烏鱧（Channa argus）線粒體Ⅰ[QX）]基因序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

陳晨+賀晶晶+邵青臣+劉坤+王加連

摘要：為了進(jìn)一步探討烏鱧（Channa argus）的分類地位及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，通過測定其線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ（CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]）基因部分序列，并從GenBank獲取鱧科另外18種魚類的CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因同源序列，以銀鯧（Pampus argenteus）為外群，采用非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。結(jié)果表明：（1）支持鱧科分為鱧屬和副鱧屬；（2）烏鱧與同屬的斑鱧（C. maculata）等魚類的親緣關(guān)系較近。

關(guān)鍵詞：烏鱧；CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]；序列測定；系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號： S917文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0297-03

鱧科隸屬于魚綱鱸形目，包括2屬29種。其中鱧屬26種，分布于中東、南亞和東亞等地；而副鱧屬只有3種，主要分布于西非地區(qū)[1]。烏鱧（Channa argus）別稱北方蛇頭魚、黑魚、生魚、烏魚等，是鱧科鱧屬中個體大、生長快、經(jīng)濟(jì)價值高的名貴經(jīng)濟(jì)魚類。烏鱧原產(chǎn)于中國、俄羅斯和韓國，國內(nèi)主要分布于長江和黑龍江流域的大部分地區(qū)[2]，通常棲息于水草叢生、底泥細(xì)軟的靜水或微流水中。因烏鱧具有肉質(zhì)好、味道鮮美、營養(yǎng)豐富等特點，成為我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類。長期以來，人們關(guān)于烏鱧的形態(tài)學(xué)、生態(tài)學(xué)以及人工養(yǎng)殖技術(shù)等方面的研究較多，而關(guān)于其分子生物學(xué)資料則很少，其分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系尚存爭議。

線粒體DNA是真核生物細(xì)胞質(zhì)中的遺傳物質(zhì)，呈母系遺傳，具有分子量小、進(jìn)化速度較快、拷貝數(shù)量多等特點，且不易發(fā)生重組現(xiàn)象，已成為研究物種起源、進(jìn)化、分類及種群遺傳分化的理想工具。與其他動物一樣，線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ（CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]）基因是魚類線粒體13個蛋白編碼基因之一，中度保守，既能保證足夠的變異又易于被通用引物擴(kuò)增，在種群遺傳學(xué)研究中，可作為屬、種系統(tǒng)進(jìn)化研究的良好標(biāo)記，常被用于分析親緣關(guān)系較近物種的系統(tǒng)發(fā)育以及地理種群之間系統(tǒng)關(guān)系的分子工具。已有研究表明，線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因是許多魚類、昆蟲和鳥類等動物分類與鑒別的最適DNA條形碼之一[3-5]。

本研究對烏鱧線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因進(jìn)行擴(kuò)增和測序，并從GenBank下載部分鱧科魚類的同源序列進(jìn)行比較研究，初步分析它們之間的親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，以期為烏鱧的系統(tǒng)進(jìn)化及其種質(zhì)資源的保護(hù)和利用進(jìn)一步提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

烏鱧，購自鹽城市農(nóng)貿(mào)市場，活體帶回實驗室后，用于DNA提取。

1.2總DNA提取

取約200 mg樣品肌肉，采用傳統(tǒng)的酚-三氯甲烷方法提取基因組DNA。DNA經(jīng)沉淀、洗滌并干燥后，溶于100 μL TE緩沖液中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3PCR擴(kuò)增和測序

1.4數(shù)據(jù)分析

測序結(jié)果同GenBank中獲得的其他18種鱧科魚類的線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列合并（表1），用Clustal X 1.83軟件比對，確定變異位點；用MEGA 4.1軟件對序列進(jìn)行分析，并基于Kimura雙參數(shù)模型，計算上述不同序列的堿基組成、密碼子不同位點的堿基含量，以及相互間的遺傳距離等信息；以鱸形目鯧亞目鯧科的銀鯧（Pampus argenteus）為外群，用非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，通過重抽樣檢驗獲得系統(tǒng)樹分支的置信度（重復(fù)次數(shù)為1 000次）。

2結(jié)果與分析

2.1CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列分析

通過對烏鱧線粒體總DNA的提取、PCR擴(kuò)增和序列測定，得到長度為708 bp的基因序列，經(jīng)BLAST分析比較，證實所得序列為烏鱧CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因片段。分析該序列的堿基組成，其中T、C、A、G的含量分別為26.7%、31.1%、23.6%、 18.6%，A+T含量為50.3%，G+C含量為49.7%。從其堿基組成的偏向性看，G含量最低，A+T含量略高于G+C含量，這與其他魚類線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因同源序列的堿基特點相似[7-10]。

2.2遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育分析

遺傳距離多用來分析不同群體間的遺傳分化程度和群體內(nèi)的遺傳多樣性，數(shù)值越大，群體內(nèi)或群體間分化程度越高；數(shù)值越小，群體內(nèi)或群體間分化程度越低。根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型得到19種鱧科魚類之間的遺傳距離，其中烏鱧與斑鱧的遺傳距離最小，為0.002；烏鱧與月鱧等其他14種同屬魚類之間的遺傳距離為0.178～0.241；而烏鱧與同科副鱧屬3種魚類的遺傳距離則為0.239～0.253（表2）?？梢?，烏鱧與同屬的斑鱧等魚類間的分化程度較低，親緣關(guān)系較近，與副鱧屬魚類之間的分化程度相對較高。

基于線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因部分序列，采用非加權(quán)配對算術(shù)平均法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。圖1顯示，相對于鯧科銀鯧的外群，所有供分析鱧科的2屬19種魚類聚成1個單系群；在鱧科內(nèi)部，16種鱧屬魚類聚在一起形成單系，3種副鱧屬魚類聚成另1支，兩者互為姊妹群；烏鱧首先與斑鱧聚為1支，進(jìn)而與由小盾鱧、紅鱧、側(cè)眼鱧組成的單系群形成姊妹群關(guān)系，且具有較高的置信度，說明烏鱧與這些物種的親緣關(guān)系較近。

3討論

細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ（CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]）為線粒體13個蛋白編碼基因中研究得最清楚的基因之一。相對于線粒體其他序列如D-loop、Cyt b等，CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]的進(jìn)化速率較低，被廣泛用于魚類系統(tǒng)發(fā)育及DNA條形碼研究[11]。Hubert等通過對加拿大28科85屬190種共1 360尾淡水魚類樣本的研究，得出DNA條形碼可以有效應(yīng)用于淡水魚類、尤其是小個體魚類分類學(xué)和系統(tǒng)學(xué)研究的結(jié)論[12]。近年來，國內(nèi)學(xué)者也陸續(xù)開展了魚類DNA條形碼方面的研究工作，但迄今未見運(yùn)用CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因作為烏鱧DNA條形碼進(jìn)行分類及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究的報道。

為了進(jìn)一步揭示烏鱧的分類地位及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，本研究通過分子生物學(xué)技術(shù)獲得烏鱧線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因部分序列[CM（25]，聯(lián)合GenBank中其他18種鱧科魚類的

以其長度650 bp的同源序列為材料，進(jìn)行遺傳距離分析及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究。結(jié)果表明：鱧科魚類明顯分化為2支，分別代表鱧屬和副鱧屬，這與目前公認(rèn)的鱧科分類觀點一致[1，13]；鱧屬中烏鱧與斑鱧的親緣關(guān)系最近，與小盾鱧、紅鱧、側(cè)眼鱧等物種也有比較近的親緣關(guān)系，這與Li等以線粒體ND2及其側(cè)翼基因序列為材料所得到的研究結(jié)論[1]完全一致。

雖然本研究進(jìn)一步驗證了鱧科的分類狀況，也進(jìn)一步明確了烏鱧的分類地位及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，但由于受客觀條件的限制，本研究僅僅基于CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因的部分序列，研究對象也僅涉及到鱧科29個物種中的19種，因而研究結(jié)果仍然是初步的，還有待于我們從更多的鱧科物種、基于更豐富的線粒體基因或核基因材料，對烏鱧分類地位及鱧科魚類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行更加系統(tǒng)的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Li X，Musikasinthorn P，Kumazawa Y. Molecular phylogenetic analyses of snakeheads （Perciformes：Channidae） using mitochondrial DNA sequences[J]. Ichthyological Research，2006，53（2）：148-159.

[2]董新培，穆淑梅，周楠，等. 不同地理群體烏鱧線粒體DNA控制區(qū)結(jié)構(gòu)分析及遺傳多樣性[J]. 水產(chǎn)學(xué)報，2014，38（9）：1277-1285.

[3]劉連為，許強(qiáng)華，陳新軍. 基于線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]和Cytb基因序列的北太平洋柔魚種群遺傳結(jié)構(gòu)研究[J]. 水產(chǎn)學(xué)報，2012，36（11）：1675-1684.

[4]張迪，雷光春，龔成，等. 基于CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的太湖新銀魚遺傳多樣性[J]. 湖泊科學(xué)，2012，24（2）：299-306.

[5]于亞男，宋超，侯俊利，等. 基于線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因部分序列的長江口蝦虎魚科魚類系統(tǒng)分類[J]. 淡水漁業(yè)，2014，44（5）：3-8.

[6]Ivanova N V，Zemlak T S，Hanner R H，et al. Universal primer cocktails for fish DNA barcoding[J]. Molecular Ecology Notes，2007，7（4）：544-548.[HJ1.7mm]

[7]郭奕惠，喻達(dá)輝，黃桂菊，等. 中國主要養(yǎng)殖羅非魚親緣關(guān)系的CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列分析[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，28（1）：75-79.

[8]孟瑋，楊天燕，海薩，等. 基于線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的亞東鮭DNA條形碼研究[J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志，2010，23（1）：6-10.

[9]董麗娜，黃梓榮，艾紅，等. 北部灣3種金線魚屬魚類CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的比較分析[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2011，18（3）：508-514.[ZK）]

[10]趙明，宋煒，馬春艷. 基于線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的棘頭梅童魚7個野生群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2015，22（2）：233-242.