基于分散固相萃取液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大米中8種真菌毒素

孫偉華，楊 歡，曹趙云，馬有寧，秦美玲，柴爽爽，陳銘學(xué)

(中國(guó)水稻研究所 農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，浙江 杭州 310006)

基于分散固相萃取液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大米中8種真菌毒素

孫偉華，楊 歡，曹趙云，馬有寧，秦美玲，柴爽爽，陳銘學(xué)*

(中國(guó)水稻研究所 農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，浙江 杭州 310006)

建立了大米中HT-2毒素、T-2毒素、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和黃曲霉毒素B1共8種真菌毒素的快速測(cè)定方法。比較了3種基于分散固相萃取原理的樣品前處理方法(即QuEChERS方法、EMR-lipid方法以及DisQuE方法)對(duì)8種真菌毒素的回收率；以提取后加標(biāo)法考察大米基質(zhì)中各目標(biāo)物L(fēng)C-MS/MS分析的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，QuEChERS樣品前處理方法不適于伏馬毒素B1、伏馬毒素B2和赭曲霉毒素 A分析；而EMR-lipid樣品前處理方法無法消除玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素 A在大米中的基質(zhì)效應(yīng)。據(jù)此采用DisQuE方法并優(yōu)化LC-MS/MS分析參數(shù)，一次進(jìn)樣監(jiān)測(cè)16對(duì)離子對(duì)(每個(gè)化合物2對(duì)離子對(duì))分析大米中的8種真菌毒素殘留量。8種真菌毒素在3個(gè)添加水平下的回收率為70.0%～124.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～16.9%，檢出限(S/N≥3)為1.2～60.0 μg/kg。該方法準(zhǔn)確、靈敏，適用于大米中多種真菌毒素的快速分析。

QuEChERS方法;EMR-lipid方法;DisQuE方法;LC-MS/MS;真菌毒素;大米

真菌毒素(Mycotoxin) 是由霉菌等真菌產(chǎn)生的有毒的次生代謝產(chǎn)物，也稱霉菌毒素，可廣泛污染農(nóng)作物、食品及飼料等植物源性產(chǎn)品[1-2]，其中對(duì)農(nóng)產(chǎn)品和食品的污染最為嚴(yán)重。目前在自然界中已發(fā)現(xiàn)有400多種真菌毒素，其中最為關(guān)注的有黃曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)、展青霉素(Patulin)、赭曲霉毒素(Ochratoxin,OTA)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)、伏馬毒素(Fumonisin,FB)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)、T-2毒素等[3]。研究表明，這些真菌毒素不僅會(huì)對(duì)食品有影響，如導(dǎo)致食品霉敗變質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失及品質(zhì)降低，還對(duì)人和動(dòng)物造成極大危害，抑制其體內(nèi)DNA，RNA，蛋白質(zhì)和各種酶類的合成、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并引起真菌毒素中毒[4-5]。部分真菌毒素具有致癌、致畸、致細(xì)胞突變的“三致”作用[4,6-8]。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，每年全球農(nóng)產(chǎn)品污染率高達(dá)25%，損失達(dá)10億噸；據(jù)我國(guó)國(guó)家糧食局統(tǒng)計(jì)，每年有3 100萬噸糧食在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)倪^程中受到真菌毒素污染，約占糧食年總產(chǎn)量的6.2%[9-10]。糧食及其制品作為人類不可或缺的主要食物和動(dòng)物飼料的主要來源，真菌毒素的污染越來越受到關(guān)注。許多國(guó)家在近幾十年來陸續(xù)制定并頒布了諸多相關(guān)的法律法規(guī)和毒素限量標(biāo)準(zhǔn)，以確保人類的食物安全[4-5]。

由于對(duì)真菌毒素的強(qiáng)制限量規(guī)定和各項(xiàng)監(jiān)控措施的實(shí)施，強(qiáng)力促進(jìn)了真菌毒素檢測(cè)方法的發(fā)展。與其他眾多的真菌毒素檢測(cè)方法相比，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)可以通過保留時(shí)間和破碎離子共同完成定性定量分析，具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠等特點(diǎn)，其中最顯著的技術(shù)優(yōu)勢(shì)是多組分、多類別真菌毒素的同時(shí)分析檢測(cè)，是一種靈敏度和選擇性極高的真菌毒素檢測(cè)方法[11-12]。但由于糧食種類多、成分復(fù)雜、理化性質(zhì)各不相同、在特定條件下可能會(huì)發(fā)生相互作用，產(chǎn)生基質(zhì)干擾。因此，樣品前處理通常采用免疫親和柱[13]、多功能凈化柱[14-16]、固相萃取柱[17-18]、凝膠色譜法等凈化方法[19]，但這些方法成本高、操作繁瑣、工序復(fù)雜，不利于大量樣品中多種毒素的同時(shí)分析檢測(cè)。QuEChERS方法最先于2003年應(yīng)用于水果和蔬菜中的農(nóng)藥多殘留檢測(cè)[20]，是近年發(fā)展起來的用于真菌毒素檢測(cè)的分散固相萃取方法，其利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用達(dá)到凈化除雜的目的[21-22]。相較于其他凈化方法，QuEChERS方法具有操作簡(jiǎn)單、快速便捷、經(jīng)濟(jì)耐用等優(yōu)點(diǎn)。

本文參考以分散固相萃取用于稻谷中多種真菌毒素分析的研究，采用QuEChERS方法[23]、Agilent QuEChERS dSPE EMR-lipid方法[24]以及Waters DisQuE方法[21]，考察了不同分散固相萃取方法對(duì)8種真菌毒素的回收率；以提取后添加法[25-26]考察了大米基質(zhì)中各目標(biāo)化合物L(fēng)C-MS/MS分析的基質(zhì)效應(yīng)。優(yōu)化LC-MS/MS分析參數(shù)以提高靈敏度，選擇動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Dynamic MRM)采集模式，一次進(jìn)樣即可完成8種真菌毒素的定性定量分析。該方法簡(jiǎn)便快速，可操作性強(qiáng)，免去了繁瑣的固相萃取柱凈化步驟，并降低了免疫親和柱檢測(cè)成本，為企業(yè)及食品安全監(jiān)管部門提供了有效的技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Survryor系列液相色譜儀(美國(guó)ThermoFisher公司)，TSQ Quantum Access Max三重四極桿質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(ESI,美國(guó)ThermoFisher公司)，高速勻漿機(jī)(德國(guó)IKA公司)。

1.2 試劑與材料

乙腈(色譜純,德國(guó)Merck公司);甲酸(色譜純,美國(guó)Tedia公司);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q高純水；黃曲霉毒素B1(AFB1,2.01 μg/mL)、赭曲霉毒素 A(OTA,10.34 μg/mL)、HT-2毒素(HT-2,100.7 μg/mL)、T-2毒素(T-2,100.6 μg/mL)、玉米赤霉烯酮(ZEN,100.1 μg/mL)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON,100.3 μg/mL)、伏馬毒素B1(FB1,50.9 μg/mL)、伏馬毒素B2(FB2,50.1 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)品均購于Romer公司。EMR材料(美國(guó)Agilent公司)，DisQuE材料(美國(guó)Waters公司)。

1.3 工作溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別取適量的各單標(biāo)儲(chǔ)備液，配成含0.5 mg/L AFB1，OTA；2.5 mg/L T-2，HT-2，ZEN；25 mg/L FB1，F(xiàn)B2；以及10 mg/L DON的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，轉(zhuǎn)移并密封于棕色玻璃瓶中，于-20 ℃下避光保存。使用時(shí)以乙腈逐級(jí)稀釋成所需濃度的工作溶液。

1.4 樣品前處理方法

1.4.1 QuEChERS方法稱取5.0 g樣品于250 mL聚乙烯離心管中，加入20 mL水浸泡30 min，再加入25 mL乙腈，勻漿提取后，分別加入10 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉，勻漿并離心(5 000 r/min,5 min)。取上層乙腈相4 mL于預(yù)先加有1.2 g MgSO4，0.1 g PSA和0.1 g C18的離心管中，渦旋振蕩，離心(5 000 r/min,1 min)后，取上清液過0.22 μm有機(jī)相濾膜，濾液待測(cè)[23]。

1.4.2 EMR-lipid方法稱取5.0 g樣品于50 mL聚乙烯離心管中，分別加入含0.1%甲酸的乙腈-水(80∶20)提取液10 mL、含0.1%甲酸的乙腈-水(20∶80)提取液10 mL，超聲提取30 min，離心(5 000 r/min,5 min)，合并上清液，再加入1 g檸檬酸鈉、1 g氯化鈉、4 g硫酸鎂和0.5 g檸檬酸氫鈉，渦旋振蕩并離心(5 000 r/min,5 min)。于EMR-lipid萃取管(dSPE 1010)中加入5 mL水，渦旋振蕩后，再加入5 mL上清液，渦旋振蕩并離心(5 000 r/min,5 min)，將全部上清液轉(zhuǎn)移至EMR-lipid凈化管(Polish 0101)，渦旋振蕩并離心(5 000 r/min,5 min)后，取上清液過0.22 μm有機(jī)相濾膜，濾液待測(cè)[24]。

1.4.3 DisQuE方法稱取5.0 g樣品于50 mL聚乙烯離心管中，分別加入10 mL超純水、10 mL甲酸-乙腈(10∶90)提取液，超聲提取30 min，加入1 g檸檬酸鈉、1 g氯化鈉、4 g硫酸鎂和0.5 g檸檬酸氫鈉，渦旋振蕩并離心(5 000 r/min,5 min)。取5 mL上清液于DisQuE萃取管中(含750 mg硫酸鎂、250 mg PSA、150 mg C18和150 mg Al-N)，渦旋振蕩并離心(5 000 r/min,5 min)，取上清液0.1 mL，用0.1%甲酸水溶液定容至1 mL，混勻后過0.22 μm有機(jī)相濾膜，濾液待測(cè)[21]。

1.5 色譜-質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件色譜柱：XSELECTTMHSS T-3柱(150 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：2.0 μL；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液；B為甲醇；流速：200 μL/min；梯度洗脫條件：0～15.0 min，40%～100% B；15.0～20.0 min，100% B；20.0～20.1 min，100%～40% B；20.1～28.0min，40% B。

1.5.2 質(zhì)譜條件電噴霧(ESI)正、負(fù)離子切換模式采集，其中DON，AFB1，OTA，HT-2，T-2，F(xiàn)B1和FB2采用正離子模式，ZEN采用負(fù)離子模式。正、負(fù)噴霧電壓分別為3 kV和-2.2 kV；離子源溫度為350 ℃；鞘氣壓力為241 kPa；輔助氣流量為1.5 mL/min；碰撞氣(Ar)壓力為0.2 Pa；離子傳輸管溫度為350 ℃；檢測(cè)方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 分析物的質(zhì)譜采集離子信息

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS分析參數(shù)的優(yōu)化

采用蠕動(dòng)泵注射方式，分別對(duì)8種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，通過母離子掃描發(fā)現(xiàn)，除玉米赤霉烯酮(ZEN)外，所有目標(biāo)物在正離子模式下均比負(fù)離子模式具有更高的響應(yīng)，且均為[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰。而ZEN在負(fù)離子模式下獲得最佳靈敏度，形成[M-H]-峰。通過二級(jí)質(zhì)譜優(yōu)化，得到8種真菌毒素的最佳MRM采集參數(shù)(如表1)。

分別以乙腈-水、乙腈-0.1% 甲酸水、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，分別考察了8種化合物的分離度、峰形及響應(yīng)值。試驗(yàn)結(jié)果表明采用甲醇-水溶液作為流動(dòng)相時(shí)絕大多數(shù)目標(biāo)化合物具有較高的靈敏度，而向水相中添加0.1%甲酸后，各物質(zhì)的響應(yīng)值均有一定程度的提升，且OTA和HT-2毒素可獲得最佳的靈敏度，離子化效率明顯提高。因此選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為最優(yōu)的流動(dòng)相。

圖1 3 種QuEChERS樣品前處理方法應(yīng)用于毒素添加水平為10～500 μg/kg大米樣品的回收率比較Fig.1 Comparison of recoveries of three versions of QuEChERS sample preparation method for rice samples spiked with 10-500 μg/kg toxins

2.2 樣品前處理方法的選擇

考察了3種QuEChERS樣品前處理方法對(duì)8種真菌毒素的提取回收率，以大米為基質(zhì)，在添加水平(10 μg/kg:AFB1,OTA;100 μg/kg:HT-2,T-2,ZEN;250 μg/kg:FB1,FB2;500 μg/kg:DON)下，分別采用QuEChERS方法、EMR-lipid方法和DisQuE方法進(jìn)行提取。由圖1可以看出，當(dāng)以乙腈-水體系(QuEChERS方法)對(duì)8種真菌毒素提取時(shí)，F(xiàn)B1，F(xiàn)B2和OTA的回收率均小于10%，其他5種真菌毒素的回收率為95%～116%，因此QuEChERS方法適用于DON，AFB1，HT-2，T-2和ZEN的測(cè)定。而當(dāng)提取溶劑為甲酸-乙腈共萃取劑(EMR方法提取液中含0.1%甲酸,DisQuE方法中含10%甲酸)時(shí)，能夠兼顧FB1，F(xiàn)B2和OTA的提取效果。這與已有報(bào)道基本一致[21,27]，由于多數(shù)真菌毒素偏酸性[1]，特別是OTA(苯基丙氨酸部分的pKa=4.4)對(duì)提取液pH值較為敏感，而甲酸-乙腈的酸性環(huán)境可抑制真菌毒素的電離，使得目標(biāo)化合物在乙腈中的分配系數(shù)增加，從而提高了提取效率。EMR-lipid方法測(cè)得AFB1和HT-2的回收率小于60%，但EMR-lipid方法能夠同時(shí)滿足FB1，F(xiàn)B2，T-2，ZEN和OTA的測(cè)定，回收率均大于85%。而DisQuE方法能夠兼顧8種真菌毒素的提取效果，回收率均大于72%。

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect,ME)是影響LC-MS/MS定量分析準(zhǔn)確性的重要因素。實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)弱來進(jìn)一步評(píng)價(jià)DisQuE方法和EMR-lipid方法的純化效果[25]。分別以兩種方法處理得到的樣品粗提液、樣品純化后溶液和0.1% 甲酸水溶液配制8種真菌毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。各目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度范圍為：AFB1，OTA：0.2～25.0 μg/L；HT-2，T-2，ZEN：5.0～250.0 μg/L；FB1，F(xiàn)B2：10.0～500.0 μg/L；DON：20.0～1 000.0 μg/L。經(jīng)LC-MS/MS測(cè)定，以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積(y)對(duì)含量(x,μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以前兩組樣品獲得的曲線斜率與后一組樣品獲得的曲線斜率比值(η)來判定基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱[28]。η值越接近1，基質(zhì)效應(yīng)越弱；η值偏離1越大，基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)。結(jié)果表明，與DisQuE方法相比，EMR-lipid方法的基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)(如圖2)。當(dāng)樣品經(jīng)EMR-lipid方法凈化后，ZEN和OTA均表現(xiàn)出較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，ZEN的η值為1.80，而OTA的η值高達(dá)2.36。而當(dāng)樣品經(jīng)DisQuE方法凈化后，各目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)明顯減弱，其η值在1.00～1.16之間。由于兩種方法的稀釋倍數(shù)不同，因此比較了在稀釋倍數(shù)相同的情況下DisQuE方法和EMR-lipid方法的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，即使在稀釋相同倍數(shù)的條件下，EMR-lipid方法仍具有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，其η值介于0.92～2.31之間。這可能是由于DisQuE方法采用C18和Al-N作為吸附劑，C18可有效去除基質(zhì)中的脂類、糖類等親脂型雜質(zhì)，Al-N則通過與基質(zhì)中含有N，O，P，S等化合物形成金屬簇來有效地除去極性雜質(zhì)[21]。而EMR-lipid方法只能去除親脂類等雜質(zhì)[24]。

由此可見，DisQuE方法具有較好的純化效果，提高了方法的準(zhǔn)確度。因此最終選擇DisQuE方法作為本實(shí)驗(yàn)的樣品前處理方法。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

用0.1%的甲酸水溶液配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)行測(cè)定，分別以各分析物定量離子的峰面積對(duì)質(zhì)量濃度(μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各化合物的線性范圍如表2所示，其相關(guān)系數(shù)均大于0.995 7。

表2 方法的靈敏度、相關(guān)系數(shù)(r)及回收率(n=6)

*y:peak area;x:mass concentration of analyte,μg/L

采用外標(biāo)法定量，應(yīng)用“1.4.3”的DisQuE樣品前處理方法，在大米空白基質(zhì)(安徽省小樓村) 中添加低、中、高3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)。在大米樣品中添加不同濃度的待測(cè)物，按本方法進(jìn)行檢測(cè)，以S/N=3確定各目標(biāo)化合物的檢出限(LOD)，以S/N=10確定各目標(biāo)化合物的定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，目標(biāo)分析物的平均加標(biāo)回收率為70.0%～124.1%，RSD為0.9%～16.9%；8種目標(biāo)物的LOD為1.2～60.0 μg/kg，LOQ為4.0～200.0 μg/kg(表2)，方法的靈敏度完全滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)真菌毒素的限量檢測(cè)要求[18,29]。圖3為空白大米加標(biāo)回收的定量離子色譜圖。

圖3 空白大米加標(biāo)回收的定量離子色譜圖

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用本方法，對(duì)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采購的20份大米樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，大米樣品中均不同程度地檢出FB1和FB2，其余真菌毒素均未檢出。FB1,FB2在大米樣品中的提取離子色譜圖見圖4。

3 結(jié) 論

本文建立了一種基于分散固相萃取原理的DisQuE前處理技術(shù)，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定大米中黃曲霉毒素B1等8種真菌毒素的方法。通過比較QuEChERS，EMR-lipid以及DisQuE 3種不同前處理方法凈化后目標(biāo)物的提取效率及基質(zhì)效應(yīng)，驗(yàn)證了DisQuE提取方法的有效性。通過優(yōu)化液相色譜與質(zhì)譜的采集參數(shù)，得到了最佳的儀器檢測(cè)條件。方法學(xué)考察及實(shí)際樣品的檢測(cè)證明，該方法實(shí)用、可靠，具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可作為大米中真菌毒素的快速檢測(cè)方法。

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Determination of Eight Mycotoxins in Rice by Dispersive Solid Phase Extraction Coupled with Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SUN Wei-hua,YANG Huan,CAO Zhao-yun,MA You-ning,QIN Mei-ling,CHAI Shuang-shuang,CHEN Ming-xue*

(Rice Product Quality Inspection and Supervision Center of Ministry of Agriculture,China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China)

A rapid method was developed for the determination of HT-2 toxin,T-2 toxin,fumonisin B1,fumonisin B2,zearalenone,ochratoxin A,deoxynivalenol and aflatoxins B1 in rice.Three dispersive solid phase extraction sample preparation methods,including QuEChERS method,EMR-lipid method and DisQuE method,were compared for the determination of 8 mycotoxins in rice.The recoveries of the three extraction methods for the toxins were studied.The method of after-extraction addition was used to evaluate the matrix effects for mycotoxins in rice by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).As a result,the QuEChERS method was not suitable for the analysis of fumonisin B1,fumonisin B2 and ochratoxin A.The EMR-lipid methods could not overcome the matrix effects of zearalenone and ochratoxin A in rice.In this study,mycotoxins were extracted by DisQuE method,and analysed by LC-MS/MS under the optimized condition with monitoring 16 pairs of MS/MS transitions of precursor ions(two for each mycotoxin) in one single run.Recoveries at three fortified levels in rice ranged from 70.0% to 124.1% with relative standard deviations of 0.9%-16.9%.The limits of detection(S/N≥3) were in the range of 1.2-60.0 μg/kg.The method was proved to be highly efficient,robust and sensitive,and was suitable for the simultaneous analysis of mycotoxins in rice.

QuEChERS method;EMR-lipid method;DisQuE method;liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS);mycotoxins;rice

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.008

2016-07-03；

2016-08-04

國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目(GJFP2016001001);中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2014RG006)

*通訊作者：陳銘學(xué)，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)，Tel:0571-63370275，E-mail:cmingxue@163.com

O657.63；S852.44

A

1004-4957(2017)01-0047-07