親水作用色譜在糖類(lèi)化合物分析中的應(yīng)用

蒲江華，趙 峽，韓文偉，白明月

(中國(guó)海洋大學(xué) 海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省糖科學(xué)與糖工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，醫(yī)藥學(xué)院，山東 青島 266003)

親水作用色譜在糖類(lèi)化合物分析中的應(yīng)用

蒲江華，趙 峽*，韓文偉，白明月

(中國(guó)海洋大學(xué) 海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省糖科學(xué)與糖工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，醫(yī)藥學(xué)院，山東 青島 266003)

糖類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)和組成分析對(duì)于探究糖的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系具有重要作用。親水作用色譜(HILIC)對(duì)糖類(lèi)等極性化合物具有良好的分離效果。該文介紹了適合糖類(lèi)分析的常用HILIC柱固定相及其分離機(jī)制，論述了強(qiáng)洗脫溶劑比例、流動(dòng)相pH值、緩沖鹽濃度和色譜柱溫度對(duì)HILIC分離效果的影響，并舉例說(shuō)明了HILIC法在單糖組成、糖胺聚糖二糖組成、寡糖聚合度、糖苷、糖脂、糖醇以及N-/O-糖鏈分析中的應(yīng)用。

親水作用色譜；固定相；保留機(jī)制；糖類(lèi)分析；綜述

糖及其復(fù)合物的分析檢測(cè)在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域均具有重要作用。由于糖類(lèi)化合物的極性較大，在反相色譜(RPLC)上保留太弱甚至不保留，常需經(jīng)過(guò)衍生化帶上疏水基團(tuán)后才能進(jìn)行分析；而在正相色譜(NPLC)上又保留過(guò)強(qiáng)，難以被非極性的流動(dòng)相洗脫下來(lái)。親水作用色譜(Hydrophilic interaction chromatography，HILIC)因以強(qiáng)極性材料作為固定相，以高比例的有機(jī)溶劑-水體系作流動(dòng)相[1]，近年來(lái)廣泛用于糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、生物堿、皂苷等成分的分離和分析[2-4]。本文論述了適合糖類(lèi)分析的常用HILIC柱固定相及其分離機(jī)制，探討了強(qiáng)洗脫溶劑比例、流動(dòng)相pH值、緩沖鹽濃度、柱溫等色譜條件對(duì)糖類(lèi)化合物分離效果的影響，并列舉了HILIC在不同糖類(lèi)化合物分析中的應(yīng)用。

1 常用固定相

HILIC色譜柱的固定相種類(lèi)繁多，包括未衍生化的純硅膠柱及一些極性官能團(tuán)(如氨基、酰胺基、二醇基、氰基、糖基等)修飾的硅膠或者聚合物[5]，以適應(yīng)不同的分離目的。以聚合物為基質(zhì)的固定相能適用于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境，但其分離效率遠(yuǎn)不如以硅膠為基質(zhì)的固定相，因此應(yīng)用較少[6]。在糖類(lèi)化合物分析中常用的以硅膠為基質(zhì)的固定相主要有氨基柱、酰胺基柱、兩性離子柱、糖基柱等(圖1)。氨基柱(如TSKgel NH2-100)是最早用于糖類(lèi)化合物分析的HILIC柱，對(duì)糖的分離具有很好的選擇性，但其受緩沖鹽濃度和pH值影響較大，易與酸性化合物發(fā)生死吸附，且氨基易與還原糖的醛基形成席夫堿從而影響鍵合相的性質(zhì)，因此在糖的分析中受到了限制[5,7-9]。酰胺基柱(如XAmide)穩(wěn)定性好，不易發(fā)生死吸附，且選擇性佳，在糖類(lèi)化合物的分析中應(yīng)用最為廣泛[10]。兩性離子柱(如ZIC-HILIC)的固定相表面同時(shí)含有正負(fù)電荷官能團(tuán)，因此親水性好，受pH值和離子作用的影響較小，對(duì)中性、堿性、酸性寡糖均具有很好的分離選擇性[7,11]。糖基柱是在硅膠表面鍵合上糖基，如麥芽糖(Click maltose)、環(huán)糊精(Clickβ-CD)等，因此具有很強(qiáng)的極性和氫鍵作用，可廣泛應(yīng)用于單糖、寡糖、多糖和糖肽等分析[7,12]。

圖1 在糖類(lèi)化合物HILIC分析中常用的固定相結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of stationary phase of HILIC column commonly used in carbohydrate analysis

2 保留機(jī)制

圖2 親水分配作用、氫鍵作用及靜電作用機(jī)制示意圖Fig.2 Mechanisms of hydrophilic partitioning,hydrogen bonding and electrostatic interaction

HILIC柱的保留機(jī)制較為復(fù)雜，主要有分配機(jī)制和吸附機(jī)制(包括氫鍵作用、偶極-偶極作用等)，還涉及靜電作用和離子交換作用等[6,9,13-14]。分配機(jī)制是指分析物在親水固定相吸附的水層與流動(dòng)相之間發(fā)生液/液分配作用，是廣為接受的HILIC保留機(jī)制[8]；氫鍵作用和靜電作用常常發(fā)生在分析物與固定相材料之間，受流動(dòng)相組成的影響較大，其作用模式如圖2所示。糖是多羥基化合物，其在HILIC柱上的保留除分配作用外，還有較強(qiáng)的氫鍵作用，而且?guī)щ姾傻乃嵝蕴呛蛪A性糖還會(huì)與固定相發(fā)生靜電作用[9,15]。HILIC的保留機(jī)制主要取決于固定相特性、流動(dòng)相組成以及分析物性質(zhì)，隨著分析條件改變，其保留機(jī)制也會(huì)相應(yīng)改變[16-17]。

3 分離條件的影響

HILIC的分離效果受多種色譜條件的影響，其中強(qiáng)洗脫溶劑比例、流動(dòng)相pH值、緩沖鹽濃度及色譜柱溫度對(duì)糖類(lèi)化合物在HILIC柱上的保留均具有重要影響[11]。

3.1 強(qiáng)洗脫溶劑的影響

圖3 水的比例對(duì)Click XIon柱分析低聚木糖聚合度的影響Fig.3 Influence of water proportion on degree of polymerization analysis of xylo-oligosaccharides by Click XIon column

HILIC的流動(dòng)相一般是由水相-有機(jī)相組成的混合溶劑體系，水或者水的鹽溶液為強(qiáng)洗脫溶劑，有機(jī)相為弱洗脫溶劑。理想的有機(jī)相應(yīng)易與水混溶，且不能是質(zhì)子供體或受體，所以一般多采用乙腈[18-19]。在HILIC模式中，化合物按照極性由小到大的順序出峰，在乙腈和水組成的流動(dòng)相中，強(qiáng)洗脫溶劑的增加會(huì)加快糖的出峰時(shí)間[9,20]。如本實(shí)驗(yàn)室考察了流動(dòng)相對(duì)Click XIon柱分離低聚木糖聚合度的影響(圖3)，發(fā)現(xiàn)隨著水相比例的增加，低聚木糖的洗脫速度加快，分析效率提高，但同時(shí)分離度也有所降低。

3.2 流動(dòng)相pH值的影響

流動(dòng)相的pH值能影響極性分析物和固定相的電荷狀態(tài)，從而影響分析物在HILIC柱上的保留強(qiáng)弱。若二者所帶電荷相同則相斥，分析物在固定相上的保留會(huì)減弱；如帶相反電荷則相吸，分析物的保留增強(qiáng)。pH值的影響與分析物性質(zhì)和固定相種類(lèi)相關(guān)，pH值對(duì)同一色譜柱不同性質(zhì)的分析物以及同一分析物不同固定相的色譜柱均會(huì)有不同的影響[10,21-22]。Yan等[23]采用BEH Amide柱分離中性單糖時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著pH值的增加，糖的洗脫加快，保留時(shí)間縮短。這是因?yàn)閜H值越高，糖脫質(zhì)子化程度越高，與硅醇基發(fā)生靜電相斥作用，所以中性單糖在色譜柱上的保留減弱。

Fu等[24]總結(jié)了流動(dòng)相pH值對(duì)不同類(lèi)型HILIC柱的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH值從6.8變化到3.0時(shí)，Clickβ-CD，Click Maltose，XAmide和Click TE-Cys這4種色譜柱的固定相表面會(huì)從負(fù)電荷轉(zhuǎn)變?yōu)檎姾?。所以，酸性糖?yīng)在pH≥6.8的條件下分離以減小離子作用；堿性糖應(yīng)在pH≤3.0的條件下分離來(lái)減小靜電吸引作用，避免峰拖尾。硅膠柱和二醇基柱在pH 6.8時(shí)表面帶負(fù)電，而在pH 3.0時(shí)接近電中性，因此在pH 3.0的條件下既適宜分離堿性糖，又可用于分離酸性糖。TSK Amide-80柱在pH 3.0～6.8范圍內(nèi)帶負(fù)電，在pH<7.0時(shí)適合分離酸性糖，在pH>7.0時(shí)適合分離堿性糖。

3.3 緩沖鹽濃度的影響

3.4 色譜柱溫度的影響

溫度能影響流動(dòng)相粘度、溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)以及溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的遷移焓變，對(duì)HILIC的分離效果有重要影響[10,17]。一般而言，柱溫的升高能增大溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)，縮減保留時(shí)間，增加檢測(cè)靈敏度[17]。如采用TSK Amide-80柱分離單糖時(shí)，隨著柱溫從40 ℃增加至60 ℃，各單糖的洗脫加快，糖的峰形變得更加尖銳[25]。但當(dāng)以靜電吸引為主導(dǎo)的保留機(jī)制時(shí)，溫度的升高反而會(huì)導(dǎo)致保留的增強(qiáng)[12,18]。柱溫除對(duì)HILIC柱的保留時(shí)間和靈敏度有影響以外，還能影響糖的峰形。如圖4所示[24]，當(dāng)柱溫為30 ℃時(shí)，Click Maltose，XAmide，Silica，TSK Amide-80等HILIC柱會(huì)產(chǎn)生葡萄糖峰的α和β異構(gòu)體裂分，且隨著柱溫上升，裂分程度逐漸降低甚至消失，具有這一特性的HILIC柱可以用于糖的異構(gòu)體分析。Moni等[26]自制的糖基HILIC柱可在合適的低溫條件下分離吡喃糖和呋喃糖的異構(gòu)體。對(duì)于氨基柱、二醇基柱等，因它們自身的固定相材料能加快端基差向異構(gòu)體的轉(zhuǎn)換，可避免雙峰的出現(xiàn)[7]。

4 實(shí)例分析

4.1 單糖組成及寡糖分析

單糖組成分析有利于多糖的結(jié)構(gòu)解析，常采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色譜法[27]，該方法能同時(shí)分析11種常見(jiàn)的中性、酸性和堿性單糖，但衍生過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而采用HILIC法分析單糖組成可不需衍生，前處理簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，如BEH amide柱可在30 min內(nèi)完全分離8種植物來(lái)源的中性單糖[23]。HILIC法還能同時(shí)快速分析多種中性單糖、二糖和三糖，如Ikegami等[28]采用200T-PAAm硅膠柱，可在5 min內(nèi)完成核糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、棉籽糖及景天庚酮糖的同時(shí)分離。但HILIC法方法的不足是尚不能同時(shí)完全分離多種中性、酸性和堿性單糖。

4.2 糖胺聚糖二糖組成分析

糖胺聚糖是一類(lèi)酸性多糖，由糖醛酸和氨基糖組成的二糖片段重復(fù)連接而成。二糖組成中糖醛酸和氨基糖種類(lèi)的不同以及硫酸化位點(diǎn)和個(gè)數(shù)的不同，使得糖胺聚糖結(jié)構(gòu)多樣化，從而具有不同的生理功效[29]。二糖組成一般采用強(qiáng)陰離子交換色譜法進(jìn)行分析[30]，但該方法因使用高濃度的緩沖鹽，難以與質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行在線檢測(cè)。HILIC采用乙腈-水(或低濃度的揮發(fā)性緩沖鹽)體系，可實(shí)現(xiàn)與質(zhì)譜的在線聯(lián)用，提高檢測(cè)的靈敏度[12,31]。如采用ZIC-HILIC柱可同時(shí)分離2-氨基苯甲酰胺(2-AB)標(biāo)記的不同位點(diǎn)取代及不同取代度的硫酸軟骨素和硫酸乙酰肝素[32]。

4.3 寡糖聚合度分析

寡糖的生物功能與其聚合度(dp)也有密切關(guān)系[33]，因此其聚合度分析方法的建立有助于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。寡糖聚合度分析常采用高效凝膠過(guò)濾色譜法，但對(duì)dp相近的同一系列寡糖分子量差異小，難以通過(guò)該方法達(dá)到基線分離，而HILIC法對(duì)不同dp的寡糖具有良好的分離效果。Fu等[34]采用麥芽糖基柱成功分離了dp10～50的果寡糖及dp5～25的殼寡糖。吳成玲等[35]研究發(fā)現(xiàn)酰胺基柱可以有效分離dp2～20的透明質(zhì)酸寡糖；在較高溫度下，兩性離子柱可有效分離dp2～12的硫酸軟骨素寡糖；而二醇基柱還可分離dp4～20的肝素寡糖。

圖5 USP-HILIC柱分離多元醇類(lèi)化合物[38]Fig.5 Analysis of a polyols mixture by USP-HILIC column[38]elution order:1,3,5-cis,cis-cyclohexanetriol,xylitol,mannitol,chiro-inositol and myo-inositol(洗脫順序：1,3,5-環(huán)己烷三醇、木糖醇、甘露糖醇、D-手性肌醇、肌醇)

4.4 糖苷、糖脂及糖醇分析

HILIC在糖苷、糖脂和糖醇的分析檢測(cè)方面也有重要應(yīng)用。如金高娃等[36]采用Click XIon柱對(duì)皂苷、黃酮苷等14種糖苷類(lèi)化合物實(shí)現(xiàn)了有效分離；Melo等[37]采用HILIC-ESI-MS法分離紅藻Chondruscrispus中的糖脂并表征了其結(jié)構(gòu)；Kotoni等[38]采用HILIC方法實(shí)現(xiàn)了1,3,5-環(huán)己烷三醇、木糖醇、甘露糖醇、肌醇及D-手性肌醇等多元醇的有效分離(圖5)。

4.5 N-/O-糖鏈分析

糖鏈?zhǔn)羌?xì)胞表面的重要生物信息分子，許多疾病與糖鏈結(jié)構(gòu)的改變密切相關(guān)[39]。而糖鏈的結(jié)構(gòu)解析一直是糖生物學(xué)的重難點(diǎn)，糖鏈的分離是糖鏈結(jié)構(gòu)研究中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，對(duì)其結(jié)構(gòu)解析的準(zhǔn)確性有重要影響。HILIC可與質(zhì)譜在線聯(lián)用，用于N-/O-糖鏈的結(jié)構(gòu)分析[40-41]。如可采用BEH amide柱分析倉(cāng)鼠卵巢來(lái)源的融合蛋白及免疫球蛋白G4釋放的N-糖鏈(圖6)[42]；采用兩性離子柱可分離唾液酸化的N-糖鏈的異構(gòu)體[43]；采用TSKgel Amide-80可分析內(nèi)源性鼠胃粘蛋白釋放的O-糖鏈[44]等。

圖6 BEH amide柱分析2-AB標(biāo)記的融合蛋白(A)和免疫球蛋白G4(B)釋放的N-糖鏈[42]Fig.6 2-AB-labeled N-glycans released from a CHO-derived fusion protein(A) and an NS0-derived IgG4(B) by BEH amide column[42]

5 結(jié)論與展望

HILIC對(duì)極性化合物和離子型化合物具有特殊的分離效果，彌補(bǔ)了RPLC和傳統(tǒng)的NPLC在分析上的不足，為糖類(lèi)化合物的分析開(kāi)拓了新的局面。研究HILIC的保留機(jī)制及色譜條件(如流動(dòng)相組成、pH值、緩沖鹽濃度及柱溫)對(duì)保留的影響，有助于實(shí)現(xiàn)糖類(lèi)化合物更快和更好的分離效果。隨著HILIC柱固定相材料的不斷發(fā)展，可適應(yīng)不同化合物的分離需求，在此，也期待能同時(shí)分離酸性、堿性和中性糖的色譜柱早日問(wèn)世。此外，HILIC與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用也成為寡糖結(jié)構(gòu)分析的重要手段，將可以進(jìn)一步解決糖類(lèi)分析中的更多難題。

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Application of Hydrophilic Interaction Chromatography in Analysis of Carbohydrates

PU Jiang-hua,ZHAO Xia*,HAN Wen-wei,BAI Ming-yue

(Key Laboratory of Glycoscience and Glycotechnology of Shandong Province,Key Laboratory of Marine Drugs of Education Ministry,School of Medicine and Pharmacy,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

The analysis of carbohydrate structure and composition plays a vital role in the study of structure-activity relationship of carbohydrates.Hydrophilic interaction chromatography(HILIC) could be used to separate polar compounds like carbohydrates with satisfactory resolution.The stationary phase and retention mechanism of HILIC column commonly used in carbohydrates analysis were introduced.The effects of strong elution solvent ratio,mobile phase pH value,buffer salt concentration and column temperature on separation were also discussed.Application examples in analysis of monosaccharide composition,disaccharide composition of glycosaminoglycans,polymerization degree of oligosaccharides,glycosides,glycolipids,sugar alcohols and N-/O-glycans by HILIC were illustrated in this paper.

hydrophilic interaction chromatography;stationary phase;retention mechanism;carbohydrate analysis；review

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.025

2016-07-17；

2016-09-20

國(guó)家自然科學(xué)基金-山東省政府聯(lián)合資助項(xiàng)目(U1406402)；國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃(2013BAB01B02)

*通訊作者：趙 峽，博士，教授，研究方向：海洋糖類(lèi)藥物，Tel：0532-82031560，E-mail：zhaoxia@ouc.edu.cn

O657.7；O629.1

A

1004-4957(2017)01-0145-06