華根霉生物酶法合成己酸乙酯條件的研究

劉雪，楊愛華，張學(xué)梅，曹建全，孫麗臻

（1.山東景芝酒業(yè)股份有限公司，山東景芝262119；2.山東省釀造食品生物發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東景芝262119）

華根霉生物酶法合成己酸乙酯條件的研究

劉雪1，2，楊愛華1，張學(xué)梅1，曹建全1，2，孫麗臻1，2

（1.山東景芝酒業(yè)股份有限公司，山東景芝262119；2.山東省釀造食品生物發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東景芝262119）

華根霉發(fā)酵可產(chǎn)酯化酶，在一定條件下能夠催化己酸與乙醇反應(yīng)生成己酸乙酯，以合成的己酸乙酯含量為指標(biāo)對己酸乙酯的酯化合成條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)，確定了各因素的最佳水平。通過優(yōu)化確立了酯化液的反應(yīng)體系：以老窖泥富集液與無水乙醇按照10∶90的比例配成100m L反應(yīng)體系，添加3%的己酸，再以100 g/L華根霉麩曲作為粗酶制劑添加入體系中，置于100m L的具塞三角瓶中，25℃下，反應(yīng)25 d，合成的己酸乙酯可達(dá)2302mg/100mL。

酯化酶；己酸；乙醇；己酸乙酯

己酸乙酯是濃香型白酒的主體香味成分[1-2]，白酒在自然發(fā)酵過程中，窖泥中的產(chǎn)酸菌所產(chǎn)生的己酸與酵母所產(chǎn)生的乙醇，在大曲酯化酶的催化作用下可發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成己酸乙酯[3-4]。但在自然條件下，通過這個(gè)途徑產(chǎn)生己酸乙酯非常有限，為了提高己酸乙酯的含量，突出濃香型白酒的風(fēng)味，不得不尋找其他合成途徑，例如化學(xué)合成己酸乙酯的研究，李繼忠[5]利用對甲苯磺酸催化合成己酸乙酯，產(chǎn)率可達(dá)94.44%。張應(yīng)軍等[6]利用固體超強(qiáng)酸SO42-/Fe2O3-CoO催化合成己酸乙酯，其轉(zhuǎn)化率可達(dá)97%。在文獻(xiàn)中關(guān)于酶法合成酯的報(bào)道也很多，例如王濤等利用白酒釀造相關(guān)酵母發(fā)酵產(chǎn)己酸乙酯，己酸乙酯含量提高了3倍[7]。趙磊等利用響應(yīng)面法優(yōu)化無溶劑體系酶法合成己酸乙酯，使己酸乙酯含量得到了提高[8]。而通過生物酶法催化合成己酸乙酯在美國聯(lián)邦法及外文文獻(xiàn)中都認(rèn)為是天然香料，綠色健康，自然感強(qiáng)，對于穩(wěn)定和提高濃香型白酒的質(zhì)量具有十分重要的意義[9]。

本研究的主要內(nèi)容是引進(jìn)1株酯化酶活力較高的華根霉菌株，將其制成麩曲作為粗酶制劑，用以催化己酸與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)，提高酒體中酯的含量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌種：華根霉F8，中科院成都生物研究所。

老窖泥富集液：己酸菌復(fù)合菌液與老窖泥的擴(kuò)增富集液（富含己酸等）。

麩皮：購買自當(dāng)?shù)匦迈r麩皮。

試劑：己酸、無水乙醇等均為分析純。

儀器設(shè)備：DNP型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5804R臺式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；氣相色譜儀，美國Agilent7820A型氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測器,分流/不分流進(jìn)樣口。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 華根霉F8麩曲的培養(yǎng)

1.2.1.1 一級試管培養(yǎng)

制備MES培養(yǎng)基→分裝試管→滅菌→擺斜面→接種→培養(yǎng)→一級試管菌種→4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 二級試管培養(yǎng)

麩皮+水（1∶0.9）→裝試管→制備斜面→滅菌→自一級試管接種→培養(yǎng)至孢子豐富→二級試管菌種→低溫保藏。

1.2.1.3 三角瓶培養(yǎng)

麩皮+水（1∶0.9）→裝瓶→滅菌→自二級試管接種→每隔12 h扣瓶1次→培養(yǎng)至孢子豐富→取出→30℃烘干備用。

1.2.2 華根霉生物合成己酸乙酯的體系及反應(yīng)時(shí)間的初步確定

取60 m L老窖泥富集液與40 m L無水乙醇配成100m L反應(yīng)體系，添加2%的己酸，添加5 g華根霉麩曲作為粗酶制劑至體系中，置于100m L的具塞三角瓶中，33℃下，反應(yīng)35 d，每隔5 d取樣測定己酸乙酯合成情況，根據(jù)己酸乙酯合成情況初步確立酯化時(shí)間。

1.2.3 影響己酸乙酯合成的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 老窖泥富集液與無水乙醇比例對己酸乙酯合成的影響

按一定比例將老窖泥富集液與無水乙醇配成100m L反應(yīng)體系（二者比例分別為：60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80、10∶90），添加2%的己酸、5 g粗酶制劑，置于100m L的具塞三角瓶中，分別在33℃酯化溫度下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后測定己酸乙酯合成情況，確立老窖泥富集液與無水乙醇的最佳配比。

1.2.3.2 己酸濃度對己酸乙酯合成的影響

按照1.2.3.1優(yōu)化的最佳配比進(jìn)行反應(yīng)體系的配制，分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%、3%的己酸、5 g粗酶制劑，置于100m L的具塞三角瓶中，分別于33℃下反應(yīng)一定時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后測定己酸乙酯合成情況，以確定最適己酸添加比例。

1.2.3.3 華根霉麩曲添加量對己酸乙酯合成的影響

按照1.2.3.1優(yōu)化的最佳配比進(jìn)行反應(yīng)體系的配制，添加最適比例的己酸，分別加入4 g、5 g、6 g、7 g、8 g、9 g、10 g（干重）粗酶制劑于100m L的具塞三角瓶中，分別于33℃溫度下反應(yīng)一定時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后測定己酸乙酯合成情況，以確定最適華根霉麩曲的添加比例。

1.2.3.4 酯化溫度對己酸乙酯合成的影響

按照1.2.3.1優(yōu)化的最佳配比進(jìn)行反應(yīng)體系的配制，添加最適比例的己酸和粗酶制劑后，置于100m L的具塞三角瓶中，分別于20℃、25℃、28℃、30℃、33℃、35℃、37℃下反應(yīng)一定時(shí)間，定時(shí)搖瓶混勻，反應(yīng)結(jié)束后測定己酸乙酯合成情況，根據(jù)己酸乙酯合成情況確立最佳酯化溫度。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)分析

選用正交法，對以上篩選出的最適老窖泥富集液與無水乙醇配比、最佳己酸濃度以及最適華根霉麩曲添加量、最佳酯化溫度等單因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選出最佳酯化條件組合。選用4因素3水平L9(34)正交表，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L9(34)

1.2.5 氣相色譜分析己酸乙酯的含量

色譜柱：DNP 2 m不銹鋼填充柱。柱溫：柱溫105℃。

載氣：99.999%高純氮，氮?dú)猓?0m L/m in，氫氣：30m L/m in，空氣：300m L/m in，檢測室溫度：140℃，進(jìn)樣口溫度：140℃，柱流速：18m L/m in，進(jìn)樣量1μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯化時(shí)間的確定（圖1）

圖1 延長酯化時(shí)間對己酸乙酯的變化情況

由圖1可知，在一定體系下，隨著酯化時(shí)間的延長，己酸乙酯迅速合成，在反應(yīng)25 d時(shí)達(dá)到最高，為108.4mg/100m L。反應(yīng)25 d后己酸乙酯的合成速度明顯變緩慢，在后續(xù)進(jìn)行單因素合成實(shí)驗(yàn)中為了減少實(shí)驗(yàn)周期，提高效率，選擇25 d為最佳酯化時(shí)間。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 老窖泥富集液與無水乙醇的配比的確定

按照一定比例調(diào)整反應(yīng)底物的濃度，在33℃條件下酯化25 d后測定己酸乙酯的合成情況，結(jié)果見圖2，隨著無水乙醇含量的提高，己酸乙酯的合成逐漸也在提高，當(dāng)老窖泥富集液和無水乙醇的比例提高至10∶90時(shí)，己酸乙酯含量迅速達(dá)到最高值，由此可推測酒精含量越高越有利于己酸乙酯的合成，因此選擇老窖泥富集液和無水乙醇的最佳比例為10∶90，此時(shí)己酸乙酯產(chǎn)量達(dá)505.6mg/100m L。

圖2 老窖泥富集液與無水乙醇配比對己酸乙酯合成的影響

2.2.2 己酸濃度的確定

己酸添加量低會影響己酸乙酯的合成，而據(jù)報(bào)道，酶催化反應(yīng)為可逆反應(yīng)，當(dāng)酸達(dá)到一定量時(shí)酯化酶會催化酯分解[10]。因此合適的己酸添加量對于穩(wěn)定己酸乙酯的合成有重要作用。

將老窖泥富集液與無水乙醇按照10∶90的比例配制反應(yīng)體系，并分別添加不同濃度的己酸，在33℃下反應(yīng)25 d后測定己酸乙酯的合成情況，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著己酸濃度的提高，己酸乙酯含量也逐漸升高，表明在酯化反應(yīng)中，作為底物之一的乙醇在含量充足時(shí)，適當(dāng)提高另一關(guān)鍵底物——己酸的含量會促進(jìn)酯化反應(yīng)的正向進(jìn)行，但實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)己酸含量超過3%時(shí)往往會隨著蒸餾進(jìn)入酒體而影響酒體的品質(zhì)，因此選擇3%的己酸濃度作為最終反應(yīng)濃度。

圖3 己酸濃度對己酸乙酯合成的影響

2.2.3 華根霉麩曲添加量的確定

將老窖泥富集液與無水乙醇按照10∶90的比例配制反應(yīng)體系，添加3%己酸，將華根霉麩曲的添加量進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，在33℃下反應(yīng)25 d后測定己酸乙酯的合成情況，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著麩曲添加量的增加，己酸乙酯的合成也逐漸提高。在酯化液的實(shí)際生產(chǎn)中也發(fā)現(xiàn)增加麩曲的使用量會提高己酸乙酯的合成量，但麩曲使用太多會引起攪拌困難、管道堵塞等問題，因此我們選擇華根霉麩曲的添加量最高為100 g/L，此時(shí)己酸乙酯的合成量達(dá)836.5mg/100m L。

圖4 華根霉麩曲添加量對己酸乙酯合成的影響

2.2.4 酯化溫度的優(yōu)化

將老窖泥富集液與無水乙醇按照10∶90的比例配制反應(yīng)體系，添加3%己酸、100 g/L華根霉麩曲，調(diào)整酯化溫度，反應(yīng)25 d后進(jìn)行己酸乙酯合成情況的分析，結(jié)果見圖5。

圖5 酯化溫度對己酸乙酯合成的影響

由圖5可知，在一定的反應(yīng)體系中，隨著酯化溫度的提高，己酸乙酯的合成逐漸降低，主要是由于高溫下酯化酶的活力下降而引起的，但因?qū)嶋H生產(chǎn)中溫度受季節(jié)變化影響較大，溫度低于25℃時(shí)不易調(diào)控且穩(wěn)定性差，雖然在25℃下己酸乙酯的合成能力稍低于20℃，但增長幅度相對緩慢，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況我們選擇25℃為最適的酯化溫度，此時(shí)己酸乙酯的合成量為2193.75mg/100m L。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

通過單因素實(shí)驗(yàn)，選取老窖泥富集液與無水乙醇配比、己酸濃度、麩曲添加量、酯化溫度4個(gè)條件進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

通過對表2結(jié)果中的極差(R)分析可知，各因素作用的主次順序?yàn)锽＞A＞C＞D，即老窖泥富集液與無水乙醇的配比＞酯化溫度＞己酸濃度＞麩曲添加量。通過對K值的計(jì)算得出華根霉麩曲酯化反應(yīng)的最優(yōu)酯化組合為A1B3C3D3，即酯化溫度為25℃，老窖泥富集液與無水乙醇的配比為10∶90，己酸添加量為3%，華根霉麩曲添加量為100 g/L，進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即老窖泥富集液和無水乙醇以10∶90配制反應(yīng)體系，添加3%的己酸和100 g/L的華根霉麩曲，在25℃下酯化25 d，測得己酸乙酯含量為2034.5mg/100m L，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正交表中的3號實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性，由此可確定該組合為最優(yōu)組合。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3 結(jié)果與討論

本研究的主要內(nèi)容是引進(jìn)1株酯化酶活力較高的華根霉菌株，將其制成粗酶制劑，用以催化己酸與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)，提高酒體中酯的含量，通過對其酯化反應(yīng)條件包括酯化時(shí)間、酯化溫度、老窖泥富集液與無水乙醇配比、己酸濃度、華根霉麩曲添加量等進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，確定了酯化反應(yīng)的最佳條件，通過設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了反應(yīng)條件的最佳組合，即老窖泥富集液與無水乙醇的配比為10∶90，添加3%的己酸，再加入100 g/L華根霉麩曲作為粗酶制劑添加入體系中，置于100m L的具塞三角瓶中，25℃下，反應(yīng)25 d，合成的己酸乙酯產(chǎn)量可達(dá)2302mg/100m L。

研究中為了縮短實(shí)驗(yàn)周期，提高效率，使用的酯化時(shí)間為25 d，但實(shí)際生產(chǎn)中可根據(jù)反應(yīng)體系中底物濃度適當(dāng)延長酯化時(shí)間，這樣既有利于底物反應(yīng)的充分徹底，又能提高產(chǎn)物的產(chǎn)量。另外實(shí)際生產(chǎn)中麩曲的使用會造成攪拌困難和易堵塞管道等情況，若可實(shí)現(xiàn)華根霉菌絲體的大量培育，可嘗試以粉碎的華根霉菌絲來代替華根霉麩曲作為酯化酶粗酶制劑使用，這也將是今后的研究方向之一。

[1]曹建全,趙德義,孫偉.機(jī)械化條件下流酒速度對濃香酒質(zhì)量的影響[J].釀酒,2016,3(43)：43-46.

[2]孫寶國,吳繼紅,黃明泉,等.白酒風(fēng)味化學(xué)研究進(jìn)展[J].中國食品學(xué)報(bào),2015(9)：1-7.

[3]唐瑞.己酸菌、窖泥與濃香型白酒之間的關(guān)系[J].釀酒,2005,33 (4)：24-27.

[4]隋延鐸.產(chǎn)酯酵母在白酒生產(chǎn)過程中的應(yīng)用[J].釀酒,2004(3)：16.

[5]李繼忠.對甲苯磺酸催化合成己酸乙酯的研究[J].化學(xué)工程師, 2004(3)：4-5.

[6]張應(yīng)軍,程海軍.固體超強(qiáng)酸SO42-/Fe2O3-CoO催化合成己酸乙酯[J].化學(xué)工程師,2005(11)：55-58.

[7]王濤,姚韜,李濤,等.濃香型白酒釀造相關(guān)酵母發(fā)酵糟醅產(chǎn)己酸乙酯的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2013(1)：41-45.

[8]趙磊,程玥,王成濤.響應(yīng)面法優(yōu)化無溶劑體系酶法合成己酸乙酯[J].食品科學(xué),2012(12)：12-17.

[9]徐大剛,肖祿生,蔡揚(yáng),等.用脂肪酶非水相生物催化合成己酸乙酯的研究[J].精細(xì)化工,2004(4)：279-281.

[10]馬紅霞,李維,李晶晶,等.高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母在清香型白酒中的應(yīng)用研究[J].釀酒科技,2015(5)：8-10.

Esterification Synthesis of Ethyl Caproateby Using Rhizopus chinensis

LIU Xue1,2,YANG Aihua1,ZHANG Xuemei1,CAO Jianquan1,2and SUN Lizhen1,2
(1.Jingzhi Distillery Co.Ltd.,Jingzhi,Shandong 262119;2.Key Lab of Bio-fermentation Technology,Jingzhi,Shandong 262119,China)

Esterifying enzyme produced by the fermentation of Rhizopus chinensis can catalyze hexanoic acid and ethanol to produce ethyl caproate under certain conditions.The optimum synthesis conditions of ethyl caproate were determined by single factor test and orthogonal test.The best reaction system of esterifying liquid were determined as follows:100m L reaction system was prepared by mixing aged pit mud enrichment liquid with anhydrous ethanol at the ratio of 10∶90,adding 3%hexanoic acid,and adding 100 g/L Rhizopus chinensis starter as the crude enzyme.The reaction system was placed into 100mL flask with a plug,after25 dreaction at25℃,the yield of ethyl caproate reached up to 2302mg/100m L.

esterifying enzyme;hexanoic acid;ethanol;ethyl caproate

TS262.3；TS261.1

A

1001-9286（2017）02-0057-04

10.13746/j.njkj.2016343

2016-11-21；

2016-12-13

劉雪（1986-），女，山東青島人，工程師，微生物學(xué)碩士研究生，山東景芝酒業(yè)股份有限公司技術(shù)中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室主任。

曹建全（1965-），男，山東濰坊人，高級工程師，山東景芝酒業(yè)股份有限公司技術(shù)中心副主任，參與編寫《白酒釀造工高級技師培訓(xùn)教程》、《高級釀酒師培訓(xùn)教程》等論著。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-01-13；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170113.1407.001.htm l。