高效液相色譜法測(cè)定疏清浸膏中靛玉紅的含量

張微微，譚曉川，車宏偉，方夏琴，張宇佳，鄭穩(wěn)生

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所藥物制劑室，北京 100050)

高效液相色譜法測(cè)定疏清浸膏中靛玉紅的含量

張微微*，譚曉川，車宏偉，方夏琴，張宇佳，鄭穩(wěn)生#

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所藥物制劑室，北京 100050)

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定疏清浸膏中靛玉紅的含量。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為WondaSil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(V∶V=75 ∶25)，流速為0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)289 nm。結(jié)果：靛玉紅質(zhì)量濃度在0.201 2～20.120 0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；樣品溶液在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定，RSD=1.48%；重復(fù)性試驗(yàn)的RSD=1.38%；平均加樣回收率為101.9%，RSD=1.77%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為靛玉紅的質(zhì)量控制方法。

高效液相色譜法； 靛玉紅； 疏清浸膏； 質(zhì)量控制； 提取物

疏清顆粒是由甘草、蘆根、桑葉、大青葉等中藥組成的復(fù)方制劑，其功能主治為清熱解毒、宣泄肺胃，用于小兒急性上呼吸道感染屬風(fēng)熱證。在原方基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)制成疏清口服溶液，經(jīng)提取后，保留了原方中各藥材有效成分，用藥途徑與原方相同，制成口服液后方便使用，同時(shí)還能增加兒童順應(yīng)性。該方中大青葉的作用為清熱解毒、涼血消斑，用于溫病高熱、神昏、發(fā)斑發(fā)疹、痄腮、喉痹、丹毒、癰腫[1]，是該方的主要藥材，靛玉紅為該藥的質(zhì)量控制成分。本研究建立了疏清浸膏中靛玉紅的含量測(cè)定方法。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(普析L600，UVD，北京普析通用公司)； BSA4235-C型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試劑

靛玉紅對(duì)照品(批號(hào)： 110717-200204，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供)；疏清浸膏由吉林華康藥業(yè)股份有限公司提供；甲醇為色譜純，水為蒸餾水，其他試劑為分析純或色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 疏清浸膏的制備

取大青葉、蘆根、桑葉、甘草藥材(質(zhì)量比為3∶3∶3∶1)適量，粉碎[2]，按照《中華人民共和國(guó)藥典·四部》(2015年版)流浸膏劑項(xiàng)下滲漉法[3]，加75%乙醇浸漬72 h，收集滲漉液，減壓回收乙醇，并濃縮為相對(duì)密度1.35～1.38(75 ℃)的浸膏。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液：取靛玉紅對(duì)照品約5 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，加少量三氯甲烷溶解并用甲醇稀釋至刻度[4]，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液1 ml，置5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得每1 ml中約含10.00 μg的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液：取“2.1”項(xiàng)下疏清浸膏約2 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min[5]，于室溫(25 ℃)中放置，用甲醇稀釋至刻度[6]，搖勻。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液：按照處方比例，取缺少大青葉的藥材按照制備工藝制備浸膏，精密稱取該浸膏約2 g，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為WondaSil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(V∶V=75 ∶25)；檢測(cè)波長(zhǎng)為289 nm[7]；柱溫為35 ℃；色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取靛玉紅對(duì)照品貯備液0.1、2.0、4.0、8.0、10.0 ml置25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.201 2、4.024 0、8.048 0、16.096 0、20.120 0 μg/ml的對(duì)照品溶液，精密量取上述溶液各10 μl，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定峰面積。以靛玉紅峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、靛玉紅含量為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=8×107X-10 382(r=0.999 5，n=5)。表明靛玉紅質(zhì)量濃度在0.201 2～20.120 0 μg/ml范圍內(nèi)[8]有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取質(zhì)量濃度為10.000 0 μg/ml的對(duì)照品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定靛玉紅的峰面積。結(jié)果表明，靛玉紅峰面積的RSD=0.608%，儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，共6份，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定峰面積。結(jié)果靛玉紅的平均含量為120.67 μg/g，RSD=1.38%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取新配制的“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積[9]。靛玉紅峰面積的RSD=1.48%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的疏清浸膏6份，分別準(zhǔn)確加入靛玉紅對(duì)照品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，見表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

取疏清浸膏2 g，精密稱定，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取供試品溶液和“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各10 μl，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算，見表2。

表l 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 靛玉紅含量測(cè)定結(jié)果(n=10)

3 討論

靛玉紅的含量測(cè)定方法有氧化滴定法、直接比色法、薄層色譜法、雙波長(zhǎng)分光光度法、高效液相色譜法等[10]。本研究采用高效液相色譜法[11]，該方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定清膏中的靛玉紅含量，方法簡(jiǎn)便、便于操作，重現(xiàn)性、回收率良好，可作為靛玉紅的質(zhì)量控制方法。

采取不同提取方法處理浸膏，(1)二氯甲烷超聲提取，抽濾；(2)二氯甲烷超聲提取，加水萃取[12]，水層用二氯甲烷提取2次，1次10 ml，合并二氯甲烷液；(3)二氯甲烷超聲提取，加8%鹽酸萃取，酸層用二氯甲烷提取2次，1次10 ml，合并二氯甲烷液；(4)甲醇溶解，超聲提取。結(jié)果表明，以上4中方法的提取效果相近。同時(shí)，考察超聲時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)提取效率的影響[13]，超聲時(shí)間為15、30、45 min時(shí)，提取效果無(wú)明顯差別；提取次數(shù)為1、2、3次時(shí)，分別測(cè)定靛玉紅含量，結(jié)果顯示，提取1次就可將其中的靛玉紅提取完全[14]。因此，樣品前處理方式確定為直接加甲醇溶解，超聲30 min，甲醇定容。超聲提取法利用超聲振動(dòng)來(lái)提高提取效率，具有操作簡(jiǎn)單、省時(shí)高效、污染小、適用范圍廣等特點(diǎn)[15]。

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Content Determination of Indirubin in Shuqing Extractives by HPLC

ZHANG Weiwei, TAN Xiaochuan, CHE Hongwei, FANG Xiaqin, ZHANG Yujia, ZHENG Wensheng

(Dept.of Pharmaceutical Preparation in Drug，Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China)

OBJECTIVE：To establish a method to determine indirubin contents in shuqing extractives by HPLC. METHODS: HPLC method was adopted, the chromatographic column was WondaSil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm), the mobile phase was methanol-water(V∶V=75 ∶25)with the flow rate of 0.8 ml/min and UV detection wavelength at 289 nm. RESULTS: The good linear indications had been shown for indirubin within 0.201 2 μg/ml-20.120 0 μg/ml, the sample solution remained in a stable condiction within 12 h, withRSDat 1.48%; theRSDof reproducibility was 1.38%; and the samples recovery rate was 101.9%, theRSDwas 1.77%. CONCLUSIONS: The method is simple, rapid and accurate, which can be used for quality control of indirabin.

HPLC; Indirubin; Shuqing extractives; Quality control; Extractive

R927.2

A

1672-2124(2017)01-0088-03

2016-10-28)

*碩士研究生。研究方向：中藥質(zhì)量控制。E-mail：15210845386@163.com

#通信作者：研究員。研究方向：毫微粒載藥系統(tǒng)關(guān)鍵技術(shù)研究。E-mail：zhengwensheng@imm.ac.cn

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.01.032