值研究成為國內外的研究熱點和研究趨勢[3]。

選育優(yōu)良的酵母菌株一直是葡萄酒研究的重點[4]。選育耐受性較強的酵母菌，尤其是某些可產生特殊香氣或利于葡萄酒質量的次生代謝產物的非釀酒酵母菌株，將其應用于釀酒過程中，在保證葡萄酒質量的同時又能最大限度地發(fā)揮酵母菌的發(fā)酵性能[5]。本研究采用紫外照射（30 W）照射5 min及微波輻照（2 450 MHz，700 W）30 s的方式對非釀酒酵母進行物理誘變，通過對比誘變前后菌種特性，選育具有良好發(fā)酵性能且產酒精能力低、香氣好的突變菌株，使其能夠應用在葡萄酒的生產中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

全美梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima），由寧夏大學微生物實驗室分離自銀廣夏基地葡萄表皮得到。葡萄來源：赤霞珠葡萄品種，2015年9月取自寧夏銀川市蒲尚酒莊。保存于-34℃超低溫冰箱，實驗用時，取出并解凍。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L。

酵母浸出粉胨葡萄糖嘌呤（yeast peptone dextrose adenine hemisulfate，YPDA）培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、腺嘌呤硫酸鹽0.03 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：10°B葡萄汁。

1.1.3 主要試劑

甲醇、無水乙醇（色譜純）：天津市大茂化學試劑廠；葡萄糖、硫酸銅（分析純）：北京化工廠；次甲基藍、氯化鈉（分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

7230J型分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；LG微波爐：樂金電子（天津）電器有限公司；GC-2010氣相色譜儀：日本島津公司；固相微萃取纖維頭：美國SUPELCO公司；GC-MS-QP2010氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography-massspectrometer，GC-MS）儀：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種誘變

（1）菌種的活化

將保藏的菌株解凍后，用接種針挑取一環(huán)菌體培養(yǎng)于10 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng)24 h，制成種子液。

（2）生長曲線測定

將非釀酒酵母活化后，以2%的接種量接種于YPDA液體培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng)。每隔2 h測定其吸光度值，以未接種的YPDA培養(yǎng)基作為空白對照，在波長600nm處測定菌懸液的OD600mm值，每個樣品平行測定3次[6]。

（3）菌懸液的制備

取出發(fā)菌株一環(huán)，接入到YPDA液體培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng)16 h，至對數(shù)期中期。將菌懸液稀釋至濃度為105CFU/mL，進行誘變處理。

（4）紫外誘變

將菌懸液均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，放置于30W的紫外燈下距離30cm，分別對平板進行不同時間的紫外照射[7]，時間分別為0、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、8 min，輻照處理后，用黑布包裹培養(yǎng)基在28℃條件下培養(yǎng)2 d，進行菌落計數(shù)，計算致死率。其計算公式如下：

致死率=（對照菌落數(shù)-處理菌落數(shù)）/對照菌落數(shù)×100%

（5）微波誘變

取5 mL菌懸液于直徑9 cm的培養(yǎng)皿內，選用最大功率700 W[8]、脈沖功率2 450 MHz的家用微波爐進行照射，照射5 s，在冰上快速冷卻5 s，重復此步驟，累計照射時間為5 s、10 s、15 s、20 s、25 s、30 s、35 s、40 s、45 s[8]，取上述處理液0.5 mL均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，在28℃條件下培養(yǎng)2 d，進行菌落計數(shù)，計算致死率。

1.3.2 誘變菌種初篩

根據(jù)致死曲線，在最佳紫外和微波時間誘變條件下，挑取菌落比較大的6個菌株，進行發(fā)酵實驗。其中出發(fā)菌株標記為CF，微波誘變菌株標記為W1、W2、W3、W4、W5、W6，紫外誘變菌株標記為Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6。

（1）突變菌株發(fā)酵實驗

用接種針挑取一環(huán)突變的菌株的菌體培養(yǎng)于10 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng)24 h，制成種子液。取2%種子液培養(yǎng)于50 mL YPDA液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)24 h。以2%的接種量將擴大培養(yǎng)液接種于糖度為10°Bx滅菌葡萄汁中，28℃條件下培養(yǎng)，每日測定其含糖量，直至糖度不再變化為發(fā)酵終止。

（2）乙醇含量測定

樣品前處理：取發(fā)酵液2.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。樣品上機前必須用0.22 μm針孔濾膜過濾。

檢測條件：島津GC-2010氣相色譜儀，DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），流速為24 mL/min；升溫程序：34～210℃程序升溫，34℃保持5 min，30℃/min速率升至210℃，保持5 min；進樣口溫度200℃；火焰離子化檢測儀溫度210℃；柱壓力：72.3 kPa；總流速：24.0 mL/min；線速度：25.3 cm/s；吹掃流速：3.0 mL/min；分流比20:1；柱流速1.00 mL/min；分流進樣模式；進樣量0.1 μL。

乙醇標準曲線的繪制：取5個10 mL容量瓶，分別取0.01 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL色譜乙醇，再分別用甲醇（色譜級）定容至10 mL，配制成體積分數(shù)0.1%、0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%的乙醇標準溶液，通過氣相色譜法測定乙醇峰面積繪制乙醇標準曲線。

1.3.3 誘變菌種的復篩

（1）殘?zhí)橇繙y定

發(fā)酵終止后，測定其殘?zhí)橇浚瑓⒄誈B/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的直接滴定法[9]。

（2）耐受性測定

將活化好的菌液以1%的接種量分別加入到不同葡萄糖質量濃度（100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L）、乙醇體積分數(shù)（3%、6%、9%、12%、15%）、SO2質量濃度（50mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、300 mg/L）的YPDA液體培養(yǎng)基中28℃條件下培養(yǎng)，并同時放入杜氏小管，30 h后觀察其杜氏小管中的氣體體積[10]，測定其菌株耐受性。

（3）揮發(fā)性物質測定

利用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）法進行香氣富集，于20 mL頂空瓶，用移液槍加入5mL待分析的葡萄汁或葡萄酒，加入2.0gNaCl，于40℃恒溫磁力攪拌器上平衡10 min，插入CAR/DVB/PD MS纖維頭40℃吸附30min，GC解吸5min，用于氣相色譜-質譜分析[11]。

色譜條件：色譜柱為DB-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；程序升溫：40℃保持2 min，以5℃/min的速度升至120℃，再以8℃/min的升溫速度升至250℃，保持10 min。載氣為（He），流速為1 mL/min，進樣口溫度為250℃。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量為70 eV，燈絲電流為0.20 mA，檢測器電壓為350 V，掃描范圍為20～450 amu，離子源溫度為200℃。

2 結果與分析

2.1 酵母菌生長曲線

誘變處理的菌株一般要求處于對數(shù)生長期，此時群體生長狀況比較同步，代謝活性高而穩(wěn)定，生活力強，易變異，重復性較好，所以選用對數(shù)期的細胞進行處理[12]。非釀酒酵母在YPDA中的生長曲線見圖1。

圖1 非釀酒酵母在YPDA中的生長曲線Fig.1 Growth curve of non-Saccharomycesstrain cultivated in YPDA medium

由圖1可知，該非釀酒酵母在8 h后進入對數(shù)生長期，22 h后進入穩(wěn)定期。故選擇18 h處于對數(shù)生長中期的菌懸液進行物理誘變。

2.2 紫外誘變致死率確定

不同紫外輻照時間對菌株致死率的影響見圖2。由圖2所示，隨著紫外輻照時間的增加，菌株的致死率不斷增大。由于紫外線有較強的殺菌能力和誘變能力，較高的致死率有利于篩選優(yōu)良菌株，但如果處理時間太長，一些高活性菌株也可能致死，不利于篩選[13]。近年來，通過紫外線、X-射線和乙烯亞胺等多種誘變劑誘變效應的研究發(fā)現(xiàn)，正向突變較多的出現(xiàn)在70%～80%致死率中[14]。因此，選擇致死率在80%左右時的照射時間為最佳時間進行誘變。故選擇照射時間為5 min左右。

圖2 紫外輻照時間對致死率的影響Fig.2 Effect of ultraviolet radiation time on lethal rate

2.3 微波誘變致死率確定

采用功率700 W微波小火照射涂有菌懸液的平板，不同微波輻照時間對菌株致死率的影響見圖3。由圖3所示，隨著微波輻照時間的增加，致死率上升較快，當微波輻照處理30 s時，致死率為86.07%，處理35 s時，致死率為96.72%，說明酵母對微波輻照非常敏感。因為選擇致死率在80%左右時的照射時間進行誘變，所以判定30 s為最佳誘變時間。

圖3 微波輻照時間對致死率的影響Fig.3 Effect of microwave radiation time on lethal rate

2.4 誘變菌種的初篩

不同紫外誘變處理以及微波誘變處理對菌株產乙醇及變化率的影響結果分別見表1及表2。

表1 紫外誘變菌株產乙醇變化Table 1 Mutation results of alcohol yield with ultraviolet irradiation

表2 微波誘變突變菌株產乙醇變化Table 2 Mutation results of alcohol yield with microwave irradiation

由表1可知，紫外誘變得到1株突變菌株Z4的乙醇含量較出發(fā)菌低，為3.04%，比出發(fā)菌株降低了7.03%。由表2可知，經過微波誘變處理后，得到3株菌株（W1、W2、W4）的乙醇產量比出發(fā)菌株CF低，其中突變菌株W2乙醇含量最低，為2.34%，比出發(fā)菌株CF的乙醇產量降低28.44%，因此選用菌株Z4、W1、W2、W4進行發(fā)酵力及耐受性實驗。

2.5 誘變菌種的復篩

2.5.1 發(fā)酵力分析

出發(fā)菌株及菌株Z4、W1、W2、W4的發(fā)酵液殘?zhí)呛咳鐖D4所示。由圖4可知，發(fā)酵后菌株W1、W2、Z4的殘?zhí)禽^出發(fā)菌株少，其中菌株W1突變菌株所剩殘?zhí)亲钌?，說明其發(fā)酵能力最強，菌株W4突變菌株所剩殘?zhí)亲疃啵f明其對葡萄糖的利用率較低、發(fā)酵能力差。

圖4 各菌株發(fā)酵液的殘?zhí)呛縁ig.4 Residual sugar contents in fermentation broth by different strains

2.5.2 突變菌株葡萄糖耐受性

表3 突變菌株對葡萄糖的耐受性Table 3 Tolerance of mutant strains on glucose

由表3可知，誘變后的菌株對于葡萄糖的耐受性都有提高。葡萄糖質量濃度100～200 g/L時，突變菌株的耐受性均好于出發(fā)菌株，當葡萄糖質量濃度上升至250 g/L，菌株W2、W4耐受性能變差。其中菌株W1、Z4在300 g/L葡萄糖含量下，產氣能力強于其他菌株，并且兩者的葡萄糖耐受性相同。由此可見，菌株W1、Z4耐受葡萄糖能力較其他突變菌種的耐受性要好。

2.5.3 突變菌種酒精耐受性

由表4可知，誘變后的菌株酒精耐受性能均較出發(fā)菌株高。其中，4株突變菌株均可以在酒精度3%vol條件下生長良好，特別是W1對酒精的耐受性明顯提高，可以在酒精度9%vol下生長，而菌株W2、W4、Z4只可在酒精度6%vol條件下微量生長。由此可見，菌株W1耐受酒精能力較其他突變菌株的耐受性要好。

2.5.4 突變菌種二氧化硫耐受性

表5 突變菌株對二氧化硫的耐受性Table 5 SO2tolerance of mutant strains

由表5可知，誘變后的菌株對于二氧化硫質量濃度的耐受性均提高。在300 mg/L SO2條件下4株突變菌株均能生長，說明這些突變菌株對SO2都具有很好的耐受性。但是，菌株W1、W2在此條件下產氣較其他菌株多，說明菌株W1、W2對SO2的耐受性較其他突變菌種的耐受性要好。

2.6 香氣成分測定結果分析

通過對突變菌種進行上述試驗，選出產酒精度低且耐性良好的突變菌株W1、W2，與出發(fā)菌株CF同時進行香氣種類和相對含量的測定，三株菌株發(fā)酵液的總離子流色譜圖見圖5。三株菌純種發(fā)酵產生的揮發(fā)性化合物及其含量見表6。

由表6可知，3種菌的發(fā)酵液共分析出26種組分，其中出發(fā)菌株CF發(fā)酵液含有19種，菌株W1發(fā)酵液含有23種，菌株W2發(fā)酵液含有23種。其中以酯類含量最多，醇類次之，其他組分依次為酸類，醛酮類，雜環(huán)、烷烴類。突變菌株的總酯含量明顯提高并共產生了出發(fā)菌株沒有的6種酯類：棕櫚酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、3-甲基辛酸丁酯、2-甲基丁基乙酸酯、硬脂酸乙酯和2-乙基己基草酸己酯。說明使用突變酵母菌發(fā)酵可以在一定程度上提高葡萄酒的香氣成分。

酯類是葡萄酒中一類重要的香氣物質[15]。大多數(shù)酯類化合物是在發(fā)酵過程中形成的，這些化合物能夠賦予葡萄酒以水果香氣，尤其是乙酸酯類和乙基酯類[16]。經誘變后的菌種產生的酯類種類都為14種，含量為85.97%、83.77%，均多于出發(fā)菌株，菌株W1、W2發(fā)酵液含有酯類14種均多于菌株CF發(fā)酵液中的9種，菌株W1、W2產生的總酯含量均高于菌株CF產生的總酯含量。同時，菌株W1發(fā)酵液中總酯含量最高，乙酸異戊酯1.95%、辛酸乙酯45.99%、乙酸苯乙酯1.64%的含量均高于其在菌株CF發(fā)酵液、菌株W2發(fā)酵液中的含量。辛酸乙酯略帶有玫瑰、橙子的花果香氣，此香味為白蘭地酒特有的香氣[17]。乙酸異戊酯具有強烈的水果香氣，似香蕉味、梨的酸甜味[18]。菌株W1、W2發(fā)酵液中生成了菌株CF發(fā)酵液中沒有的酯類：棕櫚酸乙酯、3-甲基辛酸丁酯、2-甲基丁基乙酸酯、硬脂酸乙酯、2-乙基己基草酸己酯、硬脂酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯。酯類的增多使得香氣更加飽滿，結構更加立體。

圖5 出發(fā)菌株(A)、菌株W1(B)、菌株W2(C)發(fā)酵液中揮發(fā)性物質GCMS分析總離子流色譜圖Fig.5 Total ion chromatogram of volatile compounds in fermentation broth of parent strain(A),W1(B)and W2(C)strains by GC-MS

醇類主要來源于發(fā)酵、氨基酸的轉化及亞麻酸降解物的氧化[19]。其是葡萄酒發(fā)酵的主要產物，葡萄果實中的醇類物質含量較少，多數(shù)出現(xiàn)在葡萄酒中，并對香氣起重要作用[10]。高級醇是由酵母通過氨基酸代謝生成的香氣物質[20]。菌株W1產生的總醇含量為2.33%，高于菌株CF和W2的總醇含量，其分別是2.13%、1.40%。菌株W1發(fā)酵液中苯乙醇含量1.24%，高于菌株CF和W2酵母發(fā)酵液中苯乙醇的含量。苯乙醇是由苯丙氨酸代謝產生的，具有愉快的玫瑰花香、薔薇香氣、茉莉香、丁香、花粉味，它是葡萄酒中重要的呈香物質，與其他成分之間存在增效的效果，可以賦予葡萄酒濃郁優(yōu)雅的風味特征[21]。

表6 菌株CF、W1、W2純種發(fā)酵產生的揮發(fā)性化合物及其含量Table 6 Volatile compounds produced by strains CF,W1,W2 during pure fermentation

酸類、醛酮類、雜環(huán)及烷烴類占比相對較少，菌株CF發(fā)酵液中含有己酸、辛酸，而菌株W1、W2發(fā)酵液中只有己酸。菌株W2產酮能力高于出發(fā)菌株CF和W1。菌株W1、W2發(fā)酵液中雜環(huán)、烷烴含量均較出發(fā)菌株CF發(fā)酵液低。

3 結論

將全美梅奇酵母作為出發(fā)菌種，通過紫外誘變和微波誘變，30 W紫外照射5 min及2 450 MHz，700 W微波輻照30 s后，獲得四株性能良好的突變菌株W1、W2、W4、Z4，其產乙醇分別為2.63%、2.34%、3.01%、3.04%。同時突變菌株W1、W2、Z4發(fā)酵力增強，殘?zhí)呛糠謩e為13.6g/L、14.5g/L、15.2 g/L，使得葡萄糖利用率得到提高并且菌株W1、W2的各方面耐受性表現(xiàn)良好，兩株突變菌可耐受300 g/L葡萄糖以及300 mg/L二氧化硫，另外，菌株W1酒精耐受可達到9%vol，與出發(fā)菌株相比都有一定提升。香氣物質的測定結果表明菌株W1產生23種香氣成分，酯類、醇類、醛酮類含量均比出發(fā)菌株發(fā)酵液高，酯類、醇類含量比菌株W2發(fā)酵液高。產酯含量最高占總香氣含量的85.97%，同時產生了6種出發(fā)菌發(fā)酵液中沒有產生的酯類，香氣成分更加豐富、飽滿。綜合來看，突變菌株W1具有良好的耐受性和發(fā)酵性能，可以為釀造提供理想菌種。

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Mutation breeding of a non-Saccharomyces cerevisiaestrain

LIU Xinnan,ZONG Qianqian,LI Jinpeng,ZHANG Huiling*(Department of Food Science,College of Agriculture,Ningxia University,Yinchuan 750021,China)

Metschnikowia pulcherrimaas a parent strain was treated by ultraviolet(UV)mutagenesis and microwave mutagenesis.The results showed that the optimum mutation conditions were as follows:UV(30 W)irradiation 5 min,microwave irradiation(2 450 MHz,700 W)30 s.Two strains with better tolerance were obtained by primary screening and secondary screening.After aroma determination by GC-MS,by comparing the aroma types and contents,mutant strain W1 with tolerance of 300 g/L glucose,9%vol ethanol,300 mg/L SO2was obtained.The total ester content of the mutant strain W1 fermentation broth was 85.97%,and the total alcohol content was 2.33%,which were both higher than that of the parent strain and the mutant strain W2.The fermentation broth of strain W1 was full of fruit-based aroma,with Cabernet Sauvignon wine color,and suitable for application of wine-making.

Non-Saccharomyces cerevisiae;alcohol;mutagenesis;volatile substances

TS261.1

0254-5071（2017）01-0049-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.010

2016-08-19

國家自然科學基金（地區(qū)科學基金項目）（31360402）

劉鑫楠（1994-），女，本科生，研究方向為微生物發(fā)酵。

*通訊作者：張惠玲（1963-），女，教授，本科，研究方向為食品生物技術。