慢性阻塞性肺疾病患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Foxp3的表達

郝璐 張園

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郝璐 張園

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，慢阻肺) 是一種主要由免疫反應(yīng)所引起的以肺實質(zhì)、氣道和肺血管為特征的疾病[1]，發(fā)展趨勢為進行性，和肺部對有害氣體或者有害顆粒等的異常炎癥反應(yīng)存在密切聯(lián)系[2]，并與多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子有關(guān)[1]。其臨床表現(xiàn)主要為肺氣腫、黏液分泌增加以及阻塞性細(xì)支氣管炎[3]。有研究表明，慢阻肺發(fā)病的關(guān)鍵機制可能同它自身的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)紊亂有很大關(guān)聯(lián)[4]。并且，大量研究證實，慢阻肺患者的氣道、肺血管以及肺實質(zhì)中均存有慢性炎癥[5]。慢阻肺的發(fā)展是包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞等在內(nèi)的多種炎性細(xì)胞參與的結(jié)果[6]。因此，對這些炎癥細(xì)胞在慢阻肺中具體作用機制的了解還是十分有必要的。

資料與方法

一、研究對象

采用前瞻性研究方法，選擇 2013 年6月至 2015 年 3月我院收住的 慢阻肺 患者 105例，其中男性 64 例，女性 41 例，年齡 31-74 歲，平均年齡(47.2±8.6)歲；另選取本院科研志愿者108例作對照組，其中男性64例，女性44例，年齡 32-68歲，平均年齡(48.9±6.7)歲。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考 2010 慢阻肺 全球倡議及 2007年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會 慢阻肺 組制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]：①慢阻肺 危險因素接觸史(可有)；②咳嗽、咳痰、呼吸困難等癥狀(可有)；③存在不完全可逆的氣流受限：使用支氣管擴張劑后第1 秒用力呼氣容積占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC)<70%，F(xiàn)EV1<0.8預(yù)計值(必須具備)。

病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合 慢阻肺 診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡 30- 80歲女或男患者；③患者表明接受臨床研究是自愿，并取得患者知情同意。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①肺大皰者、合并氣胸和有出血傾向患者；②結(jié)核、支氣管擴張、囊性肺纖維化、腫瘤、真菌感染、由過敏因素或刺激性氣體導(dǎo)致的慢性咳嗽、喘息病患；③其他疾病如泌尿、代謝、心血管、消化系統(tǒng)等嚴(yán)重并發(fā)病，肝腎功能不全，癡呆、意識不清與其他精神病病患；④影響運動呼吸功能的神經(jīng)肌肉病患；⑤哺乳或妊娠期婦女。本研究經(jīng)我院學(xué)術(shù)倫理委員會審批同意并獲得所有研究對象的知情同意，且每位受試者入選前已簽知情同意書。

二、肺功能的測定

早晨開始測定。使用200μg沙丁胺醇 (上海威智醫(yī)藥科技有限公司) 15min后，采用德國生產(chǎn)的Carefusion型肺功能儀(型號：234Gmbh)測定肺功能參數(shù)：用力肺活量 (forced vital capacity , FVC)、第1秒用力呼氣容積 (forced expiratory volume in one second , FEV1)、FEV1/FVC、最大呼氣流量 (peak expiratory flow, PEF)。各指標(biāo)均以實測值占預(yù)計值百分比表示。

全部患者及對照組都在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽10mL外周靜脈血，其中的5mL用離心來分離出血清，在-70℃環(huán)境下保存用來進行細(xì)胞因子的檢測。另外5mL加入肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液 (AXIS-SHIELD公司)常規(guī)分離外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood monouclear cells, PBMC)，使用含 有10%小牛血清的RPMI-1640溶液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，取200μL的細(xì)胞液，在其中分別加入20μL抗CD25-PE和抗CD4-FITC的單克隆抗體，同型對照為IgG1-FE和IgG1-FITC，混勻后，避光孵育25至30min，然后用PBS溶液洗滌2次。接著將細(xì)胞懸浮于0.5mL PBS緩沖液中，震蕩均勻后，應(yīng)用EPICS-XL流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司)進行檢測，檢測指標(biāo)為各陽性細(xì)胞數(shù)量和所占比例。胎牛血清(FBS)和RPMI-1640培養(yǎng)基為美國GIBCO公司產(chǎn)品，抗CD4-FITC、抗CD25-PE、IgG1-FITC和IgG1-FE均為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品。

四、qPCR檢測

利用TRIZOL法常規(guī)提取PBMC總RNA[13]，各取2μg總RNA，按MBI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas MBI, Sacramento,CA,USA))說明書操作，使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UGD (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)進行PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體積20μL。Foxp3正義鏈5′-TTTCATGCACCAGCTCTCAATCAA-3′，反義鏈5′-ATGGCACTCAGCTTCTCCTTCCTTC-3′，產(chǎn)物長度580bp；GADPH正義鏈5′-AATCCCATCACCATCTTCCATCCA-3′，反義鏈5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGCTTG-3′，產(chǎn)物長度475bp。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，F(xiàn)oxp3 為45個PCR循環(huán)(95℃變性30s，55℃ 退火30s，72℃延伸90s)72℃10min再延伸，GADPH為45個PCR循環(huán)72℃(95℃變性30s，55℃ 退火30s，72℃延伸90s)72℃10min再延伸。定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠上電泳30min(100V)，用GDS8000型全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(英國UVP公司)進行掃描分析Foxp3基因相對表達水平采用2-ΔΔCt方法計算。

五、Western blot檢測

PBMC經(jīng)PBS清洗，細(xì)胞溶解緩沖液溶解后，一抗是小鼠抗人β-actin抗體，二抗是HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，顯色后采用X光片曝光，然后通過掃描及ScnImage分析系統(tǒng)處理，目的蛋白的相對含量即是目的蛋白條帶的光密度值與β-actin條帶光密度值的比值。小鼠抗人β-actin抗體和羊抗鼠IgG抗體購自上海瑞齊生物科技有限公司。

六、細(xì)胞因子檢測

采用定量ELISA法測定上述預(yù)留血液的IL-4(interleukin 4)、IL-10(interleukin 10)、IFN-α(interferon-α)、IFN-γ(interferon-γ)、TGF-β(transforming growth factor-β)水平，操作嚴(yán)格按ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司)的使用說明進行檢測。設(shè)空白對照，用酶標(biāo)儀(Bio-tek instuments inc公司)在450 nm測定吸光值(A)，雙管檢測，去掉對照A值后取其平均值。

七、統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、一般資料

慢阻肺組FEV1與對照組比較顯著下降 (72.4±7.9vs98.1±8.3,P<0.01)，F(xiàn)EV1/ FVC與對照組比較顯著下降 (70.2±10.9vs97.5±15.2,P<0.01)。慢阻肺組與對照組在年齡、性別、吸煙史、FVC和PEF均無統(tǒng)計學(xué)差異，均P>0.0，(見表1)。

二、慢阻肺與對照組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群比較

表1 一般資料

FVC, forced vital capacity; FEV1, forced expiratory volume in one second; PEF, peak expiratory flow

表2 慢阻肺與對照組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群比較(±s, %)

圖1 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

A：慢阻肺組流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果；B：對照組流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果. 注： IL-4, interleukin 4; IL-10, interleukin 10; IFN-α, interferon-α; IFN-γ, interferon-γ; TGF-β, transforming growth factor-β

三、慢阻肺組與對照組Foxp3 mRNA及蛋白表達差異

研究對象均采用全自動凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描分析，兩組組內(nèi)的Foxp3表達條帶相似，因此最終我們分別選取了1例慢阻肺患者和1例對照的條帶作為示例進行比較，慢阻肺患者與對照人群PBMC中Foxp3 mRNA的表達結(jié)果(圖2A)，可見慢阻肺組條帶顯示較對照組淺。慢阻肺患者PBMC中Foxp3 mRNA表達水平與對照組比較顯著低于對照組 (0.42±0.15vs0.69±0.18,P<0.01) (圖2)。

所有研究對象western blot分析，兩組組內(nèi)的Foxp3表達條帶很相似，因此最終我們分別選取了1例慢阻肺患者和1例對照的條帶作為示例進行比較，慢阻肺患者與對照人群PBMC中Foxp3 蛋白表達結(jié)果(見圖3A)?？梢妰山MPBMC中Foxp3蛋白的表達趨勢和Foxp3 mRNA是一致的，慢阻肺組條帶顯示較對照組淺。慢阻肺患者PBMC中Foxp3 蛋白表達水平與對照組比較顯著低于對照組 (0.29±0.09vs0.58±0.12,P<0.01) (圖3B)。

圖2 RT-PCR檢測兩組Foxp3 mRNA表達水平

注：圖A表示RT-PCR檢測兩組Foxp3 mRNA水平，其中1表示對照組；2表示慢阻肺組；圖B表示兩組Foxp3 mRNA表達水平比較

圖3 Western blot 檢測 兩組Foxp3 蛋白水平

注：圖A表示W(wǎng)estern blot檢測兩組Foxp3 蛋白水平，其中1表示對照組；2表示慢阻肺組；圖B表示兩組Foxp3 蛋白表達水平比較

四、慢阻肺組與對照組血清細(xì)胞因子水平比較

慢阻肺患者血清IL-10濃度與對照組相比顯著降低 (31.53±9.05vs34.27±11.01,P<0.05)，血清TGF-β濃度與對照組相比顯著降低 (161.26±32.53vs175.38±41.19,P<0.05)。慢阻肺患者血清IL-4、IFN-γ濃度低于對照組，IFN-α濃度高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (表3)。

表3 兩組患者血清細(xì)胞因子水平比較

五、慢阻肺組Foxp3 mRNA和蛋白與肺功能指標(biāo)和血清細(xì)胞因子水平的相關(guān)性

Foxp3 mRNA和蛋白與肺功能指標(biāo)FEV1(%)和FEV1/FVC(%)呈一定的正相關(guān) (P<0.05)，而與FVC(%)和PEF(%)無顯著相關(guān)性 (P>0.05)。Foxp3 mRNA和蛋白與血清細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IFN-α、IFN-γ和TGF-β均呈一定的正相關(guān) (P<0.05)。

表4 慢阻肺組Foxp3 mRNA和蛋白與肺功能指標(biāo)和血清細(xì)胞因子水平的相關(guān)性

討 論

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HAOLu,ZHANGYuan

Departmentof

RespiratoryMedicine,theAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Huhhot,InnerMongolia010050,China

chronic obstructive pulmonary disease; pulmonary function; CD4+Treg; CD25+Treg; serum concentration; Foxp3

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.03.002

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)研究項目(No NJZC14135)

010050 內(nèi)蒙古 呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科

張園，E-mail：zhangyuan160114@163.com

2016-06-14]