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    響應(yīng)面法優(yōu)化蛇床子中蛇床子素的酶法提取工藝

    2017-02-15 19:51:31寧娜??韓建軍??胡宇莉鄒宗堯?
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年8期
    關(guān)鍵詞:蛇床子提取

    寧娜??+韓建軍??+胡宇莉++鄒宗堯??+郁建生

    摘要:采用蛇床子素作為原料,通過酶法從蛇床子中提取蛇床子素,并以蛇床子素提取率為指標(biāo),研究料液比、酶種類、酶用量等因素的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間以及酶解pH值進(jìn)行了4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。結(jié)果表明,最優(yōu)提取條件為料液比 1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量(纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1)10.4 mg/g、酶解溫度46 ℃、酶解時(shí)間125 min、酶解pH值4.6,在此條件下蛇床子素的提取率可達(dá)95.13 %。

    關(guān)鍵詞:蛇床子;蛇床子素;復(fù)合酶;提?。豁憫?yīng)曲面法

    中圖分類號(hào): R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼:

    文章編號(hào):1002-1302(2016)08-0169-05

    床子為傘形科植物蛇床[Cnidium monnieri (L.) Cuss.]的干燥成熟果實(shí),具有燥濕祛風(fēng)、殺蟲止癢、溫腎壯陽之功效,臨床上用于陰癢帶下、宮冷不孕等癥[1]。蛇床子中含有香豆素類[2]、酚苷類[3]、揮發(fā)油[4]等多種化學(xué)成分,其中蛇床子素是蛇床子藥材的質(zhì)控成分[1]。體內(nèi)藥理研究表明蛇床子素具有抗炎[5]、神經(jīng)保護(hù)[6]、降血糖[7]等活性。

    目前已報(bào)道的從蛇床子中提取蛇床子素的方法主要有乙醇回流法[8-9]、超聲法[10]、微波法[11]等。生物酶解技術(shù)是通過生物酶破壞植物細(xì)胞壁從而促進(jìn)有效成分提取,該方法具有提取效率高、反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)且易于控制等優(yōu)點(diǎn)[12-14]。現(xiàn)在越來越多的研究將生物酶解技術(shù)應(yīng)用于中藥有效成分的提取中,以達(dá)到提高有效成分的提取率、縮短提取時(shí)間、減少提取溶劑用量等目的[15-17]。采用生物酶解技術(shù)提取蛇床子中蛇床子素的研究尚未見報(bào)道。本研究采用生物酶提取蛇床子中蛇床子素成分,并通過響應(yīng)面法優(yōu)化該提取工藝,為蛇床子中蛇床子素的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

    1材料與方法

    1.1試劑與儀器

    蛇床子藥材購于河北安國中藥材市場(chǎng),經(jīng)鑒定為傘形科植物蛇床子[Cnidium monnieri (L.) Cuss.]的干燥成熟果實(shí);蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院;纖維素酶(酶活性為22 000 U/g)購自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司;水為重蒸水,乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。

    Agilent 1100高效液相色譜儀(手動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)、四元泵、DAD檢測(cè)器和Agilent ChemStation 色譜工作站),美國Agilent公司生產(chǎn);SK8200H 超聲清洗器,上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司生產(chǎn);pHS-3C精密pH計(jì),上海光學(xué)儀器廠生產(chǎn);METTLER AE240型十萬分之一電子天平,德國梅特勒公司生產(chǎn);RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn);DK-S26電熱恒溫水浴鍋,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn);FZ102微型植物粉碎機(jī),天津泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)。

    1.2試驗(yàn)方法

    1.2.1HPLC法測(cè)定蛇床子素的含量

    1.2.1.1色譜條件Agiletn Zorbax SB-C18柱(5 μm,4.6 ×250.0 mm2);流動(dòng)相:乙腈/水(65/35,V/V);流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長:322 nm;進(jìn)樣量:10 μL。該色譜條件下理論塔板數(shù)以蛇床子素峰計(jì)算不低于3 000。該色譜條件下測(cè)定蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品及蛇床子藥材得到的色譜圖見圖1。

    1.2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱定蛇床子素對(duì)照品 12.5 mg 置于25 mL容量瓶中,并用無水乙醇定容至刻度,搖勻,分別精確量取此溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至10 mL容量瓶中,并用無水乙醇定容至刻度,搖勻。分別精密吸取上述所配制的對(duì)照品溶液各10 μL注入液相色譜儀,按照上述色譜條件測(cè)定。以測(cè)得的峰面積y為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛇床子素質(zhì)量濃度在5~50 μg/mL 范圍時(shí),線性方程為y=18 467.46x-3 362.07,相關(guān)系數(shù)r=0.999 7,線性良好。

    1.2.1.3蛇床子藥材中蛇床子素的含量測(cè)定本研究所用的蛇床子藥材按照《中國藥典》2010版一部蛇床子項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測(cè)定,表明本試驗(yàn)中所用蛇床子藥材中蛇床子素的含量為1. 65%。

    1.2.2蛇床子素的提取及提取率的計(jì)算取干燥的蛇床子藥材用中藥材粉碎機(jī)粉碎,過40目篩,取10 g 蛇床子粉末加入一定量的生物酶后,再按照一定的料液比加入蒸餾水,在一定溫度、pH值條件下酶解一定時(shí)間后,過濾,收集提取液,并將所得提取液濃縮后,用無水乙醇定容至100 mL,備用。用移液管精密吸取上述定容后的蛇床子提取液0.7 mL轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,加無水乙醇定容至刻度,搖勻,所得溶液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后,取續(xù)濾液10 μL按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,并根據(jù)峰面積計(jì)算蛇床子素的提取率。蛇床子素提取率的計(jì)算公式:蛇床子素提取率=提取出的蛇床子素質(zhì)量/蛇床子藥材中蛇床子素質(zhì)量×100%。

    2結(jié)果與分析

    2.1單因素試驗(yàn)

    2.1.1酶種類對(duì)蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取10 g蛇床子粉末,加300 mL 蒸餾水,分別加入酶用量為10 mg/g的纖維素酶、果膠酶、復(fù)合酶(纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=2 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]2),在酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃的條件下酶解時(shí)間120 min后,過濾,收集濾液,并計(jì)算蛇床子素提取率,結(jié)果見圖2。

    由圖2可知,與單一酶相比,由不同比例的纖維素酶和果膠酶組合成的復(fù)合酶對(duì)蛇床子中蛇床子素均有較好的提取效果。當(dāng)纖維素酶和果膠酶按1 ∶[KG-*3]1組合用于酶解提取時(shí),蛇床子素的提取率最高,因此選用復(fù)合酶(纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1)提取蛇床子素。

    2.1.2料液比對(duì)蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取10 g蛇床子粉末,按照不同料液比(1 ∶[KG-*3]10、1 ∶[KG-*3]20、1 ∶[KG-*3]30、1 ∶[KG-*3]40、1 ∶[KG-*3]50,g ∶[KG-*3]mL)加入蒸餾水,在復(fù)合酶(纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1)用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃的條件下酶解時(shí)間120 min后,過濾,收集濾液,并計(jì)算蛇床子素提取率,結(jié)果見圖3。

    由圖3可知,料液比小于1 g ∶[KG-*3]30 mL時(shí),蛇床子素提取率隨著溶劑用量的增加而增大。當(dāng)料液比為1 g ∶[KG-*3]30 mL時(shí)蛇床子素提取率達(dá)到最大,此后隨著溶劑用量的進(jìn)一步增加,蛇床子素提取率呈下降趨勢(shì)。這是由于過多的溶劑會(huì)使提取溶液中生物酶的有效濃度降低,同時(shí),提取溶劑用量過大也會(huì)增加后續(xù)濃縮過程的工作量。因此提取溶劑的料液比選定為1 g ∶[KG-*3]30 mL。

    2.1.3酶用量對(duì)蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取10 g蛇床子粉末,加300 mL 蒸餾水,加入一定量的由纖維素與果膠酶按1 ∶[KG-*3]1組合成的復(fù)合酶(6、8、10、12、14 mg/g),在酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃的條件下酶解時(shí)間120 min后,過濾,收集濾液,并計(jì)算蛇床子素提取率,結(jié)果見圖4。

    由圖4可知,酶用量在6~10 mg/g時(shí),蛇床子素提取率隨酶用量的增加而明顯升高,當(dāng)酶用量超過10 mg/g時(shí),蛇床子素提取率增加的趨勢(shì)有所平緩。因此酶用量宜選擇在 10 mg/g 左右。

    2.1.4酶解溫度對(duì)蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取10 g蛇床子粉末,加300 mL 蒸餾水,復(fù)合酶(纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1)用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0,在一定酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)下酶解120 min后,過濾,收集濾液,并計(jì)算蛇床子素提取率,結(jié)果見圖5。

    由圖5可知,當(dāng)酶解溫度低于50 ℃時(shí),蛇床子素提取率隨著酶解溫度的升高而增加,當(dāng)酶解溫度達(dá)到50 ℃時(shí),蛇床子素提取率達(dá)到最大。隨著酶解溫度的進(jìn)一步升高,蛇床子素提取率有所下降。這是因?yàn)榈陀谏锩傅淖钸m溫度時(shí),溫度升高可促進(jìn)生物酶活性的增強(qiáng),而高于生物酶的最適溫度時(shí)可引起酶蛋白的變性,從而降低生物酶的催化活力。因此酶解溫度宜選擇在50 ℃左右。

    2.1.5酶解時(shí)間對(duì)蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取10 g蛇床子粉末,加300 mL 蒸餾水,在復(fù)合酶(纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1)用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0、酶解溫度為 50 ℃ 的條件下酶解一定時(shí)間(60、120、180、240、300 min)后,過濾,收集濾液,并計(jì)算蛇床子素提取率,結(jié)果見圖6。

    由圖6可知,酶解時(shí)間在60~120 min時(shí),蛇床子素提取率隨著酶解時(shí)間延長而明顯升高。當(dāng)酶解時(shí)間超過120 min時(shí),蛇床子素提取率增加的趨勢(shì)有所平緩。因此酶解時(shí)間宜選在120 min左右。

    2.1.6酶解pH值對(duì)蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取 10 g 蛇床子粉末,加300 mL蒸餾水,復(fù)合酶(纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1)用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃,在一定pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)的條件下酶解120 min后,過濾,收集濾液,并計(jì)算蛇床子素提取率,結(jié)果見圖7。

    2響應(yīng)面分析響應(yīng)曲面陡峭程度可反映各個(gè)因素及因素交互作用對(duì)蛇床子素提取率影響的強(qiáng)弱。由圖8可知,在各個(gè)因素中,酶用量對(duì)蛇床子素提取率的影響最大,酶解pH值的影響次之,酶解溫度和酶解時(shí)間的影響均較?。唤换プ饔弥?,酶用量與酶解溫度、酶解溫度和酶解pH值的交互作用對(duì)蛇床子素提取率影響較強(qiáng),而酶用量與酶解時(shí)間、酶用量與酶解pH值、酶解溫度與酶解時(shí)間、酶解時(shí)間與酶解pH值交互作用的影響較弱,與上述方差分析結(jié)果一致。

    2.2.3最佳工藝條件及模型驗(yàn)證經(jīng)過Design-Expert 8.0.6 軟件分析,結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,得到酶法提取蛇床子中蛇床子素的最佳工藝條件為料液比 1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量(纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1)10.44 mg/g、酶解溫度45.99 ℃、酶解時(shí)間124.64 min、酶解pH值4.58,蛇床子中蛇床子素的理論提取率為95.43%。為驗(yàn)證方法的可行性,采用上述條件對(duì)蛇床子中蛇床子素進(jìn)行提取,考慮到試驗(yàn)操作的可控性,將得到的優(yōu)化條件修正為料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量(纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1)10.4 mg/g、酶解溫度46 ℃、酶解時(shí)間 125 min、酶解pH值4.6,進(jìn)行3組平行試驗(yàn),測(cè)定蛇床子素的實(shí)際平均提取率為95.13 %,試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)相對(duì)誤差僅為 0.3%,較為接近,驗(yàn)證了響應(yīng)曲面法回歸模型的合理性。通過本試驗(yàn)結(jié)果與已經(jīng)報(bào)道的文獻(xiàn)結(jié)果[8-11]對(duì)比,可知生物酶解技術(shù)可有效提高蛇床子中蛇床子素的提取率,不僅可減少有機(jī)溶劑的使用,同時(shí)極大地縮短了提取時(shí)間,可為工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

    3結(jié)論

    通過單因素試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析,得到優(yōu)化的酶法提取蛇床子中蛇床子素的工藝提取條件為料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量(纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1)10.4 mg/g、酶解溫度46 ℃、酶解時(shí)間125 min、酶解pH值 4.6,在此條件下蛇床子素的提取率可達(dá)95.13 %,

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