鐵皮石斛莖基部2種主要病害病原菌的分離與鑒定

王國榮, 沈偉東, 孫 超, 沈肖玲, 邱春英, 蘇珍珠, 樓兵干*

(1. 浙江省杭州市蕭山區(qū)農業(yè)技術推廣中心,杭州 311203; 2. 浙江大學生物技術研究所,杭州 310029)

鐵皮石斛莖基部2種主要病害病原菌的分離與鑒定

王國榮1, 沈偉東1, 孫 超2, 沈肖玲2, 邱春英1, 蘇珍珠2, 樓兵干2*

(1. 浙江省杭州市蕭山區(qū)農業(yè)技術推廣中心,杭州 311203; 2. 浙江大學生物技術研究所,杭州 310029)

鐵皮石斛莖基部病害是鐵皮石斛的重要病害,嚴重影響鐵皮石斛的產量和質量。為了明確引起浙江鐵皮石斛莖基部主要病害的病原菌,采集具典型癥狀的發(fā)病植株進行病原菌的分離、純化、病原菌形態(tài)學特征觀察、rDNA-ITS序列分析、致病性試驗結合田間癥狀,明確浙江鐵皮石斛莖基部主要病害是由齊整小核菌Sclerotiumrolfsii引起的白絹病和由尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum引起的枯萎病。兩種病害都侵染莖基部和莖，并最終導致整株死亡,區(qū)別是白絹病發(fā)病初期病部通常呈水漬狀、褪綠、略腫大、有時伴有黃色液體滲出,后腐爛枯死;枯萎病初期莖稈褪綠、萎蔫,后縊縮干枯而死。濕度大時,前者病部遍布白色絹狀菌絲體;后者病部出現(xiàn)白色及粉紅色霉狀物。

白絹病; 枯萎病; 形態(tài)學特征; rDNA-ITS; 齊整小核菌; 尖孢鐮刀菌

鐵皮石斛屬蘭科石斛屬Dendrobium,是非常名貴的中藥材[1],具有多重醫(yī)療保健功能[2]。野生鐵皮石斛資源量少,遠遠不能滿足市場的需求。自20世紀90年代起,浙江省在全國率先成功實現(xiàn)鐵皮石斛產業(yè)化開發(fā)利用,2013年全省鐵皮石斛產量和銷量均居全國第一[3]。除浙江省外,云南、安徽、貴州、廣西等省、自治區(qū)也已形成規(guī)模化生產。因石斛喜歡溫暖陰濕的環(huán)境,病蟲害尤其是病害越來越嚴重,制約了鐵皮石斛產業(yè)化、規(guī)模化的發(fā)展。2013-2015年,作者對浙江省鐵皮石斛種植基地的病害發(fā)生情況進行實地調查,發(fā)現(xiàn)造成鐵皮石斛嚴重減產以及內在品質下降的病害主要是莖基部病害,而鐵皮石斛的藥用部位是莖部。在浙江蕭山、義烏、建德、金華、臨安、樂清等基地,莖基部病害田間株發(fā)病率達30%以上,嚴重的成片死亡。國內外有關鐵皮石斛病害的研究基本上集中在田間調查與藥劑防控方面[4],對鐵皮石斛病害病原菌的研究除了黑斑病[5]和疫病[6]外,對其他病害的病原菌鮮有詳盡的研究報道。如對鐵皮石斛炭疽病的病原未經鑒定；對白絹病病原菌有的是經推測得到的[4]，有的報道是由不同的病原菌引起[7-8]；對鐮刀菌引起的枯萎病只鑒定到屬,對種名未作鑒定[4,8-9],對癥狀未見詳盡描述,這不利于對病害采取有效的防控措施。因此,本文著重就鐵皮石斛規(guī)?；耘嘀邪l(fā)生的莖基部主要病害的病原菌進行分離鑒定,為鐵皮石斛病害的綠色生態(tài)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及病原菌分離

2013-2015年連續(xù)在杭州市蕭山區(qū)、義烏市、樂清市等地鐵皮石斛基地進行田間調查,采集莖基部及莖中部的水漬狀、枯萎或枯死的鐵皮石斛樣本,裝入干凈牛皮紙袋中,帶回實驗室。取病健交界處組織,置于75%的乙醇中1 min,再用1%NaClO表面消毒3 min,然后重新置于75%的乙醇中漂洗30 s,最后將組織塊在無菌水中漂洗5次,用滅菌濾紙吸干水分并移入PDA平板上,25℃恒溫培養(yǎng)箱內黑暗培養(yǎng)。待菌落長出后即從菌落邊緣挑取極少量菌絲轉接至新的PDA培養(yǎng)基上進行純化,并在4℃冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌致病性測定

健康盆栽鐵皮石斛苗由杭州正德農業(yè)開發(fā)有限公司提供,置于溫室中,定時定量澆水和營養(yǎng)液,供致病性試驗用。將分離純化得到的代表性菌株SR1和FO2在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～5 d后,分別采用微傷口接種法和菌絲塊直接粘貼法進行接種試驗:用滅菌刀片將待接種的健康盆栽鐵皮石斛莖基部和距莖基部5 cm的莖上部輕輕劃傷,取待測病原菌菌絲塊(5 mm×5 mm),將菌絲面貼在傷口處;或者將菌絲塊直接貼在鐵皮石斛莖基部和距莖基部5 cm的莖部,每個處理3盆健康盆栽石斛,每盆接種6枝莖。對照組只接無菌的PDA瓊脂塊。將接種后的植株用塑料袋套袋保濕,置于人工氣候培養(yǎng)室中(25℃,L∥D=12 h∥12 h,90%相對濕度)。定期觀察發(fā)病情況并記錄結果,待發(fā)病后從病組織處再次分離純化病原菌。

1.3 病原菌的形態(tài)學特征觀察

將分離純化的菌株SR1、SR5、FO2和 FO6在25℃黑暗人工氣候箱內的PDA平板上培養(yǎng),長滿平板后,觀察菌落形態(tài)特征,在顯微鏡下觀察并記錄菌絲和孢子形態(tài)特征,對病原菌進行形態(tài)學鑒定。

1.4 病原菌rDNA-ITS序列擴增及分析

采用基因組DNA快速抽提法提取病原菌基因組DNA[10],采用核糖體內轉錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)基因擴增通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增。擴增反應總體積為40 μL,反應條件為95℃預變性2 min；94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min,4℃保存。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳回收目標DNA片段,由杭州擎科生物有限公司測序,測序結果用BLAST 軟件在GenBank上進行同源性比較。

1.5 翻譯延長因子EF-1α序列擴增分析和特異性引物的PCR擴增

對經rDNA-ITS序列分析確定為尖孢鐮刀菌的菌株,利用翻譯延長因子EF-1α引物[11]以及尖孢鐮刀菌rDNA-ITS特異性引物[12]進行PCR驗證,引物分別為EF1T(5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′);EF2T(5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′)和Fo1(5′-TACCACTTGTTGCCTCGGC-3′);Fo2(5′-TTGAGGAACGCGAATTAAC-3′)。擴增反應總體積和反應條件同1.4節(jié)。PCR反應產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳,在紫外透射儀下檢測PCR產物大小。

2 結果與分析

2.1 病害田間癥狀

在浙江蕭山、義烏、樂清地區(qū),鐵皮石斛莖基部病害可以危害當年移植的石斛苗,也危害2～3年生的石斛植株,高溫高濕的梅雨季節(jié)和夏、秋高溫季節(jié)是病害的高發(fā)期,在田間有明顯的發(fā)病中心,株發(fā)病率達30%以上,有的成片死亡,在病害發(fā)生過的地方,補栽的石斛苗發(fā)病率可達50%以上,常造成嚴重的經濟損失,病害在田間可終年發(fā)生危害。

莖基部病害最終導致葉片及莖稈失綠、黃化、萎蔫、枯萎或腐爛,但不同病害的初期癥狀與發(fā)生部位是有區(qū)別的,按癥狀主要可分為兩種,第一種多發(fā)生在高溫高濕的梅雨季節(jié),主要危害植株的莖基部以及根部。發(fā)病初期,近地面的莖基部呈現(xiàn)類似水浸狀的癥狀,發(fā)病處黃色至淡褐色,之后病斑迅速擴展至根部,然后全株發(fā)病,葉片及莖稈黃褐色,萎蔫或腐爛。當環(huán)境濕度大時,病部布滿白色絹絲狀菌絲,呈輻射狀延伸生長,可蔓延至根部基質(圖1a)。發(fā)病后期長出褐色圓形菜籽樣直徑約1～3 mm的粒狀菌核。該病一旦發(fā)生,植株很快腐爛和死亡。根據(jù)田間癥狀,作者推測該病害是由齊整小核菌Sclerotiumrolfsii引起的鐵皮石斛白絹病。

第二種多發(fā)生在夏、秋高溫季節(jié),主要危害植株莖稈。幼苗或新發(fā)枝感染時,植株下部葉片失綠變黃,莖稈黃化、萎蔫、枯萎(圖1b),隨著癥狀向上擴展,上部植株葉片也開始萎蔫下垂、變褐,下部葉片則開始脫落、皺縮,最后全株黃化枯萎。有的植株表現(xiàn)為一側枝葉枯萎,有的莖稈基部干枯縊縮,有的莖稈中部干枯縊縮,濕度大時病株莖基部可見白色或粉紅色霉狀物?；趯Σ≈臧Y狀的觀察分析,作者推測該病害是由鐮刀菌引起的鐵皮石斛枯萎病。

圖1 鐵皮石斛白絹病與枯萎病癥狀及致病性試驗結果Fig.1 Symptoms of sclerotial blight and Fusarium wilt on Dendrobium officinale and results of pathogenicity

2.2 病原菌分離及致病性測定

從病組織的根部、莖基部與莖上共分離純化出20株菌株,據(jù)在PDA上的生長速率與菌落形態(tài)特征,將其分成兩組,第一組菌株生長較快,菌絲白色,呈放射狀生長,后期出現(xiàn)黃褐色菌核,代表菌株為SR1和SR5,組內其他菌株均有相似生長性狀;第二組菌株生長較慢,菌絲白色絮狀,培養(yǎng)基底部呈現(xiàn)紫色環(huán)狀,代表菌株為FO2和FO6,組內其他菌株均有相似生長性狀。選取上述代表性菌株進行盆栽接種試驗,結果表明:微傷口法在莖基部、距莖基部5 cm處接菌株SR1和SR5 7 d后,幼嫩莖稈黃褐色水漬狀略腫大,葉片失綠發(fā)黃,后見病斑上下擴展,15 d后,莖稈及葉片上可見白色菌絲,21 d后,莖稈及葉片上覆蓋有大量白色絹狀菌絲體(圖1c),并呈放射狀分布,莖基部可見深黃色菜籽狀菌核,為白絹病癥狀。直接粘貼菌絲塊的接種處理也出現(xiàn)相似癥狀,但比微傷口接種癥狀出現(xiàn)遲3～5 d。微傷口法在莖基部、距莖基部5 cm處接菌株FO2和FO6 5 d后,幼嫩莖稈的莖基部葉片失綠變黃,21 d后幼嫩枝條頂部出現(xiàn)枯萎癥狀(圖1d),老熟莖稈頂部葉片出現(xiàn)一半葉片發(fā)黃枯萎癥狀(圖1e),45 d后幼嫩枝條莖稈完全干枯,皺縮(圖1f),此癥狀為枯萎病癥狀。直接粘貼菌絲塊的接種處理也出現(xiàn)相似癥狀,但比微傷口接種癥狀出現(xiàn)遲3～5 d。菌株SR1、SR5和FO2、FO6接于距莖基部5 cm處的莖上,前者出現(xiàn)褪綠、腫大、腐爛后枯死,后者也出現(xiàn)褪綠、但不腫大、而是縊縮干枯而死。接種PDA瓊脂塊的對照未見侵染癥狀。分離并純化感病組織處病原物,得到與SR1、SR5和FO2、FO6相同的病原菌。

2.3 分離菌株的菌落與形態(tài)學特征

菌株SR1在PDA培養(yǎng)基上的氣生菌絲較多,菌絲密集發(fā)達,向四周呈輻射狀蔓延,并形成粗壯的菌絲束,5 d左右長滿直徑為9 cm的平板(圖2a)。12 d左右形成淡黃色油菜籽狀菌核,不均勻地分布在培養(yǎng)基表面,30 d后變?yōu)辄S褐色(圖2b)。菌株SR5與SR1具有相同的菌落形態(tài)。

圖2 菌株SR1在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征Fig.2 Morphological characters of isolate SR1 on PDA

菌株FO2在PDA培養(yǎng)基上氣生菌絲發(fā)達,突起,白色絮狀(圖3a)。菌落底部呈紫色環(huán)狀(圖3b)。10 d長滿直徑為9 cm的平板。顯微鏡下可見大型分生孢子與小型分生孢子,大型分生孢子鐮刀形或月牙形(圖3c),向兩端較均勻地逐漸變尖,1～6個隔,大小為(21.23～32.73)μm×(3.49～5.67)μm,平均28.24 μm×4.42 μm。小型分生孢子卵圓形或腎形(圖3d-1),大小為(5.17～11.35)μm×(2.16～4.80)μm,平均7.46 μm×3.74 μm。顯微鏡下可見其多分支狀產孢結構(圖3d-2)。菌株FO6與FO2具有相同的菌落特征及分生孢子形態(tài)。

2.4 病原菌rDNA-ITS序列擴增及分析

分別以分離菌株FO2、SR1的基因組DNA為模板,用ITS通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增,分別擴增出約500 bp及650 bp(圖4a)的PCR 產物。將PCR產物提交杭州擎科生物有限公司測序。測序結果為菌株FO2的rDNA-ITS序列長度502 bp、SR1序列長度650 bp。用BLAST 軟件在GenBank中進行同源性比較,結果表明,菌株FO2和SR1的rDNA-ITS序列分別與GenBank中登錄號為KR708632.1的尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum和登錄號為KP257582.1的齊整小核菌Sclerotiumrolfsii具有99%的相似性。根據(jù)菌株的形態(tài)和rDNA-ITS序列同源性比對結果,將菌株FO2鑒定為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum, 菌株SR1鑒定為齊整小核菌Sclerotiumrolfsii。

圖3 菌株FO2在PDA上的形態(tài)學特征Fig.3 Morphological characters of isolate FO2 on PDA

圖4 FO2、SR1的rDNA-ITS擴增產物及FO2的特異性引物Fig.4 rDNA-ITS amplification products of the isolates FO2 and SR1 and FO2 verification by specific primers

2.5 翻譯延長因子EF-1α序列擴增分析和特異性引物的PCR擴增

用翻譯延長因子EF-1α引物EF1T和EF2T以及尖孢鐮刀菌rDNA-ITS特異性引物Fo1和Fo2對病原菌FO2進行PCR驗證,分別得到大小約為700 bp及300 bp(圖4b)的目的片段。將PCR產物提交杭州擎科生物有限公司測序。測序結果表明,EF-1α引物和尖孢鐮刀菌rDNA-ITS特異性引物的產物長度分別是668 bp和320 bp,用BLAST 軟件在GenBank中進行同源性比較。結果表明,菌株FO2上述兩種專性引物的rDNA-ITS序列與GenBank中登錄號為KR708632.1的尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum具有99%的同源相似性,進一步證實了分離菌株FO2為尖孢鐮刀菌。

3 結論與討論

通過從具有典型癥狀的病株上分離病原物,經致病性試驗、病原菌形態(tài)學特征觀察、rDNA-ITS序列分析,結合田間癥狀觀察,明確引起浙江省杭州市蕭山區(qū)、義烏市、樂清市等地鐵皮石斛莖基部腐爛、萎蔫死亡的主要病害是由齊整小核菌Sclerotiumrolfsii引起的白絹病和由尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum引起的枯萎病。在田間這兩種病害都引起莖基部、莖部枯死,兩者的區(qū)別是白絹病發(fā)病初期通常呈水漬狀、褪綠、略腫大、有時伴有黃色液體滲出,后腐爛枯死;枯萎病初期褪綠、萎蔫、后縊縮干枯而死。濕度大時,前者病部遍布白色絹狀菌絲體,初為白色,后轉為黃色,最后變?yōu)樯詈稚?條件合適,任何部位如根、莖、葉等均可感病;后者病部出現(xiàn)白色及粉紅色霉狀物。

研究結果表明,引起鐵皮石斛白絹病的病原菌是齊整小核菌S.rolfsii,李海明等[7]和徐明全等[8]鑒定的白絹病病原菌也是齊整小核菌,而周傳波和林盛[13]認為是由羅氏白絹菌Pelliculariarolfsii引起,作者在文中沒有說明寄主的種名,只說是蘭花白絹病。曹星星[14]從鐵皮石斛莖腐病病組織中分離到磚紅鐮孢菌F.incarnatum和層出鐮孢菌F.proliferatum,二者侵染植株后均可引起莖稈維管束變黑色或褐色環(huán)變。由尖孢鐮刀菌F.oxysporum引起的鐵皮石斛枯萎病并未發(fā)現(xiàn)引起維管束變色,且該病原菌未見前人作過分離鑒定[4,7-8]。

野生石斛在協(xié)同進化過程中與周圍環(huán)境、微生物建立了某種平衡,很少發(fā)生病害。人工種植石斛主要為設施栽培,具有溫度高、濕度大、空氣流通差等特點,非常有利于病原菌的生長繁殖。浙江梅雨季節(jié)溫度高、濕度大,加上基質過濕,通風不良,導致白絹病嚴重發(fā)生。目前防治白絹病主要采用甲霜·惡霉靈和苯甲·嘧菌酯[15],防治枯萎病主要采用咪鮮胺和雷帕霉素[14]。由于鐵皮石斛是名貴的中藥材,在栽培管理過程中應盡可能少用化肥與農藥,我國大面積規(guī)?；氖斯しN植是近5年的事,屬于迅速發(fā)展的中藥材。目前有關藥用石斛病害的基礎性研究很少,病害防治以化學防治為主,用藥盲目性大,建議加強生產與科研單位的合作與配合,從病原學和病害流行學入手,研究明確病害流行發(fā)生規(guī)律,找出關鍵防治時期,開展綠色生態(tài)防控研究,保障石斛種植產業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。

[1] 聶少平, 蔡海蘭.鐵皮石斛活性成分及其功能研究進展[J].食品學, 2012, 33(23):356-361.

[2] Li Ying, Zhao Yaping, Chen Peiyi, et al. The scavenging oxygen free radical effects of water extract from five kinds ofDendrobiumcandidum[J]. Chinese Traditional Herbal Drugs,2004, 35(11):1240-1242.

[3] 馬江, 葉琪明. 浙江省鐵皮石斛產業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀、問題與對策[J]. 環(huán)球市場信息導報, 2014(6):73.

[4] 李戈, 李榮英, 高微微. 藥用石斛規(guī)?；N植中的病害問題及防治策略[J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(4):485-488.

[5] 張敬澤, 鄭小軍. 鐵皮石斛黑斑病病原菌的鑒定和侵染過程的細胞學研究[J]. 植物病理學報, 2004, 34(1):92-94.

[6] 李靜, 張敬澤, 吳曉鵬, 等. 鐵皮石斛疫病及其病原菌[J].菌物學報, 2008, 27(2):171-176.

[7] 李海明, 林江波, 王偉英,等. 鐵皮石斛白絹病的分離鑒定與抑菌藥劑篩選[J].福建農業(yè)學報, 2015, 30(9):901-904.

[8] 徐明全,鄭平,劉榮維,等. 蘭花主要病害鑒定及藥劑篩選試驗[J].廣東農業(yè)科學, 2005(5):46-49.

[9] 席剛俊,徐超,史俊,等. 石斛植物病害研究現(xiàn)狀[J]. 山東林業(yè)科技, 2011(5):96-98.

[10]Chi M H, Park S Y, Lee Y H. A quick and safe method for fungal DNA extraction [J]. Plant Pathology, 2009, 25(1):108-111.

[11]O’Donnell K, Kistler H C, Cigelnik E,et al.Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana:Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies [J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998, 95(5):2044-2049.

[12]吳學宏,韓魯明,陳倩,等.西瓜種傳鐮刀菌形態(tài)和分子鑒定及其對種子發(fā)芽的影響[J].植物病理學報,2009,39(2):118-124.

[13]周傳波,林盛. 海南熱帶蘭花病害種類與防治[J]. 中國熱帶農業(yè), 2007(1):52-53.

[14]曹星星. 鐵皮石斛病原真菌分離與鑒定及印度梨形孢促生作用研究[D]. 杭州:浙江大學, 2015: 53.

[15]梁君,張科立,張珂瑩, 等. 鐵皮石斛白絹病防治藥劑篩選試驗[J].浙江農業(yè)科學, 2015, 56(6): 839-842.

(責任編輯：楊明麗)

Isolation and identification of two main basal stem pathogens onDendrobiumofficinale

Wang Guorong1, Shen Weidong1, Sun Chao2, Shen Xiaoling2, Qiu Chunying1, Su Zhenzhu2, Lou Binggan2

(1.XiaoshanAgriculturalTechnologyExtensionCenterofHangzhouCity,ZhejiangProvince,Hangzhou311203,China;
2.InstituteofBiotechnology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China)

The basal stem diseases are important diseases onDendrobiumofficinaleand have great impact on the yield and quality. In order to identify the pathogens of the main basal stem diseases onD.officinalein Zhejiang, we collected typical diseased plants and clarified the main basal stem diseases by pathogens isolation, purification, morphology characters observation, rDNA-ITS sequence analysis, and pathogenicity identification combined with field symptoms. The results indicated that the main diseases are southern blight disease caused bySclerotiumrolfsiiandFusariumwilt disease caused byFusariumoxysporum.Both diseases can infect the basal stem and stem, and finally caused the death of the whole plant. The differences of the two diseases are that the symptoms of southern blight usually are water soaking, chlorisis, slight swelling at the early infection stage, sometimes combined with yellow leaking liquid, and the plants become rot and then die, while theFusariumwilt shows chlorisis and wilt at the early infection stage and the plant die of drying shrinkage. With high humidity, the diseased parts infected by southern blight are full of white silky mycelium while theFusariumwilt infected plants show white and pink mold shaped substance.

southern blight;Fusariumwilt; morphology characters; rDNA-ITS;Sclerotiumrolfsii;Fusariumoxysporum

2016-03-01

2016-05-22

浙江省“三農六方”項目(N20120623)

S 435.672

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.030

* 通信作者 E-mail: bglou@zju.edu.cn