游離二氧化硅所致肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中DNA甲基化差異基因的MeDIP-seq檢測(cè)*

侯建永，姚 武，郝長(zhǎng)付

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

游離二氧化硅所致肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中DNA甲基化差異基因的MeDIP-seq檢測(cè)*

侯建永，姚 武，郝長(zhǎng)付#

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

#通信作者，男，1979年10月生，博士，副教授，研究方向：塵肺病的研究與防治，E-mail：haochangfu@163.com

矽肺；DNA甲基化；甲基化DNA免疫共沉淀測(cè)序

目的：檢測(cè)游離二氧化硅所致肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中可能存在的DNA甲基化差異基因并探討其可能作用機(jī)制。方法：原代培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞，建立共培養(yǎng)的矽肺體外模型，采用甲基化DNA免疫共沉淀測(cè)序技術(shù)檢測(cè)分析不同染毒時(shí)間(0、24、48 h)的肺成纖維細(xì)胞之間的DNA甲基化差異基因，并采用DAVID工具對(duì)檢測(cè)到的甲基化差異基因進(jìn)行KEGG的通路富集分析。結(jié)果：共發(fā)現(xiàn)8 791個(gè)基因的DNA甲基化程度在3個(gè)染毒時(shí)間組中均存在差異，DAVID工具分析發(fā)現(xiàn)這些差異主要集中在代謝、環(huán)境信息過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、生物體系統(tǒng)、人類疾病相關(guān)通路等通路中。結(jié)論：矽肺形成過(guò)程中存在大量DNA甲基化程度發(fā)生改變的基因，且這些基因涉及多個(gè)通路。

塵肺病是由于生產(chǎn)過(guò)程中長(zhǎng)期吸入生產(chǎn)性粉塵,粉塵在肺內(nèi)潴留而引起的以肺組織彌漫性纖維化為主的全身性疾病。塵肺病是職業(yè)病中所占比例最高的疾病，一直以來(lái)影響著發(fā)病者的生活質(zhì)量和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1]。矽肺是由于長(zhǎng)期吸入含游離二氧化硅的粉塵引起的職業(yè)性肺疾病，通常表現(xiàn)為持續(xù)的炎癥反應(yīng)、成纖維細(xì)胞增生、過(guò)量的膠原沉積，最終導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化[2]。游離二氧化硅粉塵致肺纖維化作用最強(qiáng)，矽肺也是塵肺病中進(jìn)展最快、死亡率最高的一種。報(bào)道[3-5]顯示目前國(guó)內(nèi)新發(fā)塵肺病種類主要是矽肺和煤工塵肺，以采煤工、掘進(jìn)工為主，其次是煤炭采掘輔助行業(yè)工人。矽肺發(fā)生機(jī)制雖尚不清楚，但是有研究[6]顯示肺成纖維細(xì)胞激活后轉(zhuǎn)分化為活躍的肌成纖維細(xì)胞是纖維化發(fā)生的主要變化；所謂轉(zhuǎn)分化是指一種分化完全的細(xì)胞由于某些因素的作用，丟失其原有的表型特點(diǎn)而轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌愋图?xì)胞的一種特定的生理病理過(guò)程。作者所在的課題組前期研究[7]發(fā)現(xiàn)矽肺中肺成纖維細(xì)胞DNA甲基化程度降低，因此認(rèn)為DNA甲基化改變可能是矽肺發(fā)生發(fā)展的一種調(diào)控方式，但并未進(jìn)行甲基化特異性位點(diǎn)的探索和研究。該研究采用甲基化DNA免疫共沉淀測(cè)序(MeDIP-seq)技術(shù)對(duì)二氧化硅所致肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中可能存在的DNA甲基化差異基因進(jìn)行檢測(cè)，并探討其可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究其表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)No.41003100002516。主要試劑：北京索萊寶有限公司的胎牛血清及高糖培養(yǎng)基，美國(guó)ZYMO Research公司的EZ DNA甲基化試劑盒。主要儀器:Heal Force二氧化碳培養(yǎng)箱、PCR擴(kuò)增儀、Illumina-HiSeq 2000測(cè)序儀。

1.2 共培養(yǎng)模型 使用組織塊法提取SD大鼠的肺成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)至5～8代。采用肺泡灌洗術(shù)獲得SD大鼠的肺泡巨噬細(xì)胞。參照王永星、曾鑫等[7-8]使用的共培養(yǎng)模型對(duì)SD大鼠的肺泡巨噬細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，構(gòu)建矽肺體外模型。用100 mg/L的二氧化硅懸濁液進(jìn)行染毒，分別在染毒后0 h(A1組)、24 h(A2組)、48 h(A3組)收取肺成纖維細(xì)胞備用。

1.3 DNA甲基化檢測(cè) 提取各組細(xì)胞DNA并進(jìn)行片段化。對(duì)片段化DNA進(jìn)行末端修復(fù)后在3’端加“A堿基”，然后連接測(cè)序接頭。用DNA甲基化特異抗體對(duì)連接純化產(chǎn)物進(jìn)行甲基化位點(diǎn)IP富集，IP富集產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用20 g/L的TAE瓊脂糖凝膠145 V電泳105 min，將目標(biāo)區(qū)域的PCR產(chǎn)物切膠純化。用2100 Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip(Agilent公司)判斷PCR產(chǎn)物片段大小是否符合后續(xù)測(cè)序的要求。合格的PCR產(chǎn)物片段用Illumina-HiSeq 2000測(cè)序儀測(cè)序。得出的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)處理后轉(zhuǎn)化成DNA甲基化差異數(shù)據(jù)，并定義甲基化表達(dá)變化倍數(shù)在2倍以上且P<0.05者為DNA甲基化差異基因。

1.4 通路分析 利用DAVID工具對(duì)檢測(cè)到的DNA甲基化差異基因進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 DNA甲基化差異基因總體結(jié)果 經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)的最初期處理和基因組定位后，共得到差異轉(zhuǎn)錄本71 455個(gè)，對(duì)應(yīng)的惟一DNA甲基化差異基因有16 292個(gè)，其中A1與A2組間比較有13 311個(gè)，A2與A3組間比較有13 753個(gè)，A1與A3組間比較有13 417個(gè)，共有8 791個(gè)甲基化差異基因在3個(gè)組中都存在(圖1)。

A1、A2、A3：分別代表A1組、A2組和A3組。圖1 不同組間DNA甲基化差異基因的分析

2.2 DNA甲基化差異基因的KEGG通路分析 將共同表達(dá)的8 791個(gè)DNA甲基化差異基因錄入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，有2 215個(gè)基因匹配到了KEGG的通路中，以P<0.005、Benjamini<0.05為顯著富集的原則[9-10]，共有5大類通路被發(fā)現(xiàn)，其中包括代謝、環(huán)境信息過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、生物體系統(tǒng)、人類疾病相關(guān)通路等通路。代謝通路中，嘌呤代謝集中的基因最多；環(huán)境信息過(guò)程中以MAPK信號(hào)通路集中的基因最多，其次是鈣信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路；細(xì)胞過(guò)程相關(guān)通路中基因主要集中在了黏著斑和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)的通路中；生物體系統(tǒng)中基因主要集中在軸突導(dǎo)向等與神經(jīng)突觸形成有關(guān)的通路中；人類疾病相關(guān)通路中基因大部分集中在與癌癥有關(guān)的通路中。見(jiàn)表1。

表1 DNA甲基化差異基因的KEGG通路分析

3 討論

以往關(guān)于游離二氧化硅所致矽肺的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的甲基化研究多集中于單個(gè)基因的甲基化狀態(tài)或者全基因組甲基化水平整體的檢測(cè)，缺少全基因組中特異性甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)。該研究中作者通過(guò)MeDIP-seq法檢測(cè)游離二氧化硅所致肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的DNA甲基化差異基因并探討其可能的機(jī)制，為尋找可能的干預(yù)位點(diǎn)和機(jī)制研究提供依據(jù)。

該研究應(yīng)用成熟的細(xì)胞共培養(yǎng)模型對(duì)矽肺形成中的DNA甲基化進(jìn)行研究，采用MeDIP-seq技術(shù)檢測(cè)分析不同染毒時(shí)間(0、24、48 h)的肺成纖維細(xì)胞間的DNA甲基化差異基因，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)16 292個(gè)DNA甲基化差異基因，其中有8 791個(gè)基因在3組中都存在，這說(shuō)明矽肺形成的過(guò)程中可能涉及多個(gè)基因甲基化的改變，與研究[11]結(jié)果相同。

為進(jìn)一步了解游離二氧化硅所致矽肺前期變化可能涉及的生物學(xué)過(guò)程和通路，探討在此過(guò)程中可能存在的機(jī)制，作者使用DAVID工具的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)獲得的8 791個(gè)DNA甲基化差異基因進(jìn)行通路分析。KEGG(京都基因與基因組百科全書(shū))是基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括：PATHWAY、GENES/SSDB/KO和COMPOUND/GLYCAN/REACTION數(shù)據(jù)庫(kù)等模塊。PATHWAY數(shù)據(jù)庫(kù)整合當(dāng)前在分子互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)如通路、聯(lián)合體的知識(shí)，GENES/SSDB/KO數(shù)據(jù)庫(kù)提供在基因組計(jì)劃中出現(xiàn)的基因和蛋白質(zhì)的相關(guān)知識(shí)，COMPOUND/GLYCAN/REACTION數(shù)據(jù)庫(kù)提供生化復(fù)合物及反應(yīng)方面的知識(shí)。該研究利用KEGG PATHWAY對(duì)DNA甲基化差異基因進(jìn)行了通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因主要集中在代謝、環(huán)境信息過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、生物體系統(tǒng)、人類疾病相關(guān)通路等5個(gè)大類的通路中。

代謝通路主要集中在嘌呤、肌醇磷酸鹽、脂肪酸和丙酸等的代謝過(guò)程中，以嘌呤代謝中集中的基因最多，這可能與矽肺形成中基因的甲基化和去甲基化活動(dòng)過(guò)程中碳的代謝有關(guān)[12]，細(xì)胞中與碳代謝最相關(guān)的是能量的變化，由此可以推測(cè)矽肺的發(fā)生可能與成纖維細(xì)胞的能量變化有關(guān)。環(huán)境信息過(guò)程主要集中在ECM與受體相互作用、MAPK信號(hào)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、Wnt信號(hào)通路等信號(hào)通路中，這其中包括與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡相關(guān)的多個(gè)重要的信號(hào)通路，比如MAPK、Wnt、ErbB信號(hào)通路等，這些已經(jīng)被證實(shí)在細(xì)胞的增殖和凋亡中有重要作用[13-16]，對(duì)這些通路及其中包含基因的研究可能為解釋矽肺的形成機(jī)制提供思路。鈣信號(hào)通路富集的基因數(shù)量?jī)H次于MAPK通路，這說(shuō)明在此過(guò)程中有大量的鈣離子參與其中，這可能是矽肺形成的多個(gè)學(xué)說(shuō)中“鈣超載”學(xué)說(shuō)的新的證據(jù)。在細(xì)胞過(guò)程通路中，主要的集中項(xiàng)是黏著斑、黏著連接、縫隙連接、緊密連接等與纖維化進(jìn)展相關(guān)的一些過(guò)程，由此可以看出矽肺形成過(guò)程中成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化后纖維化的主要形式是成纖維細(xì)胞與ECM的連接，形成黏著斑造成的。結(jié)果中還出現(xiàn)了軸突導(dǎo)向、長(zhǎng)時(shí)程抑制、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)等與神經(jīng)突觸形成相關(guān)的富集項(xiàng)，這說(shuō)明成纖維細(xì)胞在轉(zhuǎn)分化中發(fā)生了與突觸形成相同的變化。最后的通路富集分類是人類疾病相關(guān)通路，大多數(shù)通路都是與癌癥有關(guān)的通路，如結(jié)腸直腸癌、急性髓性白血病、胰腺癌、腎細(xì)胞癌、慢性髓性白血病和前列腺癌等通路，表明了矽肺的纖維化進(jìn)展過(guò)程跟癌癥的形成有相似的特點(diǎn)，比如細(xì)胞的過(guò)量增殖等，并且跟癌癥有著某些通路的重疊，這說(shuō)明矽肺前期有著癌癥一樣的生理及病理特征，如炎癥等的存在[17]，對(duì)矽肺發(fā)生發(fā)展過(guò)程的研究也可能對(duì)癌癥的發(fā)生發(fā)展起一定的提示作用。此次實(shí)驗(yàn)未對(duì)所得到的可能通路和基因進(jìn)行繼續(xù)深入研究以確定具體變化，下一步將對(duì)所得的通路和基因等進(jìn)行功能和機(jī)制方面的深入研究。

綜上所述，矽肺形成過(guò)程中存在大量DNA甲基化程度發(fā)生改變的基因，這些基因涉及多個(gè)通路，比如MAPK和Wnt等通路，可能在矽肺的形成中起到重要作用，值得進(jìn)一步深入研究。

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(2016-03-23收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Detection of different DNA methylated genes in transdifferentiation of lung fibroblasts caused by free SiO2using MeDIP-seq

HOUJianyong,YAOWu,HAOChangfu

DepartmentofOccupationalHealth，CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

silicosis；DNA methylation；MeDIP-seq

Aim：To examine the different DNA methylated genes and possible mechanism in the transdifferentiation of lung fibroblasts caused by free SiO2. Methods: The primary macrophages and fibroblasts of SD rats were cultured, and then co-cultured. DNA methylation in fibroblasts with different infected time(0,24,48 h) was detected by MeDIP-seq. Results: A total of 8 791 different DNA methylated genes were discovered in all the three groups, and a further more analysis about those genes in KEGG pathway was performed by DAVID. The different DNA methylated genes were found enriched in metabolism, environmental information processing, cellular processes, organismal systems, human diseases pathway,etc. Conclusion: A large number of different DNA methylated genes and pathways exist in the pathogenesis of silicosis, which is valuable for further study.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.002

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 81102109，81472954

R135.2