綠色熒光蛋白標記SOX9基因慢病毒載體的構建及在兔骨髓間充質干細胞中的表達

劉 偉，王 杰，幸永明，趙 宏，龔德軍

(1.解放軍第113醫(yī)院 骨科，浙江 寧波 315040； 2.第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院 胸心外科實驗室，上海 200433)

綠色熒光蛋白標記SOX9基因慢病毒載體的構建及在兔骨髓間充質干細胞中的表達

劉 偉1，王 杰1，幸永明1，趙 宏1，龔德軍2

(1.解放軍第113醫(yī)院 骨科，浙江 寧波 315040； 2.第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院 胸心外科實驗室，上海 200433)

目的 構建綠色熒光蛋白標記的SOX9基因慢病毒載體，轉染兔骨髓間充質干細胞，觀察SOX9基因的表達情況。方法 雙酶切從GeneArt提供的含SOX9基因序列的質粒13ABIV6C_1366933并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP載體，獲得含SOX9基因的質粒pLMIG-13GS0345-1，通過293T細胞包裝后獲得綠色熒光蛋白標記的SOX9基因慢病毒載體(Lenti-SOX9-GFP)，將Lenti-SOX9-GFP轉染兔骨髓間充質干細胞后觀察SOX9基因的表達情況。結果 測序結果顯示質粒pLMIG-13GS0345-1中的插入序列與基因庫中SOX9(NM_000346)基因序列完全一致，成功構建Lenti-SOX9-GFP慢病毒載體。Lenti-SOX9-GFP轉染兔骨髓間充質干細胞后可觀察到綠色熒光蛋白的表達，RT-PCR與Western Blot檢測結果證明Lenti-SOX9-GFP轉染目的細胞后可在mRNA及蛋白水平成功表達SOX9。結論 本實驗成功構建了綠色熒光蛋白標記的攜帶SOX9基因的Lenti-SOX9-GFP慢病毒載體，并在兔骨髓間充質干細胞中成功表達，為下一步研究提供前期實驗基礎。

慢病毒載體；骨髓間充質干細胞；椎間盤；SOX9基因；綠色熒光蛋白

(ChinJLabDiagn,2017,21:0140)

已有許多研究證實調節(jié)II型膠原合成的Sox-9基因 (sex determining region Y-Box9，Sox-9)在髓核退變中發(fā)揮重要的作用，SOX9基因可能參與了椎間盤從發(fā)育、成熟到退變的整個變化過程，增加SOX9可以明顯增加II型膠原的合成，從而可能達到對退變椎間盤的修復作用[1,2]。目前采用基因轉染技術加強或改造種子細胞是當今組織工程研究中熱點[3]，通過基因轉染可以達到較為長期、高效、局部的效果，避免了直接應用生長因子時可能發(fā)生的過量反應和全身性毒副作用。慢病毒載體(Lentiviral vector)是組織工程基因改造最具潛力的載體之一，相對于腺病毒載體和逆轉錄病毒載體具有轉移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、免疫反應小、感染率高等優(yōu)點。本研究即構建綠色熒光蛋白標記的攜帶SOX9基因的慢病毒載體，并觀察其是否能成功轉染兔骨髓間充質干細胞和是否可在mRNA及蛋白水平成功表達SOX9，為下一步實驗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 13ABIV6C_1366933質粒(GeneArt)；BamHI (MBI)；AscI (MBI)；感受態(tài)細胞DH5α (全式金)；pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP(Invitrogen改造)；T4 DNA ligase(NEB)；氨芐抗生素溶液及平板(Invitrogen Shanghai制備)；DNA凝膠回收試劑盒(Axygen)；包裝質粒pLP1，pLP2，pLP/VSVG(Life technologies)；293T細胞 (Life technologies)；DMEM + 10% FBS(Life technologies)；lipofectamine 2000 (Life technologies)；Opti-MEM 培養(yǎng)液(Life technologies)，0.05% Trypsin (Life technologies)。引物由上海吉瑪制藥技術有限公司(Shanghai GenePharma Co.,Ltd)合成。鼠抗兔SOX9蛋白抗體 LifeSpan BioScience公司(美國)。鼠抗兔β-actin單克隆抗體購自Sigma公司(美國)。羊抗鼠IgG-HRP購自北京中山生物技術有限公司。

1.2 合成片段亞克隆至pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP載體及測序鑒定

從GeneArt提供的質粒13ABIV6C_1366933中按BamHI和AscI雙酶切下目的片段并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP載體中。用BamHI和AscI雙酶切質粒，酶切體系如下：13ABIV6C_1366933_ZCY-Liu_Wei質粒 (約150 ng/μl)6 μl，BamHI 1 μl，AscI 2 μl，10× BamHI Buffer 5 μl，ddH2O 36 μl，37℃酶切2 h后電泳回收。用BamHI和AscI雙酶切載體pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP，酶切體系如下：pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP (約150 ng/μl)6 μl，BamHI 1 μl，AscI 2 μl，10× BamHI Buffer 5 μl ，ddH2O 36 μl，37℃酶切2 h后電泳回收。連接目的片段和載體，連接體系如下：Ligation buffer 0.5 μl，13GS0345 DNA片段 (BamHI / AscI) 3 μl，pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP (BamHI / AscI) 1 μl，T4 DNA Ligase(10 U/μl)0.5 μl。16℃連接2 h后轉化到感受態(tài)細胞DH5α。測序驗證重組克隆插入片段的序列信息，含有目的序列的正確質粒編號為pLMIG-13GS0345-1。

1.3 慢病毒的包裝、轉染和病毒滴度的測定

慢病毒包裝:取細胞狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的293T細胞，細胞計數(shù)后，按照每個10 cm的培養(yǎng)皿6×106個細胞數(shù)接種于培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；第二天轉染前移去培養(yǎng)液，換5 ml Opti-MEM培養(yǎng)液；取9 μg Packaging Mix(Life)和 3 μg慢病毒表達質粒加入1.5 ml Opti-MEM(經(jīng)37℃預熱)中，輕輕混勻；取36 μl lipofectamine2000 加入1.5 ml Opti-MEM中，輕輕混勻，室溫放置5 min；輕輕混合質粒溶液和lipofectamine 2000稀釋液，置室溫20 min；將3 ml質粒脂質體復合物小心地加入到細胞培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育6 h后，更換完全培養(yǎng)液 DMEM +10% FBS；48 h后收集細胞培養(yǎng)上清，3 000 rpm 離心10 min，去除細胞和碎片，并用0.45 μm的濾器過濾；將病毒原液在50 000 g下超速離心2 h，去除上清，重懸于opti-MEM培養(yǎng)液中，滴度測定后分裝成小管保存于-80度。構建的攜帶綠色熒光蛋白的SOX9基因慢病毒載體標記為Lenti-SOX9-GFP。

慢病毒活性滴度測定：慢病毒滴度測定前一天細胞鋪板，HEK293細胞胰酶消化后輕輕吹打成單細胞懸液，細胞計數(shù)后鋪96孔板，約8000個細胞每孔。慢病毒稀釋用培養(yǎng)基的配制：DMEM中加入2%FBS，再添加8 μg/ml 的Polybrene，混合均勻后備用。對慢病毒液稀釋，慢病毒原液或慢病毒濃縮液用慢病毒稀釋用培養(yǎng)基10倍比稀釋后，各取100 μl感染96孔板中的HEK293細胞。小心吸去96孔板中的培養(yǎng)基，輕輕混勻各管慢病毒稀釋液，各取100 μl加入每孔細胞中，每個稀釋度兩個重復。放入37度的細胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。計算慢病毒滴度，96 h后，在熒光顯微鏡下觀察各孔中熒光細胞數(shù)量，病毒滴度為各孔中表達熒光的細胞數(shù)平均數(shù)除以每孔中含有的慢病毒液體積。

1.4 兔骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)

取健康新西蘭大白兔(雄性，3-5周齡，體重1-2 kg)麻醉后，雙側股骨粗隆部位脫毛，碘酒消毒，在無菌操作下16號骨髓穿刺針在股骨粗隆處穿入股骨骨髓腔，穿刺針連接10 ml注射器，內含0.2 ml肝素(濃度3 000 U/ml)，每只兔抽取約5 ml的骨髓液。1 000 rpm離心5 min，棄上清液，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(含有100 U/ml青霉素、100 mg/mL鏈霉素)反復吹打混勻后，將單細胞懸液接種于細胞培養(yǎng)瓶中，在37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72小時后首次換液，后隔日換液。待細胞長滿瓶底時(融合率達90%)，通過倒置顯微鏡觀察細胞并拍照。倒掉培養(yǎng)液，PBS 洗滌兩遍，胰酶消化后，以1∶4比例將細胞傳到培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)傳代。

1.5 轉染效率測定

取第三代生長狀態(tài)良好的BMSCs細胞進行消化，以5×104/孔鋪12孔板，待細胞達至70%-80%融合時，分別轉染空白慢病毒載體或Lenti-SOX9-GFP慢病毒載體。感染復數(shù)(Muhiplicities of infection，MOI)分別為50、100、150、200，輕輕混勻。置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛固定15 min；PBS再次漂洗5 min后，加入DAPI工作液室溫染色20 min，PBS漂洗后通過倒置熒光顯微鏡觀察轉染后細胞中細胞核與胞質中的熒光發(fā)光情況，倒置熒光顯微鏡下取6個視野細胞計數(shù)，計算各MOI值轉染情況下病毒的轉染效率，公式為：轉染率 = 紅(或綠)熒光細胞數(shù) / 鏡下DAPI標記的細胞數(shù)×100%。

1.6 MTT法檢測轉染對BMSCs增殖的影響

取第三代生長狀態(tài)良好的BMSCs細胞進行消化，以1×104/孔鋪96孔板，待細胞達至70%-80%融合時，將高轉染復數(shù)的Lenti-SOX9-GFP慢病毒載體轉染BMSCs細胞(MOI 200)，每組設3個平行孔，未處理組作為陰性對照。分別從轉染后第1-5天采用MTT法檢測細胞生長情況，每天取出一塊培養(yǎng)板，向每孔加入20 μl新鮮配制的MTT液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸去孔內培養(yǎng)上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μl，振蕩10 min，使結晶物充分溶解后在酶標儀上讀取570 nm波長的光密度OA值。

1.7 慢病毒載體介導的SOX9基因在兔骨髓間充質干細胞內的表達

將Lenti-SOX9-GFP以優(yōu)化的MOI值轉染BMSCs，方法同上，以正常BMSCs細胞作為對照組。

RT-PCR檢測慢病毒轉染BMSCs后SOX9 mRNA的表達：將BMSCs以5×104/孔鋪12孔板，待細胞達至70%-80%融合時，Lenti-SOX9-GFP轉染培養(yǎng)72 h后，PBS溶液清洗2次，加入Trizol試劑裂解各組細胞，按照參照Qiagen公司逆轉錄試劑盒說明書提取總RNA。進一步對各組細胞RT-PCR檢測(RT-PCR引物如下)：正向引物：5’-TCTCAGGCTTTGCG ATTT-3’，反向引物：5’-TGCTCGGGCACTTATTGG-3’，反應條件：94℃ 40sec；94℃ 40 sec，58℃ 40 sec，72℃ 2 min，35 cycles；72℃ 5 min。反應結束后取5 μl產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，預期產(chǎn)物長度304 bp。

Western-Blot檢測慢病毒轉染BMSCs后SOX9蛋白的表達：轉染方法同上，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，提取各孔總蛋白質：吸取培養(yǎng)液，PBS清洗3次，向各組BMSC細胞孔加入1 ml預冷的細胞裂解液，冰上裂解20 min，4℃轉速12 000 rpm離心10 min，收集上清液至EP管中，BCA試劑盒蛋白定量后，80℃保存?zhèn)溆谩Ｄz電泳和轉膜后進行免疫雜交反應，PVDF置于反應盒，加入5% TBSTM液，4℃封閉過夜，棄封閉液后，加入1∶500鼠抗兔SOX9蛋白抗體和1∶1 000的β-actin單克隆抗體溶液，室溫振蕩孵育2小時，TBST漂洗3次。再加入1∶2 000辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠抗體溶液，室溫振蕩孵育30 min，TBST漂洗3次。在PVDF膜上滴加2 ml化學發(fā)光試劑ECL作用5 min，暗室內用底片曝光，形成蛋白條帶以評價SOX9蛋白的表達。

1.8 統(tǒng)計學分析

利用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析，P值<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 質粒及對應的測序結果

測序結果顯示質粒pLMIG-13GS0345-1中的插入序列與SRY-related high mobility group-box gene 9，SOX9(NM_000346，共1 550 bp)完全一致(測序圖略)，未見堿基突變。序列插入位點位于pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP載體的BamHI/AscI(圖1)。

圖1 pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP載體圖譜

2.2 慢病毒的包裝和滴度的測定 將構建的病毒原液轉染293T細胞24小時后，在熒光顯微鏡下同一視野的熒光和可見光照片如下(圖2)。慢病毒滴度測定結果為2.5*107TU/ml。

圖2A Lenti-SOX9-GFP轉染293T細胞后熒光顯微鏡下可見綠色熒光的表達；B，同一視野下的可見光照片

2.3 兔BMSCs細胞的體外培養(yǎng)

剛提取的BMSCs細胞為圓形，懸浮于培養(yǎng)液中，可見有圓盤狀血細胞混雜其中。培養(yǎng)7天左右BMSCs細胞已貼壁，細胞呈多角形生長。培養(yǎng)14天后BMSCs細胞貼壁，呈多種形態(tài)，如梭形，胞體膨大，有長短不一的胞質突起，呈集落生長(圖3A)。已傳第三代的BMSCs細胞，細胞純度較高，生長速度較快，細胞密度較高，已達95%融合(圖3B)。

圖3 兔BMSCs細胞的體外生長形態(tài)(A.BMSCs體外培養(yǎng)14天 B.體外培養(yǎng)第三代BMSCs)

2.4 Lenti-SOX9-GFP慢病毒載體對BMSCs轉染MOI的確定

慢病毒轉染后BMSCs細胞在倒置顯微鏡下呈梭形、多角形，胞質呈偽足伸展，相互交錯；在熒光顯微鏡下細胞呈多角形，胞體增大、胞質伸展相互交錯，胞質內充滿綠(或藍)色熒光物質(圖4)，DAPI標記的細胞核清晰可見，計算不同MOI值(50、100、150、200)條件下的轉染率如表1，測定結果顯示Lenti-SOX9-GFP的最佳轉染復數(shù)(MOI)為100，其轉染率約為85%。該結果證實SOX9慢病毒載體可成功轉染BMSCs細胞。

表1 Lenti-SOX9-GFP慢病毒轉染BMSCs后72小時，不同MOI值的轉染效率(n=6)

2.5 MTT法檢測轉染對MSCs增殖的影響

經(jīng)MTT細胞增殖試劑盒檢測Lenti-SOX9-GFP以高轉染復數(shù)轉染(MOI 200)BMSCs后5天內的生長情況(表2)，實驗結果顯示慢病毒轉染的細胞生長曲線與未處理的細胞基本一致，統(tǒng)計分析表明，各種處理細胞的生長特性差異無統(tǒng)計學意義P>0.05)。表明慢病毒轉染對MSCs的生長增殖沒有明顯的影響，為進一步研究奠定基礎。

表2 MTT法檢測Lenti-SOX9-GFP慢病毒轉染BMSCs后的OA值

圖4 Lenti-SOX9-GFP慢病毒載體轉染MSCs細胞(MOI 100)72小時后熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達

2.6 Lenti-SOX9-GFP轉染兔BMSCs后目的基因的表達

SOX9 mRNA表達：骨髓間充質干細胞被重組慢病毒Lenti-SOX9-GFP以MOI值100轉染后48小時，抽提細胞總RNA進行RT-PCR分析。結果顯示轉染組出現(xiàn)位置大小為320 bp的條帶，這與SOX9預期結果相符合，而對照組沒有發(fā)現(xiàn)SOX9的基因表達(圖5)。

A對照組(NEG)；B，Lenti-SOX9轉染組

SOX9蛋白的表達：經(jīng)Western-Blot檢測各組處理后BMSCs細胞中目的蛋白表達，結果如圖6所示，Lenti-SOX9-GFP轉染組中觀察到80-85 KDa處有條特征帶，其分子量大小與SOX9 融合蛋白(55 kDa+27 kDa=82 kDa)相吻合，條帶較強，對照組未見SOX9蛋白表達。

3 討論

Ⅱ型膠原在健康成人髓核基質中占極大比例，而隨著年齡的增長，其合成減少，降解增加。SOX9基因屬于SOX基因家族成員之一，是Ⅱ型膠原合成以及軟骨形成過程中的一個必需的轉錄因子，也是維持軟骨表型的主要調控基因。SOX9基因定位于染色體17q24.3-q25.1區(qū)段內，已有學者通過在退變的人椎間盤細胞中轉染腺病毒介導的SOX9基因，證實其可以使椎間盤細胞增殖、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的合成得到增加，表明SOX9基因參與了椎間盤從發(fā)育、成熟到退變的整個變化過程，增加SOX9可以明顯增加II型膠原的合成，從而可能達到對退變椎間盤的修復作用[2]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，通過SOX9轉染兔骨髓間充質細胞后，可上調SOX9基因的表達，使細胞內軟骨特異性的分子如II型膠原等的因子表達，增加椎間盤內II型膠原的合成，有望恢復椎間盤的生理活性，促進其修復[4]。

A：對照組；B：Lenti-SOX9轉染組

骨髓間充質干細胞(BMSCs)是目前髓核組織工程中應用最廣泛的種子細胞之一，與髓核細胞和軟骨細胞等其他髓核組織工程種子細胞相比，具有取材方便、對機體損傷少、與生物支架材料的粘附性能好、在體外培養(yǎng)具有較強的增殖傳代能力等優(yōu)點[5,6]。在對種子細胞的改造或促其向類髓核細胞方向轉化方面，目前則具有各種不同的方法，但主要集中在體外或體內應用細胞生長因子或將其通過基因轉染的方法導入細胞內表達促BMSCs向類髓核細胞轉化。利用細胞生長因子誘導BMSCs向類髓核細胞方向轉化的方法主要有體外誘導、體內誘導和基因轉染3種方法。體外誘導過程中，細胞生長因子的濃度很難控制，而體內應用則具有常不能耐受37℃體內環(huán)境、半衰期短、局部應用易于流失、誘導時間短等諸多缺點，通過基因轉染則可以達到較為長期、高效、局部的效果，避免了直接應用生長因子時可能發(fā)生的過量反應和全身性毒副作用。慢病毒載體(Lentiviral vector，LVs)屬于一種新型的逆轉錄病毒載體，它既可感染分裂細胞，也可感染非分裂細胞，還具有整合到宿主細胞基因組、穩(wěn)定長效轉染、感染效率高等優(yōu)點，能高效將目的基因(或RNAi)導入動物和人的原代細胞或細胞系[7]。本實驗選用的Invitrogen ViraPowerTM系列慢病毒系統(tǒng)為四質粒包裝系統(tǒng)，屬于第三代慢病毒載體系統(tǒng)[8]，可以高效感染宿主細胞，是實現(xiàn)基因治療較為理想的載體，在安全性上最大限度的降低了其產(chǎn)生復制型慢病毒(RCL)的可能性。

本實驗通過綠色熒光標記的慢病毒載體介導SOX9基因體外成功高效轉染兔BMSCs細胞，轉染后的BMSCs在熒光顯微鏡下細胞呈多角形，胞體增大、胞質伸展相互交錯，胞質內充滿綠色熒光物質，確定了慢病毒的最佳感染復數(shù)MOI為100，轉染效率約為90.3±5.2%。同時，通過MTT法檢測轉染后5天的細胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)構建的慢病毒轉染BMSCs后不影響其增殖能力。我們進一步將Lenti-SOX9-GFP在最佳MOI條件下轉染BMSCs，72小時后采用熒光顯微鏡觀察，RT-PCR與Western Blot檢測，結果證明Lenti-SOX9-GFP可成功高效轉染目的細胞并可在mRNA及蛋白水平成功表達SOX9，顯著高于對照組。本部分研究結果證實SOX9可在BMSCs穩(wěn)定表達，為下一步實驗奠定基礎。

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Construction of a SOX9 gene recombinant lentivirus vector marked by green fluorescent protein and it’s expression in rabbit bone marrow derived mesenchymal stem cells

LIUWei1,WANGJie1,XINGYong-ming1,etal.

(1.DepartmentofOrthopaedics,PLA113Hospital,Ningbo,315040,China;2.DepartmentofChestcardiaclaboratory,ChanghaiHospitalAffiliatedtoTheSecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200433,China)

Objective To build a recombinant lentivirus vector which express SOX9 gene and marked by green fluorescent protein,transfect the rabbit bone marrow mesenchymal stem cells,and observe the expression of SOX9 gene.Methods Double enzymed plasmid 13 abiv6c_1366933 containing SOX9 gene sequences provided by GeneArt,and cloned into pLenti6.3 _MCS_IRES2 - EGFP carrier,got the plasmid pLMIG- 13 gs0345-1 including SOX9 gene,packed by 293T cells and then we got the lentivirus vectors recombined with SOX9 gene and green fluorescent protein markers (Lenti-SOX9-GFP).We transfected the Lenti-SOX9-GFP into rabbit bone marrow mesenchymal stem cells and observed the expression of SOX9 gene.Results Sequencing results showed that the insert sequence of plasmid gs0345 pLMIG - 13-1 was completely consistent with the SOX9 gene sequences (NM_000346) in the Genbank.We Successfully built the lentivirus vector recombined with SOX9 and green fluorescent protein gene.The expression of green fluorescent protein can be observed after the rabbit bone marrow mesenchymal stem cells transfected by Lenti-SOX9-GFP.The RT-PCR and Western Blot test results also proved that the mRNA and protein expression of SOX9 gene could successfully observed after the rabbit BMSCs cells transfected by Lenti-SOX9-GFP.Conclusion A recombinant lentivirus vector containing SOX9 and green fluorescent protein gene was successfully constructed and successfully expressed in the rabbit BMSCs cells,provided preliminary experimental basis for further research.

Lentiviral vector;Bone marrow derived mesenchymal stem cells;SOX9 gene；Green fluorescent protein

1007-4287(2017)01-0140-06

南京軍區(qū)重點課題 (12Z06)

Q813

A

劉偉(1982-)，男，主治醫(yī)師，醫(yī)學博士。研究方向：脊柱外科和組織工程。

2016-05-10)