BACTEC MGIT 960培養(yǎng)管內(nèi)渾濁生長(zhǎng)抗酸桿菌的分析

楊翰 黨麗云 崔曉利 尤震宇 談小文 劉元

·短篇論著·

BACTEC MGIT 960培養(yǎng)管內(nèi)渾濁生長(zhǎng)抗酸桿菌的分析

楊翰 黨麗云 崔曉利 尤震宇 談小文 劉元

收集2012年11月至2015年12月西安市胸科醫(yī)院分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中， 在BACTEC MGIT 960培養(yǎng)管內(nèi)渾濁生長(zhǎng)且萋-尼抗酸染色陽(yáng)性的標(biāo)本58份(來(lái)自58例患者)。通過(guò)萋-尼染色、對(duì)硝基苯甲酸(PNB)鑒別培養(yǎng)、MPB64蛋白免疫膠體金法檢測(cè)、結(jié)核分枝桿菌(MTB)及非結(jié)核分枝桿菌(NTM)特異性基因片段PCR-熒光探針?lè)z測(cè)、DNA 微陣列芯片法菌種鑒定及耐藥基因檢測(cè)等方法對(duì)這58例標(biāo)本進(jìn)行菌種鑒定，并回顧58例患者的相關(guān)標(biāo)本的MTB及NTM特異性基因片段PCR-熒光探針?lè)ǖ臋z測(cè)結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，58份標(biāo)本渾濁生長(zhǎng)抗酸桿菌呈分散逗點(diǎn)、桿狀生長(zhǎng)；其中56份標(biāo)本有NTM單獨(dú)生長(zhǎng)，1份為MTB單獨(dú)生長(zhǎng)，1份為NTM和MTB混合生長(zhǎng)。58例患者中有5例存在NTM與MTB混合感染，且MTB的利福平和異煙肼耐藥基因均為野生型。由此可初步判定渾濁生長(zhǎng)的培養(yǎng)管需排除管內(nèi)NTM生長(zhǎng)后，才能判斷MTB單獨(dú)感染。

分枝桿菌，結(jié)核； 分枝桿菌感染； 診斷，鑒別

BACTEC MGIT 960是目前應(yīng)用最廣泛的液體培養(yǎng)基全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)儀器。其進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)時(shí)偶爾會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)管內(nèi)抗酸桿菌渾濁生長(zhǎng)的情況。對(duì)上述現(xiàn)象進(jìn)行深入了解并分析其成分，筆者收集2012年11月至2015年12月西安市胸科醫(yī)院分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性并在BACTEC MGIT 960培養(yǎng)管內(nèi)渾濁生長(zhǎng)且萋-尼抗酸染色陽(yáng)性的標(biāo)本，對(duì)生長(zhǎng)物進(jìn)行抗酸染色觀察其形態(tài)，并鑒定分析菌液成分，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料和方法

1.材料：收集2012年11月至2015年12月西安市胸科醫(yī)院分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本7389份，選取其中在培養(yǎng)管內(nèi)渾濁生長(zhǎng)且萋-尼抗酸染色陽(yáng)性標(biāo)本58份，來(lái)自58例患者。

2.儀器和試劑：抗酸染色試劑盒(批號(hào)：412091；珠海貝索生物技術(shù)有限公司)、結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：TB140701、TB150902；杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)、分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：0108141504；北京博奧生物科技有限公司)、結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(批號(hào)：0106151512；北京博奧生物科技有限公司)、結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：01112151606；北京博奧生物科技有限公司)、ABI7300熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物公司)、雜交儀BioMixerTMⅡ(北京博奧生物科技有限公司)、芯片掃描儀LuxScan-10K/B(北京博奧生物科技有限公司)。

3.萋-尼氏抗酸染色：取0.1 ml菌液涂片，并加入1滴小牛血漿，待干燥后應(yīng)用紫外線消毒2 h，固定進(jìn)行萋-尼抗酸染色[1]。

4. 對(duì)硝基苯甲酸(PNB)鑒別培養(yǎng)[2]：取0.2 ml菌液接種在PNB鑒別培養(yǎng)基斜面上，37 ℃恒溫箱內(nèi)放置4周觀察結(jié)果，結(jié)果判讀：有抗酸菌生長(zhǎng)則該抗酸菌為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)；不生長(zhǎng)則該抗酸菌為結(jié)核分枝桿菌(MTB)。

5. MPB64 蛋白免疫膠體金法檢測(cè)[3]：取100 μl液體培養(yǎng)基菌懸液加入到試劑檢測(cè)孔中，15 min后觀察，1 h內(nèi)判定結(jié)果。結(jié)果判讀：檢測(cè)線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紫紅色條帶為陽(yáng)性；質(zhì)控線出現(xiàn)，但檢測(cè)線未出現(xiàn)紫紅色條帶者為陰性；質(zhì)控線未出者表示試劑存在問(wèn)題，須重新檢測(cè)。

6. MTB及NTM特異性基因片段PCR-熒光探針?lè)z測(cè)：取1 ml菌液加入1.5 ml離心管中，以離心半徑9.7 cm，12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 ml生理鹽水渦旋震蕩后，再以離心半徑9.7 cm，12 000 r/min 離心5 min，棄上清。向沉淀中加入50 μl核酸提取液并轉(zhuǎn)入帶磁珠的核酸提取管中，提取儀快速震蕩10 min，然后95 ℃水浴5 min。取2 μl 提取好的核酸溶液加入18 μl PCR擴(kuò)增試劑中進(jìn)行擴(kuò)增：37 ℃、300 s(1個(gè)循環(huán))，94 ℃、180 s(1個(gè)循環(huán))，94 ℃、15 s(40個(gè)循環(huán))，60 ℃、30 s(40個(gè)循環(huán))，50 ℃、10 s(1個(gè)循環(huán))；熒光采集點(diǎn)選擇60 ℃、30 s，同時(shí)檢測(cè)FAM通道和HEX通道。結(jié)果判讀：樣本曲線與閾值線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)循環(huán)閾值(Ct值)<40的樣本為陽(yáng)性，Ct值>40或無(wú)數(shù)值的為陰性，檢測(cè)結(jié)果的解釋見(jiàn)表1。

表1 MTB及NTM特異性基因片段PCR-熒光探針?lè)z測(cè)結(jié)果解釋

7.NTM的菌種鑒定[4-6]：采用DNA微陣列芯片法。雜交反應(yīng)：按每管9 μl分裝，每管加入6 μl相應(yīng)PCR產(chǎn)物形成雜交產(chǎn)物混合液，將混合液加熱95 ℃變性5 min，立即冰浴3 min；將雜交反應(yīng)混合物混勻，經(jīng)蓋片的加樣孔加入13.5 μl雜交反應(yīng)混合物，密封；芯片洗滌液Ⅰ、Ⅱ洗滌芯片，在恒溫?fù)u床上使用80～100 r/min轉(zhuǎn)速，室溫洗滌3 min，然后以離心半徑7 cm，800 r/min 離心5 min，甩干掃描。結(jié)果判斷：探針信號(hào)值與參考值進(jìn)行比較，如果探針信號(hào)值大于或等于該探針的參考值，則判讀為陽(yáng)性，否則判讀為陰性，以探針信號(hào)的組合情況來(lái)確定相應(yīng)的分枝桿菌種或群。

8. 耐藥基因檢測(cè)[7]：回顧分析NTM感染者同時(shí)期相關(guān)標(biāo)本TB-PCR-熒光探針?lè)ńY(jié)果，檢測(cè)是否存在MTB感染，并應(yīng)用DNA微陣列芯片法檢測(cè)耐藥基因。步驟如下：每份標(biāo)本均進(jìn)行分枝桿菌屬探針序列(擴(kuò)增產(chǎn)物1)、rpoB基因位點(diǎn)突變序列(擴(kuò)增產(chǎn)物2)、KatG和inhA基因位點(diǎn)突變序列(擴(kuò)增產(chǎn)物3)擴(kuò)增，擴(kuò)增程序按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物于95 ℃變性10 min，立即置冰水中3 min，每份標(biāo)本分為2管，分別加入9 μl雜交緩沖液，其中一管加入3 μl擴(kuò)增產(chǎn)物1和2，另一管中加入3 μl擴(kuò)增產(chǎn)物1和3，吹吸混勻后從雜交盒的小孔處向芯片點(diǎn)陣加入13.5 μl雜交混合物，置于50 ℃雜交儀中雜交2 h。按說(shuō)明書(shū)配置洗液1和洗液2，按已設(shè)置的洗滌程序洗片，讀片結(jié)束后置于甩干儀中甩干，然后把芯片放入掃描儀中自動(dòng)讀取數(shù)據(jù)。結(jié)果判讀：待測(cè)樣品某一基因所有檢測(cè)位點(diǎn)均為野生型則報(bào)告該基因?yàn)橐吧?；若待測(cè)樣本某一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)為突變型，則報(bào)告全部為突變型。

結(jié) 果

1.形態(tài)分析：對(duì)培養(yǎng)管內(nèi)菌液進(jìn)行萋-尼抗酸染色，觀察到細(xì)菌呈分散型生長(zhǎng)(逗點(diǎn)樣或長(zhǎng)桿樣)，不同于MTB的典型索狀生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。

A：逗點(diǎn)樣；B：長(zhǎng)桿樣圖1 培養(yǎng)管內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)形態(tài)(抗酸染色 ×100)

2.菌液成分分析：PNB鑒別培養(yǎng)、免疫膠體金法檢測(cè)、PCR-熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行菌液成分的分析發(fā)現(xiàn)1號(hào)標(biāo)本為MTB；2號(hào)標(biāo)本菌液中存在分泌 MPB 64蛋白的抗酸桿菌，且MTB特異性基因序列有拷貝，證明存在MTB；而PNB鑒別培養(yǎng)基上分離出的菌落不分泌MPB 64蛋白，PCR-熒光探針?lè)z測(cè)MTB陰性，NTM陽(yáng)性，經(jīng)鑒別為NTM，因此，考慮2號(hào)標(biāo)本存在MTB與NTM混合生長(zhǎng)。3～58號(hào)標(biāo)本均為NTM。

3.耐藥情況分析：對(duì)2～58號(hào)標(biāo)本分離出的NTM進(jìn)行菌種鑒定，結(jié)果顯示，鳥(niǎo)分枝桿菌7份、胞內(nèi)分枝桿菌32份、堪薩分枝桿菌4份、偶然分枝桿菌1份、龜-膿腫分枝桿菌10份、恥垢分枝桿菌2份、土分枝桿菌1份。

回顧分析3～58號(hào)標(biāo)本對(duì)應(yīng)的56例NTM感染患者同時(shí)期相關(guān)標(biāo)本TB-PCR-熒光探針?lè)ńY(jié)果，發(fā)現(xiàn)僅有3～6號(hào)這4例患者TB-PCR結(jié)果陽(yáng)性，存在混合感染。對(duì)這4例TB-PCR產(chǎn)物進(jìn)行耐藥基因分析，結(jié)果均為利福平和異煙肼敏感(野生型)，同時(shí)檢測(cè)2號(hào)標(biāo)本對(duì)應(yīng)患者耐藥基因，也為利福平和異煙肼敏感(野生型)。

討 論

BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)主要用于MTB培養(yǎng)。典型的MTB呈索狀生長(zhǎng)(即非渾濁的，成顆?；驁F(tuán)塊生長(zhǎng))[8]，污染菌呈均勻渾濁生長(zhǎng)，這些污染菌抗酸染色為陰性。筆者對(duì)培養(yǎng)管內(nèi)均勻渾濁生長(zhǎng)的不典型抗酸桿菌進(jìn)行了分析，了解菌液的成分，并對(duì)分析菌液成分時(shí)發(fā)現(xiàn)的混合感染進(jìn)行了深入的探討。

本研究顯示，58份渾濁生長(zhǎng)的不典型抗酸桿菌培養(yǎng)管內(nèi)，細(xì)菌生長(zhǎng)的形態(tài)區(qū)別于MTB復(fù)合群的索狀生長(zhǎng)形態(tài)，呈分散的逗點(diǎn)和長(zhǎng)桿樣生長(zhǎng)[9-10]。通過(guò)對(duì)細(xì)菌16s特異性序列的鑒別，發(fā)現(xiàn)NTM生長(zhǎng)的有57份標(biāo)本。究其原因，可能是NTM含索狀因子較少或不含所致。因此，BACTEC MGIT 960培養(yǎng)管渾濁生長(zhǎng)可以作為NTM的初步篩查依據(jù)，當(dāng)BACTEC MGIT 960培養(yǎng)管內(nèi)菌液呈渾濁生長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)該考慮NTM的存在。

研究中，1號(hào)標(biāo)本經(jīng)鑒定為MTB，將菌液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，抗酸桿菌恢復(fù)了索狀生長(zhǎng)，并分泌 MPB 64 蛋白。其渾濁生長(zhǎng)的具體原因可能為細(xì)胞壁成分的缺失，L型變異，導(dǎo)致索狀因子的減少。2號(hào)標(biāo)本經(jīng)分析，慢生長(zhǎng)分枝桿菌與MTB的生長(zhǎng)速度基本相同，兩種細(xì)菌得到合適的生長(zhǎng)條件從而共同生長(zhǎng)。1、2號(hào)標(biāo)本提示，BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)中，抗酸染色初步鑒定為抗酸桿菌后，需要進(jìn)一步鑒定出抗酸桿菌是MTB或NTM。

從2號(hào)標(biāo)本可以看出，MTB與NTM混合感染不能忽略。因?yàn)橹委煼桨傅牟煌?，?shí)驗(yàn)室對(duì)混合感染的檢測(cè)可以幫助臨床醫(yī)生及時(shí)做出正確診斷[11-12]。本次篩選的57例NTM感染的患者中，回顧分析其同期相關(guān)標(biāo)本的MTB特異性核酸PCR的結(jié)果，有5例菌種鑒定為MTB。分析原因，可能為龜-膿腫分枝桿菌等快生長(zhǎng)分枝桿菌生長(zhǎng)迅速，消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致MTB營(yíng)養(yǎng)不良，無(wú)法繁殖。這5例患者M(jìn)TB耐藥基因均為野生型，對(duì)異煙肼和利福平敏感。

綜上所述，利用渾濁生長(zhǎng)這種細(xì)菌形態(tài)學(xué)上特點(diǎn)，可有助于NTM感染的早期篩查。培養(yǎng)結(jié)果結(jié)合早期基因檢測(cè)，可以避免混合感染患者的漏診。MTB與NTM混合感染時(shí)，必須各有一種方法證明兩種細(xì)菌的存在，如傳統(tǒng)的MPB 64蛋白與PNB羅氏培養(yǎng)基檢測(cè)，或基因?qū)用鏈y(cè)定細(xì)菌的特異性序列[13]；應(yīng)建立一個(gè)可靠的病原學(xué)診斷流程，對(duì)混合感染做出明確的診斷，給臨床提供可靠的信息。

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(本文編輯：李敬文)

Analysis of acid fast bacilli with turbidity growth in the BACTEC MGIT 960 culture tubes

YANGHan,DANGLi-yun,CUIXiao-li,YOUZhen-yu,TANXiao-wen,LIUYuan.

Xi’anChestHospital,Xi’an710061,ChinaCorrespondingauthor:DANGLi-yun,Email:dangliyun@sina.com

Specimens with mycobacterium positive from Xi’an Chest Hospital between November 2012 and December 2015 were collected, and of them, 58 specimens from 58 patients were with turbidity growth in culture tubes and were found positive using acid-fast staining. The 58 specimens were dealt with acid-fast staining, PNB differential culture, immune colloidal of MPB64 protein, non-tuberculosis mycobacteria (NTM) specific real-time fluorescence quantitative PCR, DNA microarray and drug resistance gene to identify the component of the bacteria. Results ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) and NTM specific real-time fluorescence quantitative PCR were reviewed and it was found that all the 58 specimens with turbidity growth growing in types of comma and pod; 56 of them separately grew with NTM, one with MTB separately and one with MTB and NTM mixed. Five cases were infected by both MTB and NTM, and resistance genes of RFP and INH were both wild type. Hence, separate infection of MTB could be confirmed only after ruling out the growth of NTM.

Mycobacteriumtuberculosis; Mycobacterium infections; Diagnosis, differential

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.01.023

710061 西安市胸科醫(yī)院

黨麗云，Email:dangliyun@sina.com

2016-06-02)